CN106461684B - 用于识别至少一种转铁蛋白糖型的分析方法 - Google Patents

用于识别至少一种转铁蛋白糖型的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于识别至少一种转铁蛋白糖型和/或同种型和/或唾液型的分析方法，尤其通过与镧系元素3+离子源蛋白质功能化识别可能存在于复杂生物基质中的称为缺糖转铁蛋白。因此，通过荧光检测使用分析技术(例如为HPLC或CE)分离和检测获得的被标记的糖型。

Description

用于识别至少一种转铁蛋白糖型的分析方法
具体描述
本发明一般涉及用于识别至少一种转铁蛋白糖型和/或同种型的分析方法，尤其涉及通过将复杂生物基质与镧系元素3+离子源接触(功能化(functionalisation))识别可能存在于复杂生物基质中的缺糖转铁蛋白(CDT)。形成的糖型-镧系元素离子加合物可通过已知分析技术(优选为通过荧光检测)识别。
背景技术
转铁蛋白为人体组织内具有输送铁的功能的糖蛋白。其结构具有两个均能够结合Fe3+离子的C-端结构域和N-端结构域。因此，每个转铁蛋白分子能够结合两个铁离子，通常根据pH值用阴离子(协同阴离子，通常为碳酸盐)平衡电荷。在临床健康(正常)的人中，人血清中的铁饱和度约为30％，这意味着蛋白质仍具有一定百分比的自由位点，潜在地能与3+离子相互作用。
各同种型的转铁蛋白特征是氨基酸和糖基化序列以及唾液基团的高微观不均一性。特别是，转铁蛋白分子在其结构中包括糖链，每个糖链通常以唾液酸残基结束。理论上，可能有具有从0至8个唾液酸残基的转铁蛋白(具有包括在5.1和5.9之间的等电点(pI))。然而，人血清中的主要糖型/唾液型(65-80％)是四唾液酸转铁蛋白，即具有四条糖链，因此具有四个唾液酸残基且pI为5.4(一般参考例如Schellenberg et al.,Clin Chem Lab Med2013,51(5),991-996)。
暴露糖质链和唾液酸链不足的转铁蛋白糖型可用作诊断标志物。所述糖型(通常指CDT)定义为：分别包含0、1、2个唾液酸残基的去唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白和二唾液酸转铁蛋白。此外，这些糖型特征是pI值包括在5.7和5.9之间。
在归因于蛋白质糖基化缺陷的先天神经失调疾病(CDGS-糖基缺乏糖基化综合症)中观察到所述型的改变。甚至在妊娠期观察到缺糖转铁蛋白的少量增加。当诊断酒精滥用时，使用这些糖型中的一些作为生化标志物是众所周知的。特别是，酒精滥用中的二唾液酸的增加归因于糖基化缺陷以及血浆和膜的去唾液酸过程(desialization processes)的增加，这将导致转铁蛋白部分去唾液酸(例如参见van Eijk et al.Clin Chim Acta,132,(1983),167-171)。
因此，在此具体定义的用于定性/定量测定转铁蛋白糖型(特别是CDT同种型)的量的分析方法在临床上及毒理诊断领域发展并优化。
US4626355和WO95/04932描述了用于通过在受控pH值条件下在离子交换固相上分离分析分离一些CDTs的方法，以将一些糖型保持在柱中，允许洗脱去唾液酸、单唾液酸和双唾液酸型。
US5432059公开了一种在适当的试剂和酶存在下通过用荧光糖蛋白再糖基化蛋白质检测CDT糖型的方法。
此外，包括将能够有选择地结合至CDT的抗体用作生物标志物，因此允许对其进一步分析的CDT检测方法是已知的。
EP1378521描述了一种方法，包括在水相环境中使用能够结合至CDT的抗体，其特征是能够避免使用固相，因为其通常发生这种变形(例如可参见GB9827411)。
因此，需要找到易于应用的方法，其可适用于不同类型的复杂生物基质，且足够灵敏以允许检测甚至是转铁蛋白糖型(特别涉及缺糖转铁蛋白，尤其是二唾液酸转铁蛋白)的量的微小变化。
