CN106460036A

CN106460036A - 用于对响应b细胞消耗疗法的b细胞恶性肿瘤进行鉴定的组合物和方法

Info

Publication number: CN106460036A
Application number: CN201580011365.7A
Authority: CN
Inventors: M.库齐奥拉; Y.姚; K.拉纳德; P.Z.布罗霍恩; K.斯特赖歇尔
Original assignee: MedImmune Vaccines Inc
Current assignee: MedImmune LLC; MedImmune Vaccines Inc
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2015-03-04
Publication date: 2017-02-22
Also published as: MX2016010948A; RU2016138431A; AU2015227251A1; US20150252431A1; EP3114238A2; BR112016020043A2; KR20160129862A; US20170088628A1; WO2015134631A2; WO2015134631A8; WO2015134631A3; EP3114238A4; JP2017510255A; CA2940464A1

Abstract

本发明提供组合物和方法，这些组合物和方法特征是使用miR‑629来鉴定响应B细胞消耗疗法(例如，使用抗‑CD19抗体的治疗)的受试者。在其它实施例中，本发明的特征是使用miR‑629鉴定受试者为具有B细胞恶性肿瘤。

Description

用于对响应B细胞消耗疗法的B细胞恶性肿瘤进行鉴定的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年3月4日提交的美国临时专利申请号US 61/947,755的权益，将其通过引用特此结合。

以电子方式提交的材料通过引用结合

通过引用以其整体结合在此的是一种计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，该序列表在此同时提交，并确定如下：一份8,585字节的ASCII(文本)文件命名为“MR629-100WO1序列表.TXT”，创建于2015年3月4日。

发明背景

大多数人白血病和淋巴瘤，包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)，起源于B细胞。基于通过使用单克隆抗体(mAbs)靶向B细胞限制性表面抗原的B细胞消耗的治疗方法已经获得了越来越多的关注。人分化簇(CD)抗原19是一种B细胞特异的表面抗原和用于治疗B细胞起源的恶性肿瘤的治疗性单克隆抗体(mAb)方法的一个有吸引力的靶标。具有增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的亲和优化的并且非岩藻糖基化的CD19单克隆抗体已被证明在B细胞恶性肿瘤的临床前模型中具有强的抗肿瘤活性。

人们越来越认识到B细胞恶性肿瘤由各种各样的致病机理引起，并且在分子水平表征这些恶性肿瘤的方法对患者分层是有用的，从而迅速地指导他们有效的疗法。迫切需要改进的方法以预测具有B细胞恶性肿瘤的受试者的响应性。

发明概述

如下所述，本发明的特征是以下组合物和方法，这些的组合物和方法的特征是使用miR-629来鉴定响应B细胞消耗疗法(例如，使用抗-CD19抗体的治疗)的受试者。在其它实施例中，本发明的特征是使用miR-629以鉴定具有B细胞恶性肿瘤的受试者。

一方面，本发明总体上提供了为具有B细胞恶性肿瘤的受试者(例如人)选择疗法的方法，该方法涉及在受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测选择受试者用于抗-CD19抗体疗法。

另一方面，本发明提供了鉴定具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者的方法，该方法涉及在受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测将该受试者鉴定为响应抗-CD19抗体治疗。

另一方面，本发明提供了为具有B细胞恶性肿瘤的受试者选择疗法的方法，该方法涉及通过定量PCR或miRNA微阵列分析在受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测选择受试者用于抗-CD19抗体疗法。

再另一方面，本发明提供了鉴定具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者的方法，该方法涉及通过定量PCR或miRNA微阵列分析在受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测将该受试者鉴定为响应抗-CD19抗体治疗。

又另一方面，本发明提供了治疗被选择为具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者的方法，该方法涉及给予选择的受试者有效量的抗-CD19抗体，其中该受试者是通过在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达来选择的。

另一方面，本发明提供了对具有B细胞恶性肿瘤的受试者给药的方法，其中该受试者是被鉴定为具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤，该鉴定是通过在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达。

再另一方面，本发明提供在具有B细胞恶性肿瘤的受试者体内消耗B细胞的方法，该方法涉及在受试者的血液样品中检测相对于参考水平的降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测鉴定响应抗-CD19抗体疗法的受试者；并且给予受试者抗-CD19抗体，从而在受试者内消耗B细胞。

又另一方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包含特异性地结合miR-629的引物或探针。在一个实施例中，该试剂盒进一步包含使用该试剂盒来选择或鉴定响应抗-CD19抗体疗法的受试者的说明书。

另一方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包含抗-CD19抗体以及特异性地结合miR-629的引物或探针。在一个实施例中，该试剂盒进一步包含使用该试剂盒来选择或鉴定响应抗-CD19抗体疗法的受试者的说明书。

再另一方面，本发明提供诱导或增加抗-CD19抗体在鉴定为具有B细胞恶性肿瘤的受试者内的响应性的方法，该方法涉及给予受试者有效量的靶向miR-629的抑制性核酸分子。

再另一方面，本发明提供在受试者内消耗B细胞的一种方法，该方法涉及给予受试者一个有效数量的联合抗-CD19抗体靶向miR-629的抑制性核酸分子，从而在受试者内消耗B细胞。

再另一方面，本发明提供一种组合物，该组合物包含与抗-CD19抗体联合靶向miR-629的抑制性核酸分子。

再另一方面，本发明提供了鉴定具有B细胞恶性肿瘤的受试者的方法，该方法包括在受试者的血液样品中检测相对于参考水平增加的miR-629表达，其中对所述增加的检测鉴定该受试者为具有B细胞恶性肿瘤。

再另一方面，本发明提供鉴定具有B细胞恶性肿瘤的受试者的方法，该方法包括在受试者的血液样品中通过定量PCR或miRNA微阵列分析检测相对于参考水平增加的miR-629表达，其中对所述增加的检测鉴定该受试者为具有B细胞恶性肿瘤。在一个实施例中，参考水平是健康的对照受试者的血液样品中出现的miR-629表达水平。

再另一方面，本发明提供了为具有B细胞恶性肿瘤的受试者选择疗法的体外方法，该方法包括在受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测选择受试者用于抗-CD19抗体疗法。

再另一方面，本发明提供了鉴定具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者的体外方法，该方法包括在受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测将该受试者鉴定为响应抗-CD19抗体治疗。

再另一方面，本发明提供了为具有B细胞恶性肿瘤的受试者选择疗法的体外方法，该方法包括通过定量PCR或miRNA微阵列分析在受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测选择受试者用于抗-CD19抗体疗法。

再另一方面，本发明提供了鉴定具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者的体外方法，该方法包括通过定量PCR或miRNA微阵列分析在受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测将该受试者鉴定为响应抗-CD19抗体治疗。

另一方面，本发明提供了抗-CD19抗体在药剂制造中的用途，该药剂用于治疗在体外方法中被选择为具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者，其中通过在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达来选择该受试者。在一个实施例中，该抗-CD19抗体是人的、人源化的或嵌合的抗体。在另一个实施例中，该抗-CD19抗体是低岩藻糖基化的或非岩藻糖基化的抗体。在再另一个实施例中，该抗-CD19抗体包含重链CDR1，其包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，重链CDR3，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在再另一个实施例中，该抗-CD19抗体包含VH结构域，该结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在再另一个实施例中，该抗-CD19抗体包含VL结构域，该结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在再另一个实施例中，该抗-CD19抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域以及含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL结构域。

另一方面，本发明提供了抗-CD19抗体在药剂制造中的用途，该药剂用于在具有B细胞恶性肿瘤的受试者内消耗B细胞，其中该受试者被选择在一种体外方法中治疗，该方法涉及在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测鉴定响应抗-CD19抗体疗法的受试者。在一个实施例中，该抗-CD19抗体是人的、人源化的或嵌合的抗体。在另一个实施例中，该抗-CD19抗体是低岩藻糖基化的或非岩藻糖基化的抗体。在再另一个实施例中，该抗-CD19抗体包含重链CDR1，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，重链CDR3，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在再另一个实施例中，该抗-CD19抗体包含VH结构域，该结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在再另一个实施例中，该抗-CD19抗体包含VL结构域，该结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在再另一个实施例中，该抗-CD19抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域以及含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL结构域。

另一方面，本发明提供靶向miR-629的抑制性核酸分子在药剂制造中的用途，该药剂用于治疗被鉴定为具有B细胞恶性肿瘤的受试者。

另一方面，本发明提供靶向miR-629的抑制性核酸分子在药剂制造中的用途，该药剂用于消耗受试者内的B细胞。在一个实施例中，该抑制性核酸分子是反义核酸分子、siRNA、或shRNA。

另一方面，本发明提供靶向miR-629的抑制性核酸分子与抗-CD19抗体联合在药剂制造中的用途，该药剂用于治疗被鉴定为具有B细胞恶性肿瘤的受试者。

另一方面，本发明提供了鉴定具有B细胞恶性肿瘤的受试者的体外方法，该方法涉及在受试者的血液样品中检测相对于参考水平增加的miR-629表达，其中对所述增加的检测鉴定该受试者为具有B细胞恶性肿瘤。

另一方面，本发明提供鉴定具有B细胞恶性肿瘤的受试者的体外方法，该方法包括在受试者的血液样品中通过定量PCR或miRNA微阵列分析检测相对于参考水平增加的miR-629表达，其中对所述增加的检测鉴定该受试者为具有B细胞恶性肿瘤。

