CN106480194B - 一种功能化dna纳米材料的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到纳米材料的合成，具体为一种功能化DNA纳米材料的构建方法。以信号探针和发卡状DNA片段在体系反应缓冲溶液中于25‑50℃、反应60‑120分钟，即获得针对发卡状DNA片段的功能化DNA纳米材料。本发明的制备方法简单易操作，可以实现绿色、无污染的纳米材料的构建，在分子生物学、生物分析化学以及材料科学等研究领域有潜在的应用价值。

Description

一种功能化DNA纳米材料的构建方法
技术领域
本发明涉及到纳米材料的合成，具体为一种功能化DNA纳米材料的构建方法。
背景技术
DNA纳米技术是近年来新兴的前言交叉领域，充分利用了DNA分子卓越的自组装和识别能力实现精确的从底向上的纳米构筑，目前，研究者已可以将DNA自组装成千姿百态的DNA纳米结构，而这些DNA纳米结构的潜在用途也受到各个领域的广泛关注[1-4]。
加州理工学院的Rothemund博士[5]于2006年发展出了DNA折纸术(DNA origami)技术(Nature 2006)，被誉为DNA纳米技术领域的一个重要里程碑。利用DNA折纸术在理论上可以用DNA分子设计任意形状的图形和三维结构，并已在构筑DNA分子计算机、DNA分子机器、生物传感器和生物芯片等方向发挥了重要作用。另外，由美国亚利桑那州立大学的颜颢教授[6]首先提出在对称的DNA方块上进行RNA的杂交检测(Science 2008)，从而实现了DNA纳米技术向生物领域的回归。最近，中科院上海应用物理所物理生物学实验室和美国亚利桑那州立大学的研究人员[7]合作发展了一种基于DNA纳米技术的三维DNA纳米结构探针，并在此基础上构建了一类新型的生物传感平台，实现了对基因和蛋白质高性能检测。
另外，对DNA纳米结构进行功能化修饰可实现其在多领域的应用。例如，传统的DNA探针常用一维(单链DNA)或二维结构(如发夹结构)DNA作为识别元件，其传感界面的均一性在制备过程中难以得到有效控制，从而影响了实际应用中检测的稳定性和重复性。而三维DNA纳米探针具有高结构稳定性和刚性，可以有效提高DNA探针在表面分布排列的均一性，同时提高光学信号识别位点，从而显著提高了生物检测的灵敏度和特异性。
[1]J.B.Lee，Y.H.Roh，S.H.Um；Multifunctional nanoarchitectures from DNA-based ABC monomers[J].Nature nanotechnologoy,2009,4：430-436.
[2]P.K.Lo，K.L.Metera，H.F.Sleiman，Self-assembly of three-dimensionalDNA nanostructures and potential biological applications[J].Current Opinionin Chemical Biology.2010,14：597-607.
[3]J.B.Lee，M.J.Campolongo，J.S.Kahn,DNA-based nanostructures formolecular sensing[J].Nanoscale.2010,2：188-198.
[4]G.Z.Zhu,R.Hu,Z.L.Zhao,Noncanonical Self-Assembly ofMultifunctional DNA Nanoflowers for Biomedical Applications[J].J.Am.Chem.Soc.2013,135:16438-16445.
[5]Paul W.K.Rothemund.Folding DNA to create nanoscale shapes andpatterns[J].Nature.2006,440:297-302.
[6]Y.G.Ke,S.Lindsay,H.Yan,Self-Assembled Water-Soluble Nucleic AcidProbe Tiles for Label-Free RNA Hybridization Assays[J].Science.2008,319:180-183.
[7]H.Pei,N.Lu,Y.L.Wen,A DNA Nanostructure-based Biomolecular ProbeCarrier Platform for Electrochemical Biosensing[J].Adv.Mater.2010,22:4754-4758.
