CN106497912A - 一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法，涉及生物工程领域。以热带假丝酵母菌种为原料，接种于基础培养基进行菌种活化，测定其生长曲线，然后将活化后热带假丝酵母菌液接种于种子培养基中扩大培养，将扩大培养液在一定条件下进行适度的脉冲扫频超声波处理，再将处理后的扩大培养液在适宜条件下继续培养得到热带假丝酵母菌种培养液产品。该方法可以促进热带假丝酵母增殖、大幅提高活菌量，从而显著降低发酵生产的种子液成本，有着巨大的经济效益和社会效益，具有良好的应用前景。

Description

一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，具体涉及工业发酵的微生物种子液培养技术，特指以低强度脉冲扫频超声波辐射处理对数生长中期的热带假丝酵母、从而大幅度提高生长细胞数量的技术方法。

背景技术：

热带假丝酵母（Candida tropicalis）可高效利用农副产品废弃物中各种糖类物质，转化为蛋白质或者多肽类物质，因此被广泛应用于发酵饲料、发酵食品等固态发酵生产中。近年来，传统的微生物固态发酵技术引起人们普遍关注，这种方法成本低、节水、节能、排放少，符合当前食品产业绿色、节能、高效的发展方向。但是在发酵工业生产过程中普遍存在种子液接种量大，导致生产成本高的问题。通常情况下液态发酵需要接种发酵醪体积2%~5%的种子液，固态发酵接种量更高，一般为发酵基质质量的5%~10%、甚至15%以上，可见种子液成本在发酵总成本中居高不下。

目前国内外主要是通过优化发酵工艺条件以降低成本，工艺条件的优化只能在有限的范围内使产量提高，因而这些方法并未从根本上解决热带假丝酵母种子液接种量大的问题，不能大幅度减少接种量的投入从而降低成本。近年来，人们发现外界超声场加载于微生物培养液时可刺激微生物菌种生长，因此通过筛选超声作用条件可提高菌种生长数量，从而可节约接种成本。但是由于同一种微生物在生长繁殖过程中其结构也会存在微小的差异，因此使用固定频率超声波难以对所有微生物细胞进行有效刺激。扫频模式超声波辐射时可围绕中心频率在一定频率范围内进行周期性扫频变化，可对细胞具有微小差异进行共振，从而获得更好的处理效果。

由此可见，通过采用适度扫频超声辅助辐射处理促进微生物菌种培养，有望显著降低固态发酵菌种的成本、提高生产效率，将具有巨大的经济效益和社会效益。

发明内容：

本发明的目的是提供一种利用低强度脉冲扫频超声波处理对数生长中期热带假丝酵母促进其增殖的方法，该方法可提高培养液菌种密度，降低发酵菌种生产成本、提高发酵效率。

本发明的技术方案：一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法，按照下述步骤进行：以热带假丝酵母（Candida tropicalis）为出发菌种，（1）配制基础培养基、种子培养基和平板计数培养基；（2）将热带假丝酵母接种于基础培养基进行菌种活化，测定其生长曲线；（3）将活化后热带假丝酵母菌液接种于种子培养基中扩大培养，将扩大培养液在一定条件下进行适度的脉冲扫频超声波处理，再将处理后的扩大培养液在适宜条件下继续培养得到热带假丝酵母菌种培养液产品。

所述基础培养基的成分及配制方法为：麦芽汁培养基。称取市售麦芽汁培养基130.1 g，加入1 L蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，115℃高压灭菌15 min，备用。

所述种子培养基的成分及配制方法为：酵母膏胨葡萄糖（YPD）培养基（1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖）。溶解10 g酵母提取物，20 g胰蛋白胨于900 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌20 min。溶解20 g葡萄糖于100 mL蒸馏水中，115℃高压灭菌15 min后加入，备用。

所述平板计数培养基的成分及配制方法为：孟加拉红培养基。称取市售孟加拉红培养基31.6 g，加入1 L蒸馏水，121℃高压灭菌20 min，备用。

所述热带假丝酵母活化步骤及条件为：将购买的热带假丝酵母冻干菌种按照中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）对该菌种活化要求进行打管复活，于麦芽汁培养基在28℃的生化培养箱中静止培养2天并转接3代。

所述热带假丝酵母生长曲线的测定方法为：取2环菌体至100 mL YPD培养基，在摇床中培养24 h。将上述培养好的菌液按照10%的比例接入另外16瓶装有50 mL YPD培养基的锥形瓶中，并标号1-16，28℃、160 r/min振荡培养，前4 h每隔1 h取出一瓶培养液，之后每隔2 h取出一瓶培养液，并取出1 mL菌液，加入9 mL蒸馏水进行稀释，以YPD培养基为空白，620 nm下比浊。以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制生长曲线。