在以上任何方面或本发明在此描述的任何其它方面的各种各样的实施例中，参考水平是通过将miR-629表达的水平与样品中出现的其它微小RNA进行比较获得的；测定从具有对抗-CD19抗体治疗不响应的B细胞恶性肿瘤的受试者获得的样品中miR-629表达的范围；或通过测量对于抗-CD19抗体治疗具有降低的敏感性、对抗化疗的抗增生效果具有抗性、或对化疗诱导的细胞凋亡具有抗性的受试者或细胞系中miR-629表达的水平或范围。在以上方面的其它实施例中，参考水平是通过使用Δ-ΔCt法测量miR-629表达的倍数变化。在以上方面的其它实施例中，参考水平是通过在受试者群体中测量miR-629表达的范围或水平。在以上任何方面的各种各样的实施例中，受试者具有B细胞起源的淋巴瘤或白血病(例如，非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、或慢性淋巴细胞性白血病)。在以上方面的其它实施例中，相对于具有非响应性的滤泡性淋巴瘤的受试者，miR-629表达在从具有响应性的滤泡性淋巴瘤的受试者获得的血液样品中要低三至五倍。在以上方面的其它实施例中，相对于具有非响应性的弥漫性大B细胞淋巴瘤的受试者，miR-629表达在从具有响应性的弥漫的大B细胞淋巴瘤的受试者获得的血液样品中要低五至七倍。在以上方面的其它实施例中，血液样品是全血、外周血单核细胞(PBMC)样品、血清、或血浆。在以上方面的其它实施例中，该抗-CD19抗体是人的、人源化的或嵌合的抗体。在以上方面的其它实施例中，该抗-CD19抗体是低岩藻糖基化的或非岩藻糖基化的。在以上方面的再其它实施例中，该抗-CD19抗体包含重链CDR1，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，重链CDR2，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，重链CDR3，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，轻链CDR2，其包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列，以及一个轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在以上方面的其它实施例中，该抗-CD19抗体包含VH结构域，该结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在以上方面的其它实施例中，该抗-CD19抗体包含VL结构域，该结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在以上方面的其它实施例中，该抗-CD19抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域以及含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL结构域。在以上方面的其它实施例中，该抗-CD19抗体是MEDI-551。在以上方面的其它实施例中，该抑制性核酸分子是反义核酸分子、siRNA、或shRNA。在以上方面的其它实施例中，该抑制性核酸分子是先于或同时与抗-CD19抗体给予的。

本发明的其它特征及优点将在详细说明以及在权利要求书中呈现。

定义

除非另外说明，本文所用的所有科技术语的意义都与本发明所属技术领域的技术人员通常所理解的意义一致。下面的参考文献为技术人员提供了本发明所用的多个术语的通用定义：辛格尔顿(Singleton)等人，《微生物学和分子生物学词典》(Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology)(第2版，1994年)；《剑桥科学与技术的词典》(TheCambridge Dictionary of Science and Technology)(沃克(Walker)编辑，1988年)；《遗传学词汇》(The Glossary of Genetics)，第5版，丽格(R.Rieger)等人(编辑)，施普林格出版社(1991)；以及哈勒(Hale)与迈尔哈姆(Marham)，《哈珀柯林斯生物学词典》(The HarperCollins Dictionary of Biology)(1991)。除非另行指明，如在此使用的以下术语具有以下赋予它们的含意。

术语“B细胞恶性肿瘤”包括起源于B细胞谱系的细胞的任何恶性肿瘤。

“CD19”意指结合到其抗-CD19抗体或片段上的、约90kDa的抗原。CD19被发现在从干细胞阶段通过终末分化成浆细胞的B-谱系细胞上。在优选实施例中，被在此披露的抗体(例如MEDI-551)靶向的CD19抗原是人CD19抗原。在GenBank提供了一个示例性CD19抗原序列(GenBank登记号AAA69966)，并且显示在下面SEQ ID NO.9中：

“抗-CD19抗体”意指特异地结合到CD19抗原上的抗体或其片段。在一个实施例中，抗CD19抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域以及含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VL结构域。

“miR-629”指具有或包含下列序列(SEQ ID NO 10)的微小RNA(加工前)：

1 tccctttccc aggggagggg ctgggtttac gttgggagaa cttttacggt gaaccaggag61 gttctcccaa cgtaagccca gcccctcccc tctgcct.(NCBI登记号NR_030714)。

在另一个实施例中，成熟的miR-629微小RNA具有或包含下列序列SEQ ID NO.11：

61-guucucccaacguaagcccagc-82(miRBase登记号MIMAT0003298)。

miR-629的功能和/或表达可被抑制，例如，被miRIDIAN微小RNA hsa-miR-629-3p发夹抑制剂抑制，该抑制剂从ThermoScientific公司购买获得。

“ΔCt法”意指测定每个淋巴瘤/白血病患者样品的ΔCt，其被计算为miR-629的临界循环(Ct)值减去四个管家基因(RNU48、RNU24、U6、和U47)的平均Ct值。所有正常个体的平均ΔCt值(如对于癌症患者样品所描述的计算)然后被从每个患者样品的个体ΔCt值减去以产生对于每个淋巴瘤/白血病患者样品的Δ-ΔCt值。这涉及下列方程式的倍数变化：倍数变化＝2^-(Δ-ΔCt)。

在此披露中，术语“包括(comprises、comprising)”、“包含(containing)”、“具有(having)”等具有美国专利法赋予它们的意义并且意味着“包括(includes、including)”等；“基本上由…组成(consisting essentially of或consists essentially)”同样具有美国专利法赋予的意义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施例。

B细胞“消耗”意指循环的B细胞和/或特定组织中的B细胞相对于基线水平减少。在具体实施例中，该消耗是指相对于治疗前(例如抗-CD19抗体治疗)在受试者内出现的水平减少至少大约25％、40％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多(例如，96％、97％、98％、或99％)。在一个具体实施例中，循环和/或特定一个或多个组织中的几乎所有可检测到的B细胞被消耗。

“检测”是指鉴定待检测的分析物的存在、不存在或数量。在一个实施例中，该分析物是miR-629。

“miR-629抑制性核酸分子”意指双链RNA、siRNA、shRNA、或反义RNA、或其一部分、或其类似物当给予哺乳动物细胞时导致miR-629表达降低。典型地，核苷酸抑制剂包括靶核酸分子的至少一部分、或其类似物，或包括靶核酸分子互补链的至少一部分。在一个实施例中，miR-629抑制性核酸分子抑制细胞中miR-629表达的至少大约10％、25％、50％、75％、或甚至90％-100％。

“参考”意指用于比较的标准。在一个实施例中，参考水平是在全血样品中的miR-629表达水平，该全血样品是从健康的对照受试者获得或从具有对抗-CD19抗体治疗不响应的B细胞恶性肿瘤的受试者获得。

“miR-629siRNA”意指能在靶细胞中减少miR-629表达的双链RNA。最佳地，siRNA的长度是18、19、20、21、22、23或24个核苷酸并且在它的3’端具有2碱基突出。这些dsRNA可以被引入单独细胞或引入完整的动物；例如，它们可以经由血流系统地引入以减少miR-629核酸分子的表达。

“特异地结合”意指抗体、引物或探针，其识别并且结合本发明的多肽或核酸分子，但是基本上不识别和结合在样品(例如，生物样品，其天然地包括本发明的多肽或聚核苷酸)中的其它分子。在一个实施例中，抗-CD19抗体是特异性地结合CD19多肽。典范的抗-CD19抗体在本领域中是熟知的并且在此以下进行描述。

“受试者”意指哺乳动物，但不限于人或非人类哺乳动物，例如牛、马、犬、羊、猫、或鼠。

在此提供的范围被理解成对范围内的所有值的简写。例如，一个1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围，该组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

如在此所使用的术语“治疗(treat、treating、treatment等)”指的是减少或改善失调和/或与其相关联的症状。在一个实施例中，B细胞恶性肿瘤治疗导致B细胞消耗，导致减少或稳定受试者内肿瘤的生长或增生，导致增加恶性肿瘤细胞的细胞死亡，或增加患者的存活。将被理解的是，尽管不能排除，治疗失调或病症并不要求完全地消除该失调、病症或与其相关联的症状。

除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“或”被理解为包括在内。除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“一种”、“一个”和“该(the)”被理解为单数的或复数的。

除非确切规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的术语“大约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。大约可以被理解为在声明值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。除非从上下文显而易见，在此提供的所有数值被该术语大约修饰。

附图简要说明

图1A是图表，该图表显示了相对于对于抗-CD19抗体具有低敏感性的细胞系，对于抗-CD19抗体治疗具有高敏感性的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系中miR-629表达降低。

图1B是图表，该图表显示对于抗-CD19抗体治疗表现高和低敏感性的细胞系内的表达强度miR签名。图1B显示在对于抗-CD19抗体治疗具有高敏感性的DLBCL细胞系中miR-629明显更低。

图2是散点图，该图显示，相对于具有进行性疾病(PD)的非响应者，在对于抗-CD19抗体治疗表现完全或部分响应(CR/PR)的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中miR-629表达更低。

图3是散点图，该图显示在从响应抗-CD19抗体治疗(CR/PR)的滤泡性淋巴瘤患者获得的全血样品中miR-629表达比滤泡性淋巴瘤的非响应者(PD)更低。

图4是散点图，该图显示在从响应抗-CD19抗体治疗(CR/PR)的慢性淋巴细胞性白血病患者获得的全血样品中miR-629表达比非响应者更低。

图5A和5B是散点图，该图显示从慢性淋巴细胞性白血病患者在接受治疗前获得的全血样品中测量的miR-629表达。对患者对利妥昔单抗-ICE治疗(图5B)与抗-CD19抗体-ICE治疗(图5A)的响应进行了表征。

图5C和5D是散点图，该图分别显示了对于抗-CD19抗体(MEDI-551)或利妥昔单抗治疗呈现高和低敏感性的细胞系中的表达强度miR签名。

图5E是散点图，该图显示对于抗-CD19抗体(MEDI-551)和化疗响应的DLBCL患者中基线miR-629表达更低。这个效果在利妥昔单抗中没有观察到。这个数据是在所有剂量(2mg/kg与4mg/kg MEDI-551和375mg/m²利妥昔单抗)处从治疗的患者中获得的。