目前，申请人已发现能够用镧系元素3+离子标记可能出现在复杂生物基质中的转铁蛋白，因而获得可以其糖型被分离并使用本领域已知的分析技术检测的功能化的蛋白质(转铁蛋白-镧系元素3+离子加合物)。本方法除允许识别并测量各种转铁蛋白糖型(包括CDT)之外，还允许获得从数量和质量角度的高灵敏度，提供患者的临床状态的主要适应症，还包括可能的酒精滥用。
发明内容
本发明的第一方面涉及用于识别可存在于复杂生物基质中的至少一种转铁蛋白糖型和/或同种型的方法，所述方法包括如下步骤：
a.将所述基质与镧系元素3+离子源接触；
b.用镧系元素3+离子功能化至少一种转铁蛋白糖型和/或同种型；
c.分析性分离并检测所述至少一种功能化的糖型和/或同种型。
在一实施方式中，本方法涉及识别及可能的测量至少一种转铁蛋白糖型，优选为缺糖转铁蛋白、(CDT)，更优选为二唾液酸-转铁蛋白。
本发明还涉及本方法用于检测与一个或多个糖型(特别是一个或多个CDT同种型)的浓度改变关联的疾病或临床状况的用途。
本发明的另一方面涉及用于检测与一个或多个转铁蛋白糖型和/同种型(优选为缺糖转铁蛋白)关联的疾病或临床状况的诊断方法，所述方法包括：
-收集人或动物复杂生物基质样本；
-将所述样本与镧系元素3+离子源接触；
-分析分离并检测(优选为通过荧光检测)至少一种功能化的转铁蛋白糖型；
-将获得的值与参考主体(临床上健康且无滥用酒精)中测得的对照值合理比较。
附图说明
图1：具有高量值的衍生的二唾液酸转铁蛋白的人血清的荧光模式的HPLC色谱图(exc 298,em 550nm-mV vs min)；
图2：衍生的人血清的荧光模式的CE电泳图谱(exc 280,em>460nm-RFU vs min)。
图3：衍生的人血清的荧光模式的HPLC色谱图(exc 298,em 550nm-mV vs min)。
具体实施方式
术语“分析分离与检测”用于说明用镧系元素3+离子功能化的转铁蛋白糖型通过定性分离进行识别(例如通过根据它们的洗脱时间的色谱分析法)，因此由分析检测器检测并测量。
“定量分离”意为一经识别，转铁蛋白糖型还被分离并隔离。
除非另有说明，术语“CDT”指示可存在于被分析的生物基质中的糖型：去唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白和二唾液酸转铁蛋白形式的缺糖转铁蛋白。
如上所述，所述糖型的唾液酸残基数目小于3个，且pI大于或等于5.7。这归因于缺乏一个或多个唾液酸残基，而这些残基存在于“正常”生理条件下的转铁蛋白中。
表述“标记的或功能化的糖型”目的是表示相关的用镧系元素3+离子功能化的转铁蛋白糖型(包括缺糖转铁蛋白)，如下文详细描述。实际上，由于生物基质与镧系元素离子源的接触，蛋白质的自由Fe3+位点被选定的镧系元素离子占用，甚至饱和，导致形成蛋白质-镧系元素加合物，优选为CDT-镧系元素3+离子加合物。
如上文所述，本发明涉及用于识别复杂生物基质中的一个或多个转铁蛋白糖型和/或同种型和/或唾液型(sialoforms)特别是CDTs的方法，该方法包括将后者与镧系元素3+离子源接触(步骤a.)，形成蛋白质-镧系元素3+离子加合物(步骤b.)及随后的至少一种标记的镧系元素糖型的分析分离和检测(步骤c.)。有利地，本方法还允许以简单、精确且可再现的形式测量各转铁蛋白糖型的最小的百分比变化。
本方法的生物基质优选为人或动物体液，优选为人体体液。更优选地，生物基质选自：血液、血浆、玻璃状液、唾液以及血清和脑脊液，优选为血清或脑脊液(液体)。
在实施例中，镧系元素3+离子源包括选自铕(Eu)、铽(Tb)、铒(Er)、镨(Pr)、镱(Yb)并优选为铽的元素的3+离子的有机或无机盐，优选为上述元素的3+离子的无机盐。
优选的盐选自：氯化物、硝酸盐、乙酰丙酮盐、氮基醋酸盐(NTA)和醋酸盐，特别优选为氯盐。