所述热带假丝酵母扩大培养步骤及条件为：挑取1环活化培养后的菌体接入100mL灭过菌的装有YPD培养基的锥形瓶中，放在摇床中进行扩大培养，温度为28℃，转速160r/min。

所述热带假丝酵母扩大培养过程脉冲扫频超声波处理方法及条件为：根据生长曲线的测定结果，在扩大培养液中的热带假丝酵母生长的对数中期（约培养10~12h）进行超声波处理，超声处理条件为采用频率为15~100 kHz超声波处理，扫频范围±0.5~±2kHz，超声波功率密度20~150 W/L培养液，处理温度20~40℃，处理时间为0.5~2.5h，超声波脉冲发声条件为连续超声100~300 s、间歇5~20s。

所述超声处理后的扩大培养液的继续培养方法及条件为：将脉冲扫频超声处理和未处理的样品瓶均放入28℃摇床培养至24 h，对其菌体生物量进行计数。

通过对比试验（种子液培养不施加超声，其他条件相同），经检测，本发明采用脉冲扫频超声的热带假丝酵母菌，在同等条件下与无超声处理相比，种子液中活菌数提高45.7~148.5%，显著提高了种子液的菌种数量。

利用本发明所得到的热带假丝酵母超声波促进增殖技术可用于各类发酵生产的种子液培养。

与热带假丝酵母传统种子液发酵工艺相比，本发明如下特点和有益效果：

1、本发明采用脉冲扫频超声波技术，可促进增殖大幅提高活菌量；

2、利用该技术进行发酵生产，可显著降低成本，有着巨大的经济效益和社会效益，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明使用的脉冲扫频超声处理装置的示意图。其中1.加热管 2.控制面板3. 超声波换能器 4.样品 5.水 6.电脑 7.超声波发生器。

图2是本发明中采用脉冲扫频超声处理不同生长时期对菌体生物量增加量的影响。其中在热带假丝酵母对数生长中期处理的增殖效果最好。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

本发明使用脉冲扫频超声处理装置是由反应池（图1左）和控制系统（图1右）组成。本发明使用脉冲多频扫描超声设备将电脑、控制器、超声波发生器相连接，接通电源后，在电脑控制系统界面上设置好超声波频率、扫频范围、脉冲工作/间歇周期、超声作用时间、功率等参数，执行下达命令后指定超声波发生器开始工作，将电流转换成与超声波换能器相匹配的高频交流电信号，从而驱使反应池中超声板产生振动，并以超音频纵波的形式在反应池液体中辐射。

实施例1

将从中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）购买的热带假丝酵母（Candida tropicalis，CICC编号：1254）冻干菌种按照CICC要求进行打管复活，于麦芽汁培养基在28℃的生化培养箱中静止培养2天并转接3代。测定活化的热带假丝酵母的生长曲线，生长曲线的测定方法为：取2环菌体至100 mL YPD培养基，在摇床中培养24 h。将上述培养好的菌液按照10%的比例接入另外16瓶装有50 mL YPD培养基的锥形瓶中，并标号1-16，28℃、160r/min振荡培养，前4 h每隔1 h取出一瓶培养液，之后每隔2 h取出一瓶培养液，并取出1 mL菌液，加入9 mL蒸馏水进行稀释，以YPD培养基为空白，620 nm下比浊。以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制生长曲线。

挑取1环活化培养后的菌体接入100 mL灭过菌的装有YPD培养基的锥形瓶中，放在摇床中进行扩大培养，温度为28℃，转速160 r/min。

根据生长曲线的测定结果，在扩大培养液中的热带假丝酵母生长的对数中期（培养10h）进行超声波处理。超声处理装置示意图如附图1所示，处理步骤为：将超声波换能器（附图1中部件3）放到处理槽内，加入新鲜自来水（附图1中部件5），通过调节控制面板（附图1中部件2）温度控制开关将槽中水温调节到设定温度；选择所需要使用的超声波频率，打开超声波发生器（附图1中部件7），通过控制电脑（附图1中部件6）设定超声波输出功率、扫频范围、脉冲工作/间歇时间等。在本实施例中超声波处理的主要条件为采用频率为15 kHz超声波处理，扫频范围±2kHz，超声波功率密度150 W/L培养液，处理温度20℃，处理时间为0.5h，超声波脉冲发声条件为连续超声100 s、间歇5s，以未进行超声处理的菌液为空白。

将脉冲扫频超声处理和未处理的样品瓶均放入28℃摇床培养至24 h，对其菌体生物量进行计数。经检测，采用本实施例脉冲扫频超声条件处理的热带假丝酵母菌，在同等培养条件下与无超声处理相比，种子液中活菌数提高45.7%，显著提高了种子液的菌种数量。