图5F是散点图，该图显示对于抗-CD19抗体(MEDI-551)和化疗响应的DLBCL患者中基线miR-629表达更低。化疗是通过如下所述给予的ICE或DHAP：ICE将通过如下所述的IV输注给予：在21天的周期中，连续24小时的异环磷酰胺5g/m²，在第2天使用美司钠；在第2天卡铂AUC＝5mg/mL×min(最大值800mg)；在第1、2、和3天，依托泊苷100mg/m²)。DHAP将通过如下所述的IV输注给予：在21天的周期中，在第1、2、3、和4天，地塞米松40mg；在定量给药周期的第1天连续24小时的顺铂100mg/m²；在第2天在3小时内输注阿糖胞苷2g/m²，12小时后重复(2次给药)。这个数据是从接受2mg/kg的抗-CD19抗体(MEDI-551)治疗的患者中获得。

图6A-6C是散点图。图6A和6B显示miR-629表达水平在对于抗-CD19抗体(CR/PR)响应的DLBCL患者中在治疗前和治疗后相似(图6A和6B)。图6C显示在具有进行性疾病(PD)的DLBCL患者中治疗后miR-629表达水平增加。

图7A和7B是散点图，该图显示相比健康的志愿者，具有淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤与滤泡性淋巴瘤)的患者中miR-629更高。图7A显示使用miRNA微阵列分析获得的结果。图7B显示使用TaqMan定量PCR获得的结果。

图8是散点图，该图显示在特定细胞类型中的miR-629表达。

图9A-9C涉及miR-629过量表达。图9A显示miR-629/GFP表达载体。图9B是显微图，该图显示在表达miR-629/GFP表达载体的细胞中的GFP表达。图9C是图表，该图表显示在DLBCL细胞系Karpas-422中miR-629的表达。慢病毒miR-629表达载体的转导后，使用GFP表达将Karpas-422细胞分为两组，低miR-629组和高miR-629组。两组中mir-629表达增加，但在具有增加的GFP表达的组中更高。

图10A和10B是图表，这些图表显示相对于未经治疗的对照细胞，接受5μM或10μM依托泊苷治疗的、过量表达miR-629的Karpas-422淋巴瘤细胞中半胱天冬酶的激活。miR-629过量表达保护Karpas-422淋巴瘤细胞免受化疗(依托泊苷)诱发的细胞凋亡。产生了miR-629过量表达细胞的多个克隆。随着miR-629表达增加，观察到防止化疗(依托泊苷)诱发的细胞凋亡的保护增大。

图11A和11B是图表，这些图表显示相对于仅转染了载体(打乱型)的对照细胞，接受了依托泊苷治疗的过量表达miR-629的Karpas-422淋巴瘤细胞中细胞增生测定的结果。miR-629表达保护这些细胞免受化疗(依托泊苷)诱发的细胞增生损失。如上所述，产生了miR-629过量表达细胞的多个克隆。随着miR-629表达增加，观察到防止化疗(依托泊苷)诱发的增生损失的保护增大。

图12A和12B是图表。图12A显示，相对于仅表达载体的对照细胞，在低或高水平表达miR-629的Karpas-422细胞中体外抗体依赖性细胞毒性(ADCC)试验的结果。该ADCC结果很有意义，因为它们阐明了随着miR-629的水平增加，ADCC对MEDI-551的响应的改变。不想被理论束缚，这些结果表明，很有可能miR-629在介导对MEDI-551的响应中有直接的作用。图12B显示自发的乳酸脱氢酶(LDH)在低或高水平表达miR-629的细胞中释放。LDH释放是多年来已经熟知的淋巴瘤预后因子，它在临床实践中被进行常规测量。这些结果显示miR-629增加了在淋巴瘤细胞系中的LDH释放。因此，很有可能miR-629表达水平与肿瘤的攻击性有关。这可能部分解释miR-629与对MEDI-551的响应之间的关系。

图13显示在具有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的患者中，对于抗-CD19抗体(MEDI-551)治疗响应的逻辑回归分析。点代表响应者(上部)和非响应者(底部)。该数据显示miRNA签名表达是MEDI-551在CLL中响应的一个潜在的预测性的生物标志物。

图14A-D是图表，该图表显示抗体依赖性细胞毒性(ADCC)试验的结果。miR-629在特定的细胞类型中过量表达，并且这些细胞然后接受抗-CD19抗体(MEDI551)治疗。

图15A和15B是图表，这些图表显示在对于抗-CD19抗体(MEDI551)治疗具有不同的敏感性的九个细胞系中使用别藻蓝蛋白(APC)标记的第二抗体测定的CD19(图15A)和CD20(图15B)表达。在对照转染细胞、miR转染细胞、和未转染细胞中测量了平均荧光强度(MFI)比值。miR-629过量表达后，CD19和CD20的表达都没有改变。

图16是图表，该图表显示，DLBCL患者的基线血液样品中的miR-629表达水平(相对于正常血液的倍数变化)与先前显示的使用化学治疗剂组合(包括利妥昔单抗、环磷酰胺、羟基柔红霉素(或阿霉素)、长春新碱也称为和泼尼松龙(R-CHOP)(阿伦卡尔(Alencar)等人，《临床肿瘤研究》(Clin Cancer Res)；17(12)2011年6月15日))治疗后预测增加患者的存活率的血液样品中的miRNA的表达签名不相关。在DLBCL血液中，该R-CHOP响应相关的miRNA签名与MEDI-551响应相关的miRNA签名不相关。

图17是图表，该图表显示在稳定表达miR-629的细胞中分离的外排体中存在miR-629。事实上，在这些外排体中存在12-20倍更高水平的miR-629。

图18A和18B是图表，这些图表显示miR-629核转染对自然杀伤(NK)细胞的影响的初步分析。核转染后miR-629表达增加(图18A)；并且在溶细胞通路和相关自然杀伤细胞活化/粘附通路中基因的表达减少40％-60％。分析的基因包括颗粒酶B(GZMB)、GZMA、GZMM、组织蛋白酶D(CTSD)、穿孔素1(PRF1)、CD63、CD96、和干扰素调节因子7。

抗-CD19(16C4)抗体序列说明

VH结构域SEQ ID NO:1：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu ValGln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser SerSer Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly ArgIle Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe Lys Gly Arg Phe ThrIle Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys TheGlu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg AspPhe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

VH CDR1SEQ ID NO:2：SSWMN

VH CDR2SEQ ID NO:3：RIYPGDGDTNYNVKFKG

VH CDR3SEQ ID NO:4：SGFITTVRDFDY

VL结构域SEQ ID NO:5：Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln SerVal Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp ThrPhe Gly Ile Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys LeuLeu Ile His Glu Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly SerGly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala AlaThr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys GluVal Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr LysVal Glu Ile Lys

VL CDR1 SEQ ID NO:6：RASESVDTFGISFMN

VL CDR2 SEQID NO:7：EASNQGS

VL CDR3 SEQ ID NO:8：QQSKEVPET

发明详细说明

本发明提供组合物和方法，这些的组合物和方法特征是使用miR-629来鉴定对B细胞消耗疗法(例如，使用抗-CD19抗体的治疗)响应的受试者。

本发明是基于(至少部分地)一个发现，该发现是具有B细胞恶性肿瘤的受试者的血液样品中的miR-629表达可以被用来表征受试者对于抗-CD19抗体治疗的响应性。如下文详细报道，使用体外抗体依赖性细胞毒性(ADCC)试验，许多人类非霍奇金B细胞淋巴瘤细胞系被鉴定为对于抗-CD19抗体治疗具有高或低敏感性。在响应抗-CD19抗体治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤受试者中获得的血液样品中miR-629表达水平降低了。在响应抗-CD19抗体治疗的滤泡性淋巴瘤受试者和慢性淋巴细胞性白血病受试者中获得的血液样品中的miR-629表达水平也降低了。

相应地，基于在受试者血液样品中miR-629表达的水平，本发明提供用于鉴定受试者的方法，这些受试者具有可能响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤。

生物样品类型

在表征受试者的B细胞恶性肿瘤对抗-CD19抗体治疗的响应性中，对不同类型的生物样品中的miR-629表达水平进行测定。在一个实施例中，该生物样品是血液、血清或血浆样品。在一个优选实施例中，生物样品是包括外周血单核细胞、淋巴细胞和单核细胞的血液样品。

miR-629表达在从响应抗-CD19抗体治疗的受试者获得的血液样品中比非响应受试者(例如，具有进行性疾病的受试者)的表达水平可以至少低约三至五倍或低约五至七倍。在另一个实施例中，miR-629表达在具有B细胞恶性肿瘤的受试者中比在健康的对照中至少高大约5、10、20、或30倍。使用任何本技术领域已知的方法来确定倍数变化值。在一个实施例中，倍数变化是通过使用在健康的志愿者中或抗-CD19抗体非响应受试者中的miR-629表达计算2^-ΔΔCt来确定的。

治疗方法的选择

如下文报道，在选择治疗方法的过程中，可以测试患有B细胞恶性肿瘤的受试者的miR-629表达。以具有相对于参考水平降低的miR-629表达为特征的患者被鉴定为响应抗-CD19抗体。

许多标准治疗方案可供选择的患者使用。这些治疗可以与本发明的方法联合使用。在特定的实施例中，抗-CD19治疗是与ICE(异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷)联合给予的。

CD19

人的分化簇(CD)抗原19的是一种B细胞特异性抗原，该抗原属于含有免疫球蛋白结构域的跨膜受体超家族。当CD19表达被下调时，CD19在B细胞上从原始B细胞至浆细胞阶段的其整个谱系中受到表达。CD19不在造血干细胞上或在祖B细胞阶段之前的B细胞上表达。重要的是，CD19的表达在B细胞的恶性转化之后得以维持，并且CD19在大多数B细胞恶性肿瘤上表达。CD19在B细胞恶性肿瘤上的广泛且相对稳定的表达使得此抗原成为基于mAb疗法的有吸引力的靶标。