通常，镧系元素3+离子源为包含上述镧系金属的盐的有机或水溶液，优选为水溶液。如果是有机溶液，这些溶液优选为将盐溶解在有机溶剂中制备，该有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃和具有1-4个碳原子的醇类，优选为具有1-4个碳原子的醇类，特别优选为甲醇。优选的水溶液是通过将盐溶解在盐溶液(优选为溶解在水中)中获得。
可用于本方法的镧系金属离子溶液可具有包括在0.1微摩尔/升和1毫摩尔之间的最终浓度，例如根据使用的液体或离子的类型选定。
在接触步骤a.之前，用稀释溶液(例如水或盐溶液)稀释选定的生物基质可能是方便的。通常，基质以包括在1:2和1:10之间的比例被稀释，该比例取决于所要使用的分析技术的类型和/或取决于基质的成分和化学/物理性质。考虑到冷却作用、使用的样品数量的饱和度以及对使用的分析系统的保护，该稀释对优化分析是有用的。可能，样品中也可加入合适的稳定剂，稳定剂的主要功能是螯合自由铁，即未与蛋白质结合的铁。稳定剂可在样品制备期间加入或甚至在HPLC分析的情况下直接加入洗脱相中。总之，稳定剂的存在允许获得更好的信号，因此保证样品的溶液具有更好的稳定性，因为这大大减少了选定的镧系元素的衍生的氢氧化物的形成，否则可能形成选定的镧系元素的衍生的氢氧化物。合适的螯合剂可选自：EDTA、去铁胺B(FeDFO，例如以甲磺酸去铁胺、甲磺酸盐的名称出售的)等。根据步骤a.的接触可发生在室温(约包括在15℃和40℃之间的温度)下，例如在去铁胺B存在下将人体体液(可以是稀释的)与含有氯化铽的水溶液混合。
根据步骤b，将混合物静置培养期，以允许转铁蛋白糖型与镧系元素3+离子功能化。所述培养期允许形成蛋白质-镧系元素3+离子加合物(优选为通过使自由的Fe3+结合位点饱和)，并且其也可在很短的时间段内发生，例如约4或5分钟。
人们注意到在步骤b.中形成的加合物随时间流逝是稳定的，且其也可保存几天，而基本不干扰被处理体液的分析和组分。可能在步骤b.结束时能够(例如通过离心分离)进行中间固体/液体的分离步骤，通常当样品出现可影响实验的执行容易度或以某种方式危及方法的灵敏度的杂质或乳白色光时进行。
因此根据步骤c.，使含有转铁蛋白-镧系元素3+离子加合物的样品经分析分离和检测。
优选地，在步骤c.中，识别去唾液酸转铁蛋白糖型、单唾液酸转铁蛋白糖型、二唾液酸转铁蛋白糖型(即，此处由CDT表示的缺糖转铁蛋白)，特别优选为二唾液酸糖型。
在这方面，可有利地使用例如根据使用的基质的类型或样品的可用量选择的本领域技术人员已知的分析技术和仪器(一般参考Biochimica Clinica,2006,30卷,n.3 203-209页)。优选地，本方法的步骤c.包括通过HPLC或毛细管电泳(CE)分析分离。在HPLC分离的情况下，洗脱液相可包含用作第二负电荷的离子对试剂的合适的化合物，以允许最终信号的更好分辨率。优选地，所述化合物为1,4-二氨基丁烷(DAB)。在CE分离的情况下，电泳缓冲液可包含用于减少毛细管壁与待分离的离子被分析物之间的离子相互作用的涂料化合物，优选地，所述化合物为DAB。
通过非限制性示例，根据本方法的一个或多个CDT-镧系元素3+离子加合物糖型的分析分离可通过使用弱阴离子交换HPLC柱进行，在合适的稳定剂或多价螯合剂存在下，用具有例如包括在6和9之间的pH值的缓冲液浓度梯度洗脱。仍通过示例，在CE分析的情况下，可使用直径为25-50微米、长度包括在20-100厘米之间的毛细管，使用可能包含微量镧系元素3+离子盐，优选包括在0.1和1000微摩尔/升之间的量的硼酸盐缓冲剂等。
在同样的优选实施例中，步骤c.包括通过荧光分析检测和测量转铁蛋白的糖型。
具有合适的激发波长和发射波长的荧光检测器的使用特别方便，因为其允许获得最佳检测灵敏度和特异性，能够测量包括CDTs的各种转铁蛋白糖型的微小的百分比变化。
对HPLC和CE来说，使用的荧光检测器的典型最终状态可在250-320nm之间被激发(ex)且大于或等于400nm被发射(em)。