实施例2

将从中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）购买的热带假丝酵母（Candida tropicalis，CICC编号：1254）冻干菌种按照CICC要求进行打管复活，于麦芽汁培养基在28℃的生化培养箱中静止培养2天并转接3代。按照实施例1中描述的方法和步骤测定活化的热带假丝酵母的生长曲线。

挑取1环活化培养后的菌体接入100 mL灭过菌的装有YPD培养基的锥形瓶中，放在摇床中进行扩大培养，温度为28℃，转速160 r/min。

根据生长曲线的测定结果，在扩大培养液中的热带假丝酵母生长的对数中期（培养12h）按照实施例1中描述的步骤进行超声波处理。主要条件为采用频率为28 kHz超声波处理，扫频范围±0.5kHz，超声波功率密度20 W/L培养液，处理温度30℃，处理时间为2h，超声波脉冲发声条件为连续超声300 s、间歇20s，以未进行超声处理的菌液为空白。

将脉冲扫频超声处理和未处理的样品瓶均放入28℃摇床培养至24 h，对其菌体生物量进行计数。经检测，采用本实施例脉冲扫频超声条件处理的热带假丝酵母菌，在同等培养条件下与无超声处理相比，种子液中活菌数提高148.5%，显著提高了种子液的菌种数量。

实施例3

将从中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）购买的热带假丝酵母（Candida tropicalis，CICC编号：1254）冻干菌种按照CICC要求进行打管复活，于麦芽汁培养基在28℃的生化培养箱中静止培养2天并转接3代。按照实施例1中描述的方法和步骤测定活化的热带假丝酵母的生长曲线。

挑取1环活化培养后的菌体接入100 mL灭过菌的装有YPD培养基的锥形瓶中，放在摇床中进行扩大培养，温度为28℃，转速160 r/min。

根据生长曲线的测定结果，在扩大培养液中的热带假丝酵母生长的对数中期（培养11h）按照实施例1中描述的步骤进行超声波处理。主要条件为采用频率为33kHz超声波处理，扫频范围±1.2kHz，超声波功率密度120W/L培养液，处理温度30℃，处理时间为1h，超声波脉冲发声条件为连续超声150 s、间歇10s，以未进行超声处理的菌液为空白。

将脉冲扫频超声处理和未处理的样品瓶均放入28℃摇床培养至24 h，对其菌体生物量进行计数。经检测，采用本实施例脉冲扫频超声条件处理的热带假丝酵母菌，在同等培养条件下与无超声处理相比，种子液中活菌数提高94.7%，显著提高了种子液的菌种数量。

实施例4

将从中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）购买的热带假丝酵母（Candida tropicalis，CICC编号：1254）冻干菌种按照CICC要求进行打管复活，于麦芽汁培养基在28℃的生化培养箱中静止培养2天并转接3代。按照实施例1中描述的方法和步骤测定活化的热带假丝酵母的生长曲线。

挑取1环活化培养后的菌体接入100 mL灭过菌的装有YPD培养基的锥形瓶中，放在摇床中进行扩大培养，温度为28℃，转速160 r/min。

根据生长曲线的测定结果，在扩大培养液中的热带假丝酵母生长的对数中期（培养11h）按照实施例1中描述的步骤进行超声波处理。主要条件为采用频率为68 kHz超声波处理，扫频范围±1.5kHz，超声波功率密度40W/L培养液，处理温度40℃，处理时间为2.5h，超声波脉冲发声条件为连续超声200 s、间歇10s，以未进行超声处理的菌液为空白。

将脉冲扫频超声处理和未处理的样品瓶均放入28℃摇床培养至24 h，对其菌体生物量进行计数。经检测，采用本实施例脉冲扫频超声条件处理的热带假丝酵母菌，在同等培养条件下与无超声处理相比，种子液中活菌数提高128.9%，显著提高了种子液的菌种数量。

实施例5

将从中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）购买的热带假丝酵母（Candida tropicalis，CICC编号：1254）冻干菌种按照CICC要求进行打管复活，于麦芽汁培养基在28℃的生化培养箱中静止培养2天并转接3代。按照实施例1中描述的方法和步骤测定活化的热带假丝酵母的生长曲线。

挑取1环活化培养后的菌体接入100 mL灭过菌的装有YPD培养基的锥形瓶中，放在摇床中进行扩大培养，温度为28℃，转速160 r/min。

根据生长曲线的测定结果，在扩大培养液中的热带假丝酵母生长的对数中期（培养11h）按照实施例1中描述的步骤进行超声波处理。主要条件为采用频率为100kHz超声波处理，扫频范围±1.0kHz，超声波功率密度80W/L培养液，处理温度25℃，处理时间为1.5h，超声波脉冲发声条件为连续超声200 s、间歇15s，以未进行超声处理的菌液为空白。