抗-CD19抗体

通过表征存在其血液中的miR-629表达水平来鉴定具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者。一旦选择治疗，这样的受试者实际上可以被给予本技术领域内已知的任何抗-CD19抗体。合适的抗CD19抗体包括，例如，已知的抗CD19抗体、可商购的抗CD19抗体、或使用本领域熟知的方法开发的抗CD19抗体。

MEDI-551是具有强有力的ADCC效应子功能的CD19单克隆抗体。MEDI-551是CD19mAb抗-CD19-2的非岩藻糖基化的形式，是通过HB12b mAb的人源化和亲和力最优化发展来的(堪萨斯(Kansas)和特德(Tedder)，1991；矢泽(Yazawa)等人，2005；赫布斯特(Herbst)等人，2010)。MEDI-551是通过mAb抗CD19-2在岩藻糖转移酶缺陷的生产者细胞系中的表达产生的，这是一种产生具有对FccRIIIA增加的亲和力和增强的ADCC活性的均匀非岩藻糖基化mAb的过程(赫布斯特(Herbst)等人，《药理学与实验治疗学杂志》(J PharmacolExp Ther)，2010.335(1)：213-222)。

在某些实施例中，本文所述的方法和组合物利用抗-CD19抗体16C4或其抗原结合片段(参见(例如)美国出版号2008/0138336)，将其通过引用结合。16C4是一种CD19mAb，它显示具有有力的ADCC效应子功能。16C4是CD19单克隆抗体抗-CD19-2的非岩藻糖基化的形式，其是通过HB12b mAb的人类化和亲和力最优化发展来的(堪萨斯(Kansas G S)和特德(Tedder T F)，《免疫学杂志》(J Immunol)，1991；147：4094-4102；矢泽(Yazawa)等人，赫布斯特(Herbst)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci)，2005：102(42)：15178-15183；赫布斯特(Herbst)等人，《药理学与实验治疗学杂志》(J Pharmacol Exp Ther)，2010.335(1)：213-222)。16C4和MEDI-551都包括重链CDR，该重链CDR包含SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、和SEQ ID NO:4的氨基酸序列，以及轻链CDR，该轻链CDR包含SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、和SEQ ID NO:8。SEQ ID NO:2至4和SEQ ID NO:6至8的CDR被包括在SEQ ID NO:1的VH结构域和SEQ ID NO:5的VL结构域中。如此，本技术领域的技术人员将理解包括SEQ ID No:2至4和SEQ ID NO:6至8的CDR的抗体也可以被本发明的方法和组合物使用。

本披露涵盖是结合至人CD19的抗体16C4的衍生物的多种抗体。本领域的普通技术人员所已知的标准技术可以用于在编码一种抗体的核苷酸序列中引入突变(例如，添加、缺失和/或置换)，包括例如通常用于产生氨基酸置换的定点诱变和PCR介导的诱变。在一个实施例中，相对于16C4抗CD19抗体的原始VH和/或VK CDR，这些VH和/或VK CDR的衍生物可以包括小于25个氨基酸置换、小于20个氨基酸置换、小于15个氨基酸置换、小于10个氨基酸置换、小于5个氨基酸置换、小于4个氨基酸置换、小于3个氨基酸置换、小于2个氨基酸置换、或小于1个氨基酸置换。在另一个实施例中，这些VH和/或VK CDR衍生物可以具有在一个或多个预测的非必需的氨基酸残基(例如，对抗体特异性结合至人CD19不重要的氨基酸残基)上进行的保守性氨基酸置换。突变还可以例如通过饱和诱变，沿着所有或部分VH和/或VK CDR编码序列来随机引入，并且可以针对生物活性筛选生成的突变体以鉴别保留活性的突变体。诱变之后，可以表达编码的抗体并且可以测定该抗体的活性。两种氨基酸序列的百分比一致性可以通过本领域普通技术人员所已知的任何方法(包括但不限于BLAST蛋白质搜索)来测定。

在其它实施例中，该抗-CD19抗体被描述在例如美国专利申请出版物20130330328、20130183306、20110104150中，其中每一个都以其整体通过引用在此结合。在某些实施例中，本披露的抗-CD19抗体是已知的抗-CD19抗体，包括但不限于HD37(IgG1，κ)(Dako北美公司(DAKO North America,Inc.)，加利福尼亚州卡平特里亚(Carpinteria))、BU12(卡拉尔(Callard)等人，《免疫学杂志》(J.Immunology)，148(10)：2983-7(1992))、4G7(IgG1)(米克尔(Meeker等人，《杂交瘤》(Hybridoma)，3(4)：305-20(1984冬季))、J4.119(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，克雷费尔德，德国)、B43(PharMingen公司，加利福尼亚州圣地亚哥)、SJ25C1(BD PharMingen公司，加利福尼亚州圣地亚哥)、FMC63(IgG2a)(左拉(Zola)等人，《免疫Cell.细胞生物学》(Cell.Immunol.Cell.Biol.)，69(PT6)：411-22(1991)；尼克尔森(Nicholson)等人，《分子免疫学》(Mol.Immunol.)，34：1157-1165(1997)；彼得斯(Pietersz)等人，《癌症免疫学免疫治疗》(Cancer Immunol.Immunotherapy)，41：53-60(1995))、89B(B4)(IgG1)(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，佛罗里达州迈阿密；纳德勒(Nadler)等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.)，131：244-250(1983))、和/或HD237(IgG2b)(第四次人类白细胞分化抗原国际研讨会(Fourth International Workshop onHuman Leukocyte Differentiation Antigens)，奥地利维也纳，1989；以及佩楚托(Pezzutto)等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.)，138(9)：2793-2799(1987))。在其他实施例中，本披露的抗-CD19抗体是在美国专利申请好2008/0138336和2009/0142349以及美国专利号7,462,352和7,109,304中描述的任何抗-CD19抗体。在示例性实施例中，抗-CD19抗体是16C4抗体或其抗原结合片段，如美国专利申请公开号2008/0138336和下文所描述的。

本发明使用的抗体包括免疫球蛋白、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个不同表位结合片段形成的多特异抗体(例如，双特异抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、单域抗体、域抗体、Fab片段、F(ab')2片段、展现出所希望的生物活性的抗体片段(例如，抗原结合部分)、二硫键结合的Fvs(dsFv)，以及抗独特型(抗Id)抗体(包括(例如)针对本文披露的抗体的抗Id抗体)、细胞内抗体、以及任何以上的表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如含有至少一个抗原结合位点的分子。

抗-CD19抗体包含单克隆的人的、人源化的或嵌合的抗-CD19抗体。在本发明的组合物和方法中使用的抗-CD19抗体可以是裸抗体、免疫偶联物或融合蛋白。在某些实施例中，抗CD19抗体介导人抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞介导的细胞毒性(CDC)、和/或足以消耗循环B细胞的量的细胞凋亡。

当给予至人类，在本发明的方法中使用的抗-CD19抗体减少或消耗B细胞(例如恶性的B细胞)。B细胞的消耗可以是在循环B细胞中、或在特定的组织中，这些组织如但不限于骨髓、脾脏、肠相关淋巴样组织、和/或淋巴结。在一个实施例中，抗-CD19抗体可能消耗循环B细胞、血液B细胞、脾B细胞、边缘区B细胞、滤泡性B细胞、腹膜B细胞和/或骨髓B细胞。在一个实施例中，抗-CD19抗体消耗：祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞、大前B细胞、小前B细胞、未成熟的B细胞、成熟的B细胞、抗原刺激的B细胞、和/或浆细胞。通过(例如)以下来完成这种消耗：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、和/或通过阻断CD19与其预期配体的相互作用、和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、B细胞增生的抑制和/或B细胞死亡的诱导(例如，通过细胞凋亡)。

若需要，相对于亲本抗体，抗-CD19抗体被设计具有增加的ADCC活性。用于产生具有增强的ADCC活性的抗体变体的方法是本技术领域已知的并且在下文进行描述。在某些实施例中，抗-CD19抗体是具有增强的ADCC活性的非岩藻糖基化的抗体。

在某些实施例中，抗CD19抗体可以是具有IgG同种型、特别是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人同种型或在人群体中发现的任何IgG1、IgG2、IgG3或IgG4等位基因的人、人源化或嵌合抗体。人IgG类抗体具有多种有益的功能特征，例如在血清中的长半衰期和介导不同的效应子功能的能力(《单克隆抗体：原理与应用》(Monoclonal Antibodies:Principles andApplications)，威利-利斯公司(Wiley-Liss,Inc.)，第一章(1995))。人IgG类抗体被进一步分成以下4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4。该IgG1亚类在人类中具有高的ADCC活性和CDC活性(《化学免疫学》(Chemical Immunology)，65，88(1997))。

在其它实施例中，抗-CD19抗体是如以上所述的那些的已知的抗-CD19抗体的一种同种型转换变体(例如，转换成IgG1或IgG3人同种型)。在其它实施例中，抗-CD19抗体免疫特异性地结合至人CD19，并且具有如使用本技术领域的技术人员所已知的方法(例如，BIAcore试验，ELISA)(Biacore International AB公司，瑞典(Sweden)乌普萨拉(Uppsala))评估的小于3000pM、小于2500pM、小于2000pM、小于1500pM、小于1000pM、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于100pM、小于75pM的解离常数(K_D)。在其它实施例中，本披露的抗-CD19抗体可能免疫特异性地结合至人CD19抗原，并且可能具有如使用本技术领域的技术人员所已知的方法(例如，BIAcore试验，ELISA)评估的在25至3400pM、25至3000pM、25至2500pM、25至2000pM、25至1500pM、25至1000pM、25至750pM、25至500pM、25至250pM、25至100pM、25至75pM、25至50pM之间的解离常数(K_D)。在某些实施例中，本披露的抗CD19抗体可以免疫特异性地结合至人CD19，并且可以具有如使用本领域的技术人员所已知的方法(例如，BIAcore测定，ELISA)所评定的为500pM、100pM、75pM或50pM的解离常数(K_D)。