在这个程度上，图1显示用由ex298,em 550nm荧光检测获得的氯化铽水溶液处理的人血清的HPLC色谱图。可观察到二唾液酸-转铁蛋白(约13分钟)、三唾液酸-转铁蛋白(约14分钟)；四唾液酸-转铁蛋白(约15-16分钟)和五唾液酸-转铁蛋白(在17和18分钟之间)的信号。
图2显示出用氯化铽水溶液处理的血清样本的荧光电泳图谱，其中可(分别在23分钟和24分钟)识别二、三唾液酸缺糖信号，以及四-唾液酸转铁蛋白和五-唾液酸转铁蛋白形式(从24.5分钟至约26分钟)。
从图1-2可观察到，大量四唾液酸-转铁蛋白的存在可用作洗脱/迁移时间的内部标准，目的是通过测量相对时间达到对其它成分的更精确的识别。
除了高灵敏度，本方法允许获得图(色谱图/电泳图谱)，与现有技术方法中观察到的相反，图中由被分析生物基质的类型引起的干扰效应完全不起作用。关于这点，参见例如图2，在图2中可注意到不存在干扰信号，这在使用通过UV检测的常规方法进行的分析中肉眼可见。这建议本方法也可能通常适用于不同于人血清或血液的生物基质，而保证在清晰度和灵敏度方面有最佳结果。
测量色谱峰面积有利地允许计算检测到的糖型的百分比，并因此获得研究的个体主体的临床/毒理学图片的主要信息，例如关于用健康参照主体中的生物基质获得的值。实际上，用本方法测得的关于糖型的值相对于总蛋白质的量来说，对应于相对峰的百分值。例如，图3所示，考虑到二唾液酸面积(56786,在12.7分钟)，三唾液酸(592805,在13.9分钟)和四+五唾液酸(10487682,在16.4分钟)，计算的二唾液酸糖型的百分比占总面积的0.51％。
在另一实施例中，本方法可包括用于定量分离例如一个或多个CDT糖型和/或同种型的可能的步骤d.，通常通过本领域技术人员已知的方法，例如制备柱等。
在进一步的方面，本发明涉及本方法用于识别与一个或多个糖型(优选为CDT，特别是二唾液酸糖型)关联的可能的疾病或临床状况的用途。当讨论中的生物基质为人时，本方法适于诊断经受分析的人的酒精上瘾或滥用状况。
因此，本发明还涉及用于检测生物体(优选为人类)中与至少一种转铁蛋白糖型和/同种型关联的疾病或临床状况的诊断方法，包括：
收集按上述指示选择的人体体液样本；
按上述指示将所述样本与镧系元素3+离子源接触；
按上述指示分析性分离并检测至少一种转铁蛋白糖型和/或同种型；
将获得的值与健康参考主体中测得的值合理比较。
表述“健康主体”用于指示具有缺糖糖型(尤其是二唾液酸糖型)的正常的并无交叉感染改变临床/毒理学状态的人。
除了高灵敏度，本方法特征还在于易执行，因为无需特殊试剂或无需对被分析样本进行预处理。此外，使用荧光检测器的分析技术的可能性还允许分析有限量的生物样本，保证了本方法的高可靠性。实际上，如果是所谓的积极的结果，没必要进行证实实验，因为在现有技术的诊断方法中需求。
进一步的优点在于本方法还可适用于不同类型的复杂生物基质，使本发明极其通用并具有广泛适用性。
本发明将由下述用于说明和非限制性目的的实验部分描述。
实验部分
示例1.1：根据本发明的方法制备转铁蛋白-镧系元素3+离子加合物。
样本：40微升血清样本(或浓度为约10微摩尔/升的标准载脂蛋白(standard Apoat the conc,of about 10micromols/L)或常规方法中使用的对照样)，其中加入8微升镧系元素氯盐的含水的盐溶液(最终浓度为约500微摩尔/升)，然后加入15微升去铁胺-B稳定剂(FeDFO,例如以甲磺酸去铁胺、甲磺酸盐的名称出售)并加入水至最终体积150微升。
示例1.2：通过HPLC检测示例1.1的加合物(图1)。
使用的柱为具有特定保护柱和0.22微米过滤器的WAX柱(弱阴离子交换CLINREP)4.6×5mm×cm并温度调节在50℃(thermostatation at 50℃)。1毫升/分钟流动。在包括在约7和9之间的pH值下的三羟甲基氨基甲烷缓冲液20mM流动相，加入0.5M氯化钠和DAB(1,4-二氨基丁烷)18mM。相B梯度为0-20％。相A还包含浓度为50-100微摩尔/升的去铁胺-B稳定剂(FeDFO,甲磺酸去铁胺)。