将脉冲扫频超声处理和未处理的样品瓶均放入28℃摇床培养至24 h，对其菌体生物量进行计数。经检测，采用本实施例脉冲扫频超声条件处理的热带假丝酵母菌，在同等培养条件下与无超声处理相比，种子液中活菌数提高109.2%，显著提高了种子液的菌种数量。

本发明针对脉冲扫频超声波处理引起的热带假丝酵母增殖现象，利用转录组测序技术从微观水平上解析细胞在应对外界环境刺激时的基因表达变化，以揭示超声促进酵母增殖的机理。按照上述实施例2的技术方案分别制备了超声及不超声的热带假丝酵母菌液样品各3个，委托上海欧易生物医学科技有限公司进行了转录组测序，对测定结果的分析表明，超声促增殖效应的关键基因是CTRG-01717（phosphatidylinositol 3-kinase TOR2），其基因表达上调14.4倍。在GO（基因本体）富集分析和KEGG（京都基因与基因组百科全书）富集分析结果表明，TOR2属于GO分子功能top20中Protein serine/threonine kinase activity（蛋白质的丝氨酸/苏氨酸激酶活性）和KEGG pathway top20中PI3K-Akt signalingpathway（磷脂酰激醇-3-羟激酶信号通路），AMPK signaling pathway（蛋白激酶信号通路）的基因。上述结果从生物学角度解释了脉冲扫频超声波处理使热带假丝酵母产生明显的增殖效应的机制。

Claims (9)

1.一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法，其特征在于，按照下述步骤进行：以热带假丝酵母（Candida tropicalis）为出发菌种，（1）配制基础培养基、种子培养基和平板计数培养基；（2）将热带假丝酵母接种于基础培养基进行菌种活化，测定其生长曲线；（3）将活化后热带假丝酵母菌液接种于种子培养基中扩大培养，将扩大培养液在一定条件下进行适度的脉冲扫频超声波处理，再将处理后的扩大培养液在适宜条件下继续培养得到热带假丝酵母菌种培养液产品。

2.根据权利要求1所述的一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法，其特征在于所述基础培养基的成分及配制方法为：麦芽汁培养基；称取市售麦芽汁培养基130.1 g，加入1 L蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，115℃高压灭菌15 min，备用。

3.根据权利要求1所述的一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法，其特征在于所述种子培养基的成分及配制方法为：酵母膏胨葡萄糖（YPD）培养基（1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖）；

溶解10 g酵母提取物，20 g胰蛋白胨于900 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌20 min；

溶解20 g葡萄糖于100 mL蒸馏水中，115℃高压灭菌15 min后加入，备用。

4.根据权利要求1所述的一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法，其特征在于所述平板计数培养基的成分及配制方法为：孟加拉红培养基；

称取市售孟加拉红培养基31.6 g，加入1 L蒸馏水，121℃高压灭菌20 min，备用。

5.根据权利要求1所述的一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法，其特征在于所述热带假丝酵母活化步骤及条件为：将购买的热带假丝酵母冻干菌种按照中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）对该菌种活化要求进行打管复活，于麦芽汁培养基在28℃的生化培养箱中静止培养2天并转接3代。

6.根据权利要求1所述的一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法，其特征在于所述热带假丝酵母生长曲线的测定方法为：取2环菌体至100 mL YPD培养基，在摇床中培养24 h；

将上述培养好的菌液按照10%的比例接入另外16瓶装有50 mL YPD培养基的锥形瓶中，并标号1-16，28℃、160 r/min振荡培养，前4 h每隔1 h取出一瓶培养液，之后每隔2 h取出一瓶培养液，并取出1 mL菌液，加入9 mL蒸馏水进行稀释，以YPD培养基为空白，620 nm下比浊；以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制生长曲线。

7.根据权利要求1所述的一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法，其特征在于所述热带假丝酵母扩大培养步骤及条件为：挑取1环活化培养后的菌体接入100mL灭过菌的装有YPD培养基的锥形瓶中，放在摇床中进行扩大培养，温度为28℃，转速160r/min。

8.根据权利要求1所述的一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法，其特征在于所述热带假丝酵母扩大培养过程脉冲扫频超声波处理方法及条件为：根据生长曲线的测定结果，在扩大培养液中的热带假丝酵母生长的对数中期（约培养10~12h）进行超声波处理，超声处理条件为采用频率为15~100 kHz超声波处理，扫频范围±0.5~±2kHz，超声波功率密度20~150 W/L培养液，处理温度20~40℃，处理时间为0.5~2.5h，超声波脉冲发声条件为连续超声100~300 s、间歇5~20s。

9.根据权利要求1所述的一种扫频超声处理对数中期热带假丝酵母促进增殖的方法，其特征在于所述超声处理后的扩大培养液的继续培养方法及条件为：将脉冲扫频超声处理和未处理的样品瓶均放入28℃摇床培养至24 h，对其菌体生物量进行计数。