工程化效应子功能

若需要，被鉴定为响应抗-CD19抗体疗法的受试者被给予关于效应子功能修饰过的抗-CD19抗体，以至于(例如)增强该抗体在治疗B细胞恶性肿瘤中的有效性。一种示例性效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC，它是这样一种细胞介导的反应：其中非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后导致该靶细胞溶解。这些细胞毒性细胞或效应细胞可以是表达一种或多种FcR的白细胞。效应子细胞在小鼠中表达至少FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。介导ADCC的人白细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞。这些细胞中，用于介导ADCC的原代细胞是自然杀伤细胞，其表达FcγRIII。单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。FcR在造血细胞上的表达概述于拉文奇(Ravetch)和基内特(Kinet)，《免疫学年度评论》(Annu.Rev.Immunol.)，9：457-92(1991)中。

用于增强抗体的效应子功能的一种方法是通过生产工程化的糖型。工程化的糖型是通过技术本领域的技术人员已知的任何方法来产生，例如，通过使用工程化的或变体的表达菌株、通过与一种或多种酶(例如，DI N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTI11))进行共表达、通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含Fc区的分子，或通过在该包含Fc区的分子被表达之后修饰一种或多种碳水化合物。产生工程化的糖型的方法是本技术领域已知的，并且包含但不限于那些被描述在乌马纳(Umana)等人，1999，《自然生物技术》(Nat.Biotechnol)，17：176-180；戴维斯(Davies)等人，2001，《生物技术生物工程》(Biotechnol Bioeng)，74：288-294；希尔兹(Shields)等人从，2002，《生物化学杂志》(JBiol Chem)，277：26733-26740；新川(Shinkawa)等人，2003，《生物化学杂志》(J BiolChem)，278：3466-3473；美国专利号6,602,684；美国专利申请出版号2003/0157108(美国申请号10/277,370从)；美国专利申请出版号2003/0003097(美国申请号10/113,929)；PCT WO00/61739 A1；PCT WO 01/292246 A1；PCT WO 02/311140 A1；PCT WO 02/30954 A1；Potillegent.TM.技术(Biowa公司，新泽西州普林斯顿)；《GlycoMAb.TM.糖基化工程技术》(GlycoMAb.TM.glycosylation engineering technology)(GLYCART生物技术公司，瑞士苏黎世)，其中每一个以其整体通过引用结合在此。参见(例如)WO 00061739；EA 01229125；US20030115614；冈崎(Okazaki)等人，2004，《分子生物学杂志》(JMB)，336：1239-49，其中每一个以其整体通过引用结合在此。还可以进行一个或多个氨基酸置换，氨基酸置换导致存在于Fc区中的糖基化位点(例如，IgG的天冬酰胺297)的消除。此外，无糖基化的抗体可以在缺乏必要的糖基化机器(machinery)的细菌细胞中产生。

还可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减小量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化的抗体或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。已证明，这类改变的糖基化模式增大了抗体的ADCC能力。这类碳水化合物修饰可以通过，例如在具有改变的糖基化体系的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化体系的细胞已经在本领域中予以描述并且可被用作宿主细胞，在那里以表达本披露的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见(例如)希尔兹(Shields,R.L.)等人，2002，《生物化学杂志》Chem.277：26733-26740；乌马纳(Umana)等人，1999，《自然生物技术》(Nat.Biotech.)，17：176-1；以及美国专利号6,946,292；欧洲专利号：EP 1,176,195；PCT出版物WO 03/035835以及WO 99/54342，其中每一个以其整体通过引用结合在此。

在一个实施例中，抗CD19抗体包含变体Fc区，该区介导增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一个实施例中，抗CD19抗体包含具有连接至Asn297的多个复杂的N-糖苷连接的糖链的一个Fc区，其中岩藻糖未结合至在还原端中的N-乙酰葡糖胺，其中所述Fc区介导增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

本技术领域已知的体外试验可以用于确定在本披露的组合物和方法中使用的抗-CD19抗体是否能够介导ADCC。示例性试验描述在美国专利号5,500,362或美国专利号5,821,337中。特别地，用于这类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，感兴趣的分子的ADCC活性可以例如在如克莱因斯(Clynes)等人，美国国家科学院院刊，95：652-656(1998)中披露的动物模型中进行体内评定。该测定还可以使用可商购的试剂盒，例如CytoTox 96TM(普洛麦格公司(Promega))来进行。

B细胞恶性肿瘤

B细胞恶性肿瘤的特征是特异性B细胞亚群的病理性扩张，例如，前体B细胞急性淋巴母细胞白血病的特征是对应于祖B细胞/前B细胞发育阶段的B细胞异常扩张。这些恶性B细胞维持正常B细胞标志物如CD19的细胞表面表达。抗CD19抗体因此可以消耗人受试者中的恶性B细胞。

在此所述的包括抗-CD19抗体的疗法可以用于治疗B细胞疾病，包括B细胞恶性肿瘤。示例性的B细胞恶性肿瘤包括但不限于：B细胞亚型非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括低级/滤泡性NHL、小淋巴细胞(SL)NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级弥漫性NHL、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴母细胞NHL、高级小无裂细胞NHL、套细胞淋巴瘤、以及大块疾病NHL；伯基特淋巴瘤；多发性骨髓瘤；前B急性淋巴母细胞白血病以及从早期B细胞前体衍生的其他恶性肿瘤；常见的急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括免疫球蛋白突变的CLL和免疫球蛋白未突变的CLL；毛细胞白血病；Null型急性淋巴母细胞白血病；瓦氏巨球蛋白血症；弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，包括生发中心B细胞样(GCB)DLBCL、活化的B细胞样(ABC)DLBCL、以及3型DLBCL；幼淋巴细胞白血病(pro-lymphocytic leukemia)；轻链病；浆细胞瘤；骨硬化性骨髓瘤；浆细胞白血病；意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)；焖燃性多发性骨髓瘤(SMM)；惰性多发性骨髓瘤(IMM)；霍奇金淋巴瘤，包括经典和结节性淋巴细胞主导型；淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)；以及边缘区淋巴瘤，包括胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤。

还涵盖对这些癌症的复发的治疗。淋巴细胞为主型霍奇金病(LPHD)是一个霍奇金疾病类型，该疾病类型尽管放疗或化疗治疗，还是倾向于频繁复发。慢性淋巴细胞性白血病是白血病的四种主要类型中的一种。一种成熟B细胞(叫做淋巴细胞)的癌症慢性淋巴细胞性白血病体现为血液、骨髓以及淋巴组织中的细胞的渐进性累积。惰性淋巴瘤是一种生长缓慢的、不可治愈的疾病，其中受试者在多个周期的缓解和复发之后平均生存6至10年之间。

B细胞消耗的所希望的水平将取决于疾病。在一个实施例中，作为抗-CD19抗体的靶标的B细胞消耗足以减少或消除疾病的进展。疾病进展是通过内科医师进行评估，例如，通过监测肿瘤的生长(大小)、癌细胞类型的增生、转移、和/或通过监测特定癌症的其他信号和症状。在一个实施例中，B细胞消耗足以减少或消除疾病的进展持续至少2、3、4、5、或6个月。在其他实施例中，B细胞消耗是足以增加缓解时间至少6、9、或12个月，甚至约2、3、4、或5年。在其它实施例中，B细胞消耗足以治愈该疾病。在某些实施例中，癌症受试者的B细胞消耗减少恶性B细胞的数量和水平，该减少是减少治疗前基线水平的至少约50％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或甚至100％。

用于评估对瘤的治疗的功效或成功的参数将是内科医师(例如，肿瘤学家)所已知的。一般情况下，内科医师将会寻找疾病进展的减少、缓解期的增加、稳定性疾病的存在。对于B细胞瘤，可测量的指标可以包括，例如疾病进展的时间、总体和/或无进展生存期的持续时间的增加。在白血病的情况下，可以进行骨髓活检以确定缓解的程度。完全缓解可被定义为，在治疗之后30天，在受试者骨髓中发现白血病细胞组成了所有细胞的不到5％。

以下参考文献描述了淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病、它们的诊断、治疗以及用于测量治疗功效的标准医学程序。卡内洛斯(Canellos G P)、李斯特(Lister T A)、斯克拉(Sklar J L)：《淋巴瘤》(The Lymphomas).W.B.Saunders公司，费城(Philadelphia)1998；van Besien K和Cabanillas F：《非霍奇金淋巴瘤的临床表现、阶段和治疗》(ClinicalManifestations,Staging and Treatment ofNon-Hodgkin's Lymphoma)，第七十章，pp1293-1338，在：《血液学：基本原理和实践》(Hematology,Basic Principles andPractice)，第三版，霍夫曼(Hoffman)等人(编辑).Churchill Livingstone公司，费城(Philadelphia)，2000；以及拉伊(Rai K)和帕特尔(Patel D)：《慢性淋巴细胞性白血病》(Chronic Lymphocytic Leukemia).第七十二章，pp 1350-1362，在：《血液学：基本原理和实践》(Hematology,Basic Principles and Practice)，第三版，霍夫曼(Hoffman)等人(编辑).Churchill Livingstone公司，费城(Philadelphia)，2000。

试剂盒

本发明提供试剂盒，这些试剂盒用于表征受试者对抗-CD19抗体治疗的响应性。

在一个实施例中，该试剂盒包含治疗性组合物，该组合物包含以单位剂型的、特异性地结合CD19多肽的、有效量的抗体。

本发明的诊断试剂盒提供试剂(例如，用于miR-629和管家参考基因的TaqMan引物/探针)用于测量miR-629的相对表达。

在一些实施例中，该试剂盒包括包含治疗性或诊断性组合物的无菌容器；此类容器可以是盒、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或其他适合的本领域已知的容器形式。此类容器可以是由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或其他适用于容纳药物的材料制成的。