发明内容
本发明目的在于提供一种功能化DNA纳米材料的构建方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种功能化DNA纳米材料的构建方法，以信号探针和发卡状DNA片段在体系反应缓冲溶液中于25-50℃、反应60-120分钟，即获得针对发卡状DNA片段的功能化DNA纳米材料。
所述信号探针为单链结构、长度为20-60bp；
所述三条探针MB1、MB2、MB3为回折形成二级结构的DNA长链，其中，配对碱基间的双链区形成“茎”，而不能配对的单链区部分则突出形成“环”,三条DNA链的长度依次为30-50bp、40-60bp、30-60bp。
所述体系反应缓冲溶液组成为10-20mM Tris-HCl,5-10mM MgCl2,pH 7.0-8.0。
所述信号探针及三条发卡探针MB1、MB2、MB3按照A-T、G-C的互补方式配对杂交，其中，信号探针可将发卡探针MB1环状结构打开，并形成互补双链及单链结构，而发卡探针MB1的单链结构又可将发卡探针MB2打开，并形成互补双链及单链结构，所获得的单链结构又可将发卡探针MB3环状结构打开，发卡探针MB3打开后裸露的单链结构与信号探针具有相同的序列。
所述信号探针及三条发卡探针MB1、MB2、MB3的浓度均为1×10-7M-5×10-7M。
所述信号探针及三条发卡探针MB1、MB2、MB3的摩尔用量比例为1:10-20:10-20:10-20。
所述
信号探针的序列为：ATC ATC AGC CGA GAG CTT GAT TAG TTA GCC GTG CCT TTCT；
发卡探针MB1的序列为：CGA GAG GGG TAG GGC GGG TT GGG CCC CTC TCG GCTGAT GAT；
发卡探针MB2的序列为：GGG TAG GGC ATC ATC TAA AAA GCC CTA CCC CTC TCG；
发卡探针MB3的序列为：GGC ATC ATC AGC CGA GAG CTT GAT GAT GAT GCC CTACCC。
本发明所具有的优点：
本发明利用DNA独特的理化特性构建出新型纳米结构，与其它纳米材料相比，此DNA纳米材料合成步骤简单、反应条件温和可控、性能稳定。除此之外，基于此DNA纳米材料表面信号基团的多维性，结合光学信号识别位点，为新型多维信号探针的构建提供了新思路。
附图说明
图1为本发明实施例提供的DNA纳米材料的构建方法的合成路线。
图2为本发明实施例提供的三条发卡探针MB1、MB2、MB3的结构示意图。
图3为本发明实施例提供的DNA纳米材料的构建方法中各试剂的比例用量优化图。
图4为本发明实施例提供的DNA纳米材料的稳定性表征示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
功能化DNA纳米材料的构建方法为：
以信号探针和发卡状DNA片段在体系反应缓冲溶液中于25-50℃、反应60-120分钟，即获得针对发卡状DNA片段的功能化DNA纳米材料(参见图1)。其中，体系反应缓冲溶液组成为10-20mM Tris-HCl,5-10mM MgCl2,pH 7.0-8.0。
所述信号探针为单链结构、长度为20-60bp；
所述三条探针MB1、MB2、MB3为回折形成二级结构的DNA长链，其中，配对碱基间的双链区形成“茎”，而不能配对的单链区部分则突出形成“环”。三条DNA链的长度依次为30-50bp、40-60bp、30-60bp。上述信号探针及三条发卡探针MB1、MB2、MB3按照A-T、G-C的互补方式配对杂交，其中，信号探针可将发卡探针MB1环状结构打开，并形成互补双链及单链结构，而发卡探针MB1的单链结构又可将发卡探针MB2打开，并形成互补双链及单链结构，所获得的单链结构又可将发卡探针MB3环状结构打开，发卡探针MB3打开后裸露的单链结构与信号探针具有相同的序列。
所述信号探针及三条发卡探针MB1、MB2、MB3的浓度均为1×10-7M-5×10-7M。
实施例2
根据上述实施例1的方法，分别设计信号探针及三条发卡探针MB1、MB2、MB3，具体序列为：
信号探针的序列为：ATC ATC AGC CGA GAG CTT GAT TAG TTA GCC GTG CCT TTCT；
发卡探针MB1的序列为：CGA GAG GGG TAG GGC GGG TT GGG CCC CTC TCG GCTGAT GAT；