运行结束时，用2M氯化钠溶液使柱再生。分析的总持续时间为40分钟。
这些状况是对用氯化铽处理的人血清样本进行试验的，且色谱图显示在图1中。
示例1.3：通过CE分析检测示例1.1的加合物(图2)。
初始数据显示二唾液酸转铁蛋白糖型、三唾液酸转铁蛋白糖型、四唾液酸转铁蛋白糖型和五唾液酸转铁蛋白糖型。使用的荧光检测器为LED型。进行的试验使用直径为50微米，长度约50-70cm的毛细管。电泳缓冲液为硼酸盐缓冲剂，该缓冲剂pH值为7-9，120mM包含DAB 6mM，用30kV的ddp进行分离。样本在一压强(0.5psi)下被注入，且分离持续约30分钟。样本的处理完全类似于为示例1.2的HPLC提供的，即血清(标准或对照)加入镧系元素盐溶液(在注入的样品中最终为500微摩尔/升)。
图2显示使用由氯化铽处理的血清样本获得的CE图谱。

Claims (15)

1.镧系元素3+离子源在制备用于识别存在于复杂生物基质中的至少一种转铁蛋白糖型和/或同种型的试剂中的用途，其通过如下步骤实现：
a. 将所述基质与所述镧系元素3+离子源接触，以得到混合物，其中所述镧系元素3+离子源为包括选自铕、铒、镨、镱和铽的元素的3+离子的盐的有机溶液或水溶液；
b. 将所述混合物静置培养，以允许用镧系元素3+离子功能化至少一种转铁蛋白糖型和/或同种型，形成转铁蛋白-镧系元素3+离子加合物；
c. 分析性分离并检测至少一种功能化的糖型和/或同种型，其中分析性分离由HPLC或CE进行分析和测量，分析性检测由荧光检测进行。
2.根据权利要求1所述的用途，其中至少一种转铁蛋白糖型为缺糖转铁蛋白，所述缺糖转铁蛋白选自：去唾液酸转铁蛋白糖型、单唾液酸转铁蛋白糖型、二唾液酸转铁蛋白糖型。
3.根据权利要求2所述的用途，用于识别并测量二唾液酸转铁蛋白糖型。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中，所述生物基质为动物的体液或为人体的体液。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述体液选自：血浆、血液、玻璃状液、唾液、血清和脑脊液。
6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述镧系元素3+离子源为选自硝酸盐、醋酸盐、乙酰丙酮盐、氮基醋酸盐和氯化物的镧系元素3+盐的有机溶液或水溶液。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述源为水溶液，所述水溶液通过将镧系元素离子的盐溶解在盐溶液中而获得。
8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述源为有机溶液，所述有机溶液通过将镧系元素离子的盐溶解在有机溶剂中而获得，所述有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃或具有1-4个碳原子的醇类。
9.根据权利要求8所述的用途，其中具有1-4个碳原子的所述醇类为甲醇。
10.根据权利要求1所述的用途，其中，根据步骤b.的功能化通过用镧系元素3+离子使至少一种转铁蛋白糖型的自由Fe3+结合位点饱和而实现。
11.根据权利要求2所述的用途，其中，根据步骤b.的功能化通过用镧系元素3+离子使缺糖转铁蛋白的自由Fe3+结合位点饱和而实现。
12.根据权利要求1所述的用途，还包括用于定量分离所述步骤c.中检测出的至少一种糖型的步骤d.。
13.根据权利要求1所述的用途，用于检测与存在的至少一种转铁蛋白关联的临床/毒理学状态。
14.根据权利要求2所述的用途，用于检测与存在缺铁转铁蛋白关联的临床/毒理学状态。
15.根据权利要求13所述的用途，用于检测人类酒精滥用或上瘾状况。
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