在一个实施例中，本发明的试剂盒包括测量miR-629表达和抗-CD19抗体的试剂。若需要，该试剂盒进一步包括测量miR-629表达的说明和/或向具有B细胞恶性肿瘤(如选择作为响应抗-CD19抗体治疗的恶性肿瘤)的患者给予抗-CD19抗体治疗的说明书。在其他实施例中，这些说明书包括以下各项中的至少一种：治疗剂的描述；用于治疗或预防B细胞恶性肿瘤或其症状的剂量日程表和给予；注意事项；警告信息；适应症；禁忌症；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。这些说明书可以直接打印在容器(当存在时)上，或作为标签应用于容器，或作为单独的页、小册子、卡片、或在容器中或一起提供的文件夹。

抑制性核酸

抑制性核酸分子是那些抑制核酸分子或多肽表达的寡核苷酸。如在下面详细报道，本发明提供了一种方法，该方法通过测量血样中miR-629表达来鉴定响应抗-CD19抗体治疗的受试者的B细胞恶性肿瘤，其中对相对于参考miR-629表达降低的检测鉴定具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者。鉴于这一发现，很有可能，在受试者中减少miR-629表达将诱导或增强受试者的抗-CD19抗体响应性。

因此，本发明提供靶向miR-629的单链和双链抑制性核酸分子(如DNA、RNA、和其类似物)并且降低其表达。示例性抑制性核酸分子包括siRNA、shRNA、和反义RNA。

siRNA

短的21至25核苷酸双链RNA对下调基因表达有效(赛摩(Zamore)等人，《细胞》(Cell)，101：25-33；Elbashir等人，《自然》(Nature)，411：494-498，2001，通过引用在此结合)。已证明在哺乳动物体中siRNA方法的治疗效果，参见麦卡弗里(McCaffrey)等人，《自然》(Nature)，418：38-39，2002。

鉴于miR-629的序列，siRNA可以被设计用来减少miR-629表达。可以向受试者系统地给予这样的siRNA以减少miR-629表达。使用靶向miR-629的21至25核苷酸siRNA(例如)作为治疗剂以治疗B细胞恶性肿瘤。

本发明的抑制性核酸分子可被作为双链RNA用于RNA干扰(RNAi)介导的表达敲抵。RNAi是一种用于降低感兴趣的特定蛋白质的细胞表达的方法(参见图施(Tusch1)，《化学与生物化学》(ChemBioChem)，2：239-245，2001；夏普(Sharp)《基因与发育》(Genes&Devel.)，15：485-490，2000；胡特瓦格纳(Hutvagner)和赛摩(Zamore)，《遗传学与发育新观点》(Curr.Opin.Genet.Devel.)，12：225-232，2002；以及汉诺(Hannon)，《自然》(Nature)，418：244-251，2002)。通过dsRNA转染或通过使用基于质粒表达系统表达siRNA将siRNA引入细胞已经越来越多地被用来在哺乳动物细胞中创建功能缺失表型。

在本发明的一个实施例中，双链RNA(dsRNA)分子被做成包括本发明的核苷碱基寡聚物的八至十九个连续核苷碱基。dsRNA可以是具有两条不同链的双链RNA，或自我双链化的单链RNA(小发夹(sh)RNA)。典型地，dsRNA是大约21或22个碱基对，但如果需要可以更长或更短(达到大约29个碱基对)。dsRNA可以使用标准的技术(如化学合成或体外转录)制得。试剂盒可从(例如)阿姆比恩公司(Ambion)(德克萨斯州奥斯丁)和恩皮森特公司(Epicentre)(威斯康星州麦迪逊)购得。在哺乳动物细胞中表达dsRNA的方法描述在布鲁莫卡帕(Brummelkamp)等人，《科学》(Science)，296：550-553，2002；帕蒂森(Paddison)等人，《基因与发育》(Genes&Devel.)，16：948-958，2002.保罗(Paul)等人，《自然生物技术》(Nature Biotechnol.)，20：505-508，2002；Sui等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)，99：5515-5520，2002；于(Yu)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)，99：6047-6052，2002；宫木(Miyagishi)等人，《自然生物技术》(Nature Biotechnol.)，20：497-500，2002；以及李(Lee)等人，《自然生物技术》(NatureBiotechnol.)，20：500-505，2002，其中每一个通过引用结合在此。

小发夹RNA(shRNA)包括具有茎环结构的RNA序列。“茎环结构”是指具有二级结构的核酸，该核酸包括已知或预测形成双链或双链体(茎部)的核苷酸区域，其连接在主要为单链的核苷酸(环部)区域的一侧。术语“发夹”也被用来指茎环结构。这样的结构在技术领域中是熟知的，并且一致性地使用该术语在本领域内其已知的意义。正如在本领域中所知，二级结构不需要精确的碱基配对。因此，茎部可以包括一个或多个碱基错配或突起。可替代地，碱基配对可以是准确的，即不包括任何错配。多个茎环结构可以通过接头相互连接，例如，核酸接头、miRNA的侧翼序列、其它分子、或它们的某种组合。

如在此使用的术语“小发夹RNA”包括常规的茎环shRNA前体，其形成前导miRNA(前miRNA)。虽然可以在范围内有一些变化，常规的茎环shRNA可包括19至29bp的茎，和4至30bp的环。shRNA可以从DNA载体表达以提供持续的沉默和高产递送至几乎所有的细胞类型中。在一些实施例中，该载体是病毒载体。示例性病毒载体包括逆转录病毒，包括慢病毒、腺病毒、杆状病毒和禽病毒性载体，并且包括允许稳定的单拷贝基因组整合的这样的载体。逆转录病毒质粒载体可以来源于逆转录病毒，逆转录病毒包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒、和乳腺肿瘤病毒。逆转录病毒质粒载体可以用于转导包装细胞系以形成生产细胞系。可被转染包装细胞的实例包括但不限于，PE50l、PA3l7、R-2、R-AM、PA12、T19-14x、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、和DNA细胞系，如描述在米勒(Miller)的《人类基因治疗》(Human Gene Therapy)1：5-14(1990)，其通过引用以其整体结合在此。该载体可以通过本领域已知的任何方式转导包装细胞。生产细胞系产生传染性逆转录病毒载体颗粒，其包括编码DNA复制蛋白的多核苷酸。然后可以使用此类逆转录病毒载体颗粒转导真核细胞，无论是在体外或体内。转导的真核细胞将表达DNA复制蛋白。

包含本发明的反义序列的催化RNA分子或核酶可用于抑制核酸分子的体内表达。包含核酶序列在反义RNA中赋予它们RNA切割活性，从而增加了构建体的活性。靶标RNA特异性核酶的设计和使用被描述在Haseloff等人，《自然》(Nature)334：585-591，1988，以及美国专利申请出版号2003/0003469A1，其中每一个通过引用结合在此。

因此，本发明的特征是催化性RNA分子，其包括在结合臂中的含有八至十九个碱基的反义RNA。在本发明的优选实施例中，催化性核酸分子是在锤头或发夹基序中形成的。这种锤头基序的实例被描述在罗西(Rossi)等人，《艾滋病研究与人类逆转录酶病毒》(AidsResearch and Human Retroviruses)8：183，1992。发夹基序的实例被描述在汉佩尔(Hampel)等人于1989年9月20日提交的“用于切割特定的RNA序列的RNA催化剂(RNACatalyst for Cleaving Specific RNA Sequences)”，这是提交于1988年9月20日的美国系列号07/247,100的一个延续的部分，佩尔(Hampel)和特里茨(Tritz)，《生物化学》(Biochemistry)，28：4929，1989，以及汉佩尔(Hampel)等人，《核酸研究》(Nucleic AcidsResearch)，18：299，1990。这些特定的基序不受本发明的限制并且本技术领域的技术人员会认识到，所有在本发明的酶促核酸分子中重要的是，它具有特定的与一个或多个靶基因的RNA区域互补的底物结合位点，并且在底物结合位点上或周围它具有赋予该分子RNA切割活性的核苷酸序列。

本质上，可以应用任何一种方法用于将核酸构建体引入细胞。引入核酸的物理方法包括注入含有构建体的溶液，被构建体包被的颗粒的基因枪转化，在核酸溶液中浸泡细胞、组织样本或生物体，或在构建体存在下电穿孔细胞膜。可以使用包装成病毒颗粒的病毒构建体来完成将表达构建体有效的引入细胞和编码shRNA转录。可以使用其它在本技术领域已知的用于在细胞中引入核酸的方法，例如脂质介导的载体运输、化学介导的运输如磷酸钙等。因此，编码shRNA的核酸构建体可以与进行一个或多个以下的活动的组件一起被引入：增强细胞吸收RNA，促进双链退火，稳定退火的链，或另外提高靶标基因的抑制作用。

对于细胞内的表达，可以应用DNA载体，例如含有RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ启动子的质粒载体。内源性miRNA的表达由RNA聚合酶II(Pol II)启动子控制并且在某些情况下，相比RNA聚合酶III启动子，shRNA被RNA聚合酶II启动子驱动最有效(迪金斯(Dickins)等人，2005，《自然遗传学》(Nat.Genet.)39：914-921)。在一些实施例中，该shRNA的表达可以通过诱导型启动子或条件表达系统来控制，包括但不限于，RNA聚合酶II型启动子。在本发明背景下有用的启动子的实例是四环素诱导型启动子(包括TRE密封的)、IPTG诱导型启动子、四环素反式激活因子系统、和反面的四环素反式激活因子(rtTA)系统。也可以使用组成型启动子，如细胞或组织特异性启动子。许多启动子是普遍存在的以至于它们在所有细胞和组织类型中表达。一个特定的实施例使用四环素响应启动子，这是一个在体外和体内研究中最有效的条件型基因表达系统。参见国际专利申请PCT/US 2003/030901(出版号WO2004-029219A2)以及Fewell等人，2006，《今日药物发现》(Drug Discovery Today)11：975-982，其中每个通过引用结合在此，用于说明诱导性shRNA。