发卡探针MB2的序列为：GGG TAG GGC ATC ATC TAA AAA GCC CTA CCC CTC TCG；
发卡探针MB3的序列为：GGC ATC ATC AGC CGA GAG CTT GAT GAT GAT GCC CTACCC。
将上述三条DNA发卡探针MB1(1.0×10-7M),MB2(1.0×10-7M)以及MB3(1.0×10-7M)放置于水浴锅中90℃加热10分钟后冷却至室温。
分别取上述处理好的发卡探针MB1 2mL,发卡探针MB2 2mL以及发卡探针MB3 2mL,并加入100μL信号探针(1.0×10-7M)，混合于体系反应缓冲溶液中在25℃恒温条件下反应60分钟。最终得到的溶液于4℃阴暗处储存备用。整个合成过程如图1所示。
其中，体系反应缓冲溶液组成为20mM Tris-HCl,5mM MgCl2,pH 8.0。
实施例3
取100μL 1×10-7M的荧光粒子(6-FAM)修饰的信号探针与不同浓度的2mL荧光粒子修饰的发卡探针MB1、MB2以及M3(5×10-7M,1×10-6M,1.5×10-6M,2×10-6M,2.5×10-6M,3×10-6M)结合，混合于体系反应缓冲溶液中在25℃恒温条件下反应60分钟。最终得到的溶液进行荧光信号检测。检测结果如图3所示。随着发卡探针用量的增加，系统的荧光强度逐渐增强，当发卡探针的浓度为2×10-6M时，系统的荧光信号强度可达最高，因此，在DNA-纳米生物条码的合成中，信号探针与发卡探针的用量依次为：100μL信号探针(1.0×10-7M)，三条DNA发卡探针MB1(1.0×10-7M),MB2(1.0×10-7M)以及MB3(1.0×10-7M)用量为2mL。
实施例4
根据实施例2中的方法，将上述实施例3中反应最终得到的溶液分别在1小时、3小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、21小时及24小时进行荧光信号检测。检测结果如图4所示。由此可得，此实验方案具有可行性。而结合信号探针的磁性微球荧光信号强度24小时内可保持在83％以上。
Figure IDA0001135521620000011
Figure IDA0001135521620000021
Figure IDA0001135521620000031

Claims (4)

1.一种功能化DNA纳米材料的构建方法，其特征在于：以信号探针和发卡状DNA片段在体系反应缓冲溶液中于25-50℃、反应60-120分钟，即获得针对发卡状DNA片段的功能化DNA纳米材料；
三条发卡探针MB1、MB2、MB3为回折形成二级结构的DNA长链，其中，配对碱基间的双链区形成“茎”，而不能配对的单链区部分则突出形成“环”；
所述信号探针及三条发卡探针MB1、MB2、MB3按照A-T、G-C的互补方式配对杂交，其中，信号探针可将发卡探针MB1环状结构打开，并形成互补双链及单链结构，而发卡探针MB1的单链结构又可将发卡探针MB2打开，并形成互补双链及单链结构，所获得的单链结构又可将发卡探针MB3环状结构打开，发卡探针MB3打开后裸露的单链结构与信号探针具有相同的序列；
所述信号探针的序列为：ATC ATC AGC CGA GAG CTT GAT TAG TTA GCC GTG CCT TTCT；
发卡探针MB1 的序列为：CGA GAG GGG TAG GGC GGG TT GGG CCC CTC TCG GCT GATGAT；
发卡探针MB2的序列为：GGG TAG GGC ATC ATC TAA AAA GCC CTA CCC CTC TCG；
发卡探针MB3的序列为：GGC ATC ATC AGC CGA GAG CTT GAT GAT GAT GCC CTA CCC。
2.按权利要求1所述的功能化DNA纳米材料的构建方法，其特征在于：所述体系反应缓冲溶液组成为10-20 mM Tris-HCl, 5-10 mM MgCl2, pH 7.0-8.0。
3.按权利要求1所述的功能化DNA纳米材料的构建方法，其特征在于：所述信号探针及三条发卡探针MB1、MB2、MB3的浓度均为1×10-7 M - 5×10-7 M。
4.按权利要求1所述的功能化DNA纳米材料的构建方法，其特征在于：所述信号探针及三条发卡探针MB1、MB2、MB3的摩尔用量比例为1:10-20: 10-20: 10-20。
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