多核苷酸递送

裸多核苷酸或其类似物能够进入哺乳动物细胞并且抑制感兴趣的基因的表达。然而，理想的是利用配制品来帮助将寡核苷酸或其它核碱基寡聚物递送至细胞(参见(例如)美国专利号5,656,611、5,753,613、5,785,992、6,120,798、6,221,959、6,346,613、以及6,353,055，其中每一个通过引用结合在此)。

除非另外指明，本发明的实施采用很好地处在熟练业内人士的见识范围之内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这样的技术在文献中被充分阐明，例如，“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)”，第二版(Sambrook,1989)；“寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)”(Gait,1984)；“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”(Freshney,1987)；“酶学方法(Methods in Enzymology)”“实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)”(Weir,1996)；“用于哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells)”(Miller and Calos,1987)：“分子生物学现代方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)”(Ausubel,1987)：“PCR：聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)”(Mullis,1994)；“免疫学现代方法(Current Protocols inImmunology)”(Coligan,1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，并且按照这样，可以被考虑用于制备和实施本发明。对具体实施例特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。

给出以下的实例是为了给本领域普通技术人员提供如何准备和使用测试、筛选和本发明的治疗方法的一个完整的公开和说明，而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的发明的范围。

实例

实例1：miR-629水平在抗-CD19抗体敏感的细胞系中降低。

使用体外抗体依赖性细胞毒性(ADCC)试验，一些人类非霍奇金B细胞淋巴瘤细胞系被鉴定为对于抗-CD19抗体治疗具有高或低敏感性。特别地，Karpas-422、人B细胞非霍奇金淋巴瘤、Oci-Ly-19、弥漫性大细胞淋巴瘤、SUD-HL-6、滤泡性B细胞淋巴瘤(CRL2959^TM)、和托莱多(Toledo)细胞系、非霍奇金淋巴瘤模型系统被鉴定为对于抗-CD19抗体治疗具有高敏感性。与此相反，DB(弥漫性大细胞淋巴瘤)、ARH-77(EBV-转化的B淋巴母细胞样细胞系)、和RL(非霍奇金淋巴瘤B细胞系)被鉴定为对于抗-CD19抗体治疗具有低敏感性。

这些细胞系通过分析它们的微小RNA表达被表征。微小RNA/miRNA是抑制多个靶标mRNA翻译的小单链RNA分子。对于miRNA的作用在心血管疾病、糖尿病、癌症和其它疾病中被鉴定。对于miRNA在预测对各种治疗方法的响应中的作用还不太了解。

有趣地，鉴定到17个miRNA在对于抗-CD19抗体治疗具有不同敏感性的弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL或DLBL)细胞系之间表达不同。使用多个平台包括Affymetrix miRNA微阵列和TaqMan qPCR观察到这些差异。

以下微小RNA具有显著的不同：miR-629；miR-99b；miR-let-7e；miR-15a；和miR-29a。最大的显著不同是在于miR-629的表达。对于抗-CD19抗体治疗具有高敏感性的弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系中(图1A和1B)miR-629表达水平比对于抗-CD19抗体具有低敏感性的细胞系显著更低。在确定低与高敏感性中，高敏感性细胞系的EC50在体外ADCC试验中比低敏感性细胞系至少低100倍(在其他情况下是1000倍或更多)。

总之，对使用抗-CD19抗体(MED-551)的体外ADCC试验具有高敏感(n＝4)与低敏感(n＝3)的细胞系之间的miR-629表达具有显著差异。这种效应似乎对于抗CD19抗体响应性是特异的。miR-629表达的改变与利妥昔单抗的响应性不相关。

实例2：miR-629表达在响应抗-CD19抗体治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中降低。

在基线全血样品中测量miR-629表达水平，这些全血样品采自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、以及慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者，这些患者在临床试验号CP204中使用抗-CD19抗体治疗作为单一药剂进行治疗，该临床试验是第1期在具有复发性或难治性晚期B细胞恶性肿瘤的成人患者中进行的MEDI-551(直接针对CD19的人源化单克隆抗体)的剂量递增研究。

接受抗-CD19抗体治疗的患者被分成具有完全或部分响应。

·CR/PR(完全或部分响应)：5个弥漫性大B细胞淋巴瘤、6个滤泡性淋巴瘤、3个慢性淋巴细胞性白血病

·PD(进行性疾病)：10个弥漫性大B细胞淋巴瘤、2个滤泡性淋巴瘤、以及3个慢性淋巴细胞性白血病

·SD(稳定的疾病)：4个弥漫性大B细胞淋巴瘤、3个滤泡性淋巴瘤、以及9个慢性淋巴细胞性白血病

在接受MEDI-551或利妥昔单抗+苯达莫司汀(CP-1019)治疗的慢性淋巴细胞性白血病患者中的基线外周血单核细胞(PBMC)样品中测量miR-629表达水平。

·22个MEDI-551治疗的患者(10CR/PR；3PD；4SD)

·12个利妥昔单抗治疗的患者(6CR/PR；2PD；2SD)

出人意料地，对于抗-CD19抗体治疗完全或部分响应(CR/PR)的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中的miR-629表达比非响应者(PD)显著更低(约7倍)(图2)。在抗-CD19抗体治疗前的全血样品中测量miR-629表达。总之，第I期临床试验数据证明对于抗-CD19抗体(MEDI-551)响应的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中的基线miR-629表达更低。有趣地，相比从正常的对照组受试者中获得的血液样本中的miR-629水平，在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的样品中miR-629表达显著增加。

比较了使用抗-CD19抗体(MEDI-551)加ICE/DHAP或者利妥昔单抗加ICE/DHAP治疗的患者之间的miR-629表达水平。相比那些响应抗-CD20抗体治疗联合ICE/DHAP的患者，在响应抗-CD19抗体治疗联合ICE(异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷)/DHAP给药的患者中，miR-629水平被表征为增加或降低。相比响应利妥昔单抗治疗的患者，这些研究也将表征在响应抗-CD19抗体的DLBCL患者中特异地降低的miR-629的任何改变。这些研究结果显示于图5中。

实例3：miR-629表达在响应抗-CD19抗体治疗的滤泡性淋巴瘤患者中降低。

在接受抗-CD19抗体治疗前的滤泡性淋巴瘤患者中获得的全血样品中测量了miR-629表达水平。miR-629表达在滤泡性淋巴瘤血液中明显高于正常血液。

在响应抗-CD19抗体治疗(CR/PR)的滤泡性淋巴瘤患者中获得的全血样品中miR-629表达比滤泡性淋巴瘤的非响应者(PD)显著更低(约5倍)在(图3)中。

实例4：miR-629表达在慢性淋巴细胞性白血病患者中增加

相比从正常对照组受试者中获得的血液，在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者中获得的全血中miR-629表达增加。初步结果显示，miR-629表达在响应抗-CD19抗体治疗(CR/PR)的慢性淋巴细胞性白血病患者中获得的全血样品中比慢性淋巴细胞性白血病非响应者更低(图4)。这些初步的观察结果将在另外的患者中得到证实。

实例5：初步数据显示miR-629表达在响应抗-CD19抗体-ICE(苯达莫司汀(bendamustine))治疗的慢性淋巴细胞性白血病患者中降低。

从慢性淋巴细胞性白血病患者在接受治疗前获得的全血中测量了miR-629表达。对患者对利妥昔单抗-ICE治疗与抗-CD19抗体-ICE治疗的响应进行了表征(图5A和5B)。尽管样品量小，没有发现在接受利妥昔单抗-ICE治疗的CR/PR和PD患者之间的miR-629表达水平之间的关联(图5B)。与此相反，miR-629表达水平在抗-CD19抗体-ICE响应的慢性淋巴细胞性白血病患者中更低。

实例6：miR-629表达在响应抗-CD19抗体治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中更低

miR-629表达在对于抗-CD19抗体(MEDI-551)具有高敏感性的弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系中更低(图5C)。基于它们对利妥昔单抗的敏感性在弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系中没有观察到这样的关联(图5D)。在CP1088试验中的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中产生了类似的观察。(图5E)

从弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受治疗前获得的全血样品中测量了miR-629表达。19名患者随后接受了抗-CD19抗体(MEDI-551)和化疗(ICE或DHAP)治疗。17名患者接受了利妥昔单抗治疗。有趣地，miR-629表达在响应抗-CD19抗体(MEDI-551)治疗(CR/PR)的患者中相比非响应者(SD/PD)显著更低(约4倍)(图5E)。这是真实的，不论患者是否接受2mg/kg或4mg/kg的抗-CD19抗体(MEDI-551)(图5E和5F)的治疗。关于利妥昔单抗的响应性没有观察到这样的关联(图5E)。

实例7：miR-629表达水平在不响应抗-CD19抗体治疗的患者中增加。

有趣地，miR-629表达水平在对于抗-CD19抗体响应的DLBCL受试者中在治疗前和治疗后相似(图6A和6B)。与此相比，在具有进行性疾病(PD)的患者的治疗后，miR-629表达水平倾向于增加(图6C)。这些结果表明miR-629在抗-CD19抗体(MEDI-551)的响应性中起到特异性作用，以至于癌症进展与此微小RNA水平相关联。

实例8：miR-629表达相比健康的对照在淋巴瘤患者中更高。

当使用TaqMan定量PCR(图7B)或使用miRNA微阵列分析(图7A)时，相比健康的志愿者，miR-629在所有淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤与滤泡性淋巴瘤)患者中更高。在实例1-6中，通过TaqMan定量PCR测量了miR-629。

在淋巴瘤血液中的miR-629的来源不明。然而，不可能在弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或慢性淋巴细胞性白血病中反应B细胞在数量上的改变。在弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或慢性淋巴细胞性白血病患者中没有观察到miR-629水平和基线B细胞计数(CD19或CD20)之间的关联。

相比健康的全血，miR-629在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的全血中有更大程度的表达(最小16倍)。相比其它细胞类型，miR-629水平在正常的单核细胞和B细胞中更高。miR-629表达在CD14⁺和CD19⁺细胞中更高。相比在弥漫性大B细胞淋巴瘤/滤泡性淋巴瘤患者中观察到的，这些水平保持非常地更低(图8)。

实例9：miR-629过量表达防范化疗诱发的细胞凋亡和细胞增生损失

使用如图9A所示的miR-629表达载体产生miR-629过量表达Karpas-422细胞系。Karpas-422细胞是具有低水平miR-629的DLBCL细胞系，并且在体外ADCC试验中对于抗-CD19抗体(MEDI-551)高度敏感。该细胞也表达提供视觉监控miR-629表达水平的GFP报道子(图9B)。使用miR-629表达载体或不包含miR-629前体插入的对照载体转染细胞。然后基于GFP表达通过FACS分选这些细胞为miR-629高和miR-629低表达群体。表达miR-629的单细胞克隆通过有限稀释产生。miR-629表达的相对水平如图9C所示。

图10A和10B显示在miR-629过量表达的Karpas-422淋巴瘤细胞中的半胱天冬酶激活。有趣地，miR-629过量表达保护Karpas-422淋巴瘤细胞免受化疗(依托泊苷)诱发的细胞凋亡(图10A和10B)。

miR-629过量表达也保护Karpas-422淋巴瘤细胞免受化疗(依托泊苷)诱发的细胞增生损失(图11A和11B)。相应地，在B细胞恶性肿瘤中降低miR-629水平的方法预期将恢复细胞对化疗的敏感性(即化疗降低细胞增生和增加细胞凋亡的能力)。

实例10：miR-629过量表达增加自发的乳酸脱氢酶(LDH)释放

miR-629过量表达与体外自发的LDH释放的增加和体外ADCC试验中抗-CD19抗体治疗的Ec50的稍微改变相关联(图12A和12B)。

实例11：基线miR-629表达预测对MEDI-551和化疗的响应

图13提供接受抗-CD19抗体(MEDI-551)或利妥昔单抗治疗的患者的响应与miRNA签名表达(在治疗前的PBMC样品中测量并且以相对于健康的志愿者的倍数变化显示)的逻辑回归分析。只有具有miRNA数据和≥1的后基线疾病评估的患者被包括在分析中。图13中显示的曲线代表基于回归模型的跨miRNA签名水平的响应的预测概率。2条曲线的交叉(指示治疗与生物标志物的相互作用)表明miRNA签名可能是对于抗-CD19抗体(MEDI-551)在慢性淋巴细胞性白血病中的响应性的一个预测性生物标志物。基线miR-629表达预测对于抗-CD19抗体(MEDI-551)和化疗的、但不是利妥昔单抗和化疗(ICE-苯达莫司汀)的响应。

实例12：改变miR-629表达的效果。

探索了改变miR-629对于抗-CD19抗体(MEDI551)治疗的敏感性的效果。人类白血病和淋巴瘤细胞系道迪(Daudi)、托莱多(Toledo)和RL是从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得；Karpas 1106P、Karpas 422、OCI-Ly-19、MEC2是从德国微生物和细胞培养(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ，德国)获得。使用PrimeFect(龙沙(Lonza))将50uM的miR-629模拟品(Karpas 1106P、Karpas 422、道迪、MEC2、OCI-Ly-19、SU-DHL-6、和托莱多)、miR-629发夹抑制剂(RL和ARH-77)、或相应的阴性对照寡核苷酸(全部从Dharmacon获得)转染细胞系24小时。使用它们各自的荧光标记的单克隆抗体，通过流式细胞术(LSRII，BD生物科学公司)测定CD19和CD20表面表达。表面表达被报道为平均荧光强度(MFI)并且对非转染的以及miR-629和阴性对照转染细胞进行平均。当miR-629过量表达，MEC-2和道迪细胞系显示对于抗-CD19抗体(MEDI551)15％-25％降低的敏感性(图14A和14B)，同时在托莱多和SU-DHL-6细胞系中观察到细胞毒性15％-20％的差异(图14C和14D)。

在对于抗-CD19抗体(MEDI551)敏感性不同的九个细胞系中分析了在CD19和CD20表面表达的过量表达的miR-629的效果(图15A和15B)。使用别藻蓝蛋白(APC)共轭的抗体测量了CD19和CD20表达。在对照转染细胞、miR转染细胞、和未转染细胞中测量了平均荧光强度(MFI)比值。在响应miR-629过量表达中观察到在CD19或CD20表面表达无变化。这表明，CD19、CD20的表达改变不说明细胞对于抗-CD19抗体(MEDI551)的敏感性差异。

实例13：在R-CHOP微小RNA签名和抗CD19抗体(MEDI-551)微小RNA签名(miR-629表达)之间不存在关联。

显示miRNA签名以预测使用化学治疗剂组合R-CHOP(其包括利妥昔单抗、环磷酰胺、羟基柔红霉素(或阿霉素)、长春新碱以及泼尼松龙)治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中增加的生存率(阿伦卡尔(Alencar)等人，《临床癌症研究》(Clin.CancerRes.)2011；17：4125-35)。在从DLBCL患者的基线血液样品中的这个签名表达与miR-629的表达之间没有观察到关联性(图16)。该结果支持了临床上观察到的与MEDI-551响应关联的miRNA签名的特异性。

实例14：在外排体中观察到miR-629。

外排体是被大多数(如果不是全部)细胞类型、包括肿瘤细胞释放到生物体液中的细胞衍生的囊泡。证据表明，外排体介导的细胞间通讯在涉及肿瘤发生和发展的过程中的关键作用。利用全外排体分离试剂盒(Total Exosome Isolation kit)(英杰公司(Invitrogen)，类别号#4478359)，从稳定地过量表达miR-629或miRNA打乱型对照的Karpas-422细胞系的上层清夜分离外排体。收获细胞培养基并且在2000xg下旋转30分钟以去除细胞和碎片。无细胞的培养基转移至新的管子并且用0.5体积的全外排体分离试剂(Total Exosome Isolation reagent)处理。通过移液或涡旋来混合培养基和试剂直到获得均一的溶液。将样品在4℃孵育过夜。孵育后，将样品在10000xg和4℃下旋转1小时。上清液吸出并丢弃，并且沉淀的外排体重新悬浮于0.2体积的外排体悬浮缓冲液(ExosomeResuspension Buffer)中(英杰公司，类别号#4478545)。将重悬的的外排体在室温下孵育5-10分钟。将变性溶液预热至37℃，并且添加1体积的量至外排体悬浮液。该溶液是在冰上孵育10分钟，然后使用与开始的外排体样品体积成比例的1体积的酸：苯酚：氯仿进行萃取。将样品涡旋30-60秒并且在13000xg室温下旋转5分钟。将水相转移至新的管子并且向每个样品添加1.25体积的乙醇。彻底搅拌后，700uL样品被放置到Zymo柱(Zymo Research公司，ZR RNA MicroPrep，类别号#R1060/R1061)上并且在10000xg下旋转15秒。重复此过程直到所有的裂解液通过过滤器。第I次清洗加入700uL，并且旋转如上所述。第II次清洗使用500uL进行，旋转如上所述并且重复1次。最后旋转在10000xg下进行1分钟，以除去残余液体。将外排体RNA用20uL预热的(95℃)无核酸酶的水在新鲜收集管中洗脱。柱子在10000xg下旋转30秒并且洗脱液重新与另外的5uL无核酸酶的水一起再次加入相同的柱子，并且在相同的条件下旋转第二次。使用Pico Agilent芯片进行样品定性和半定量。有趣地，miR-629被确定在miR-629过量表达细胞系分泌的外排体中。相对于对照细胞在这些外排体内miR-629过量表达了12-20倍(图17)。

不想被理论束缚，肿瘤衍生的miR-629可通过外排体递送至自然杀伤(NK)细胞，从而降低NK细胞活化，NK细胞是产生炎性细胞因子并且自然地杀靶细胞的颗粒淋巴细胞。在miR-629基线水平高时，该假说认为NK细胞活性很低。因而，抗-CD19抗体(MEDI551)可以通过NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)降低活性并且导致差的治疗响应。在基线处的低miR-629预计不会导致增加对瑞图宣(Rituxan)(也被称为利妥昔单抗)的响应，因为瑞图宣除了NK细胞介导ADCC作用还通过其他作用机制，然而MEDI551不是这样。

实例15：miR-629过量表达改变NK细胞功能

miR-629对NK细胞功能的影响通过分析在NK细胞活化中已知会改变的基因的表达来评估，包括细胞溶解通路基因(例如，颗粒酶B(GZMB)、GZMA、GZMM、组织蛋白酶B和D、穿孔素1)，细胞表面/粘附分子(例如，CD96(TACTILE)、CD63颗粒蛋白(granulophysin))，以及NK细胞活化受体。NK细胞功能可以在γ-干扰素或颗粒酶B ELISA中进行测定。颗粒酶是细胞毒性T细胞和自然杀伤(NK)细胞中的细胞质颗粒释放的丝氨酸蛋白酶。颗粒酶在靶细胞(包括癌症细胞)中诱导程序性细胞死亡。

初步结果表明了miR-629的过量表达改变NK细胞功能(图18A和18B)。miR-629核转染后分析了miR-629过量表达对NK细胞功能的影响。核转染后，miR-629水平增加(图18A)。并且该增加导致与细胞溶解通路和NK活化/粘附相关联的基因减少40％-60％。分析的基因包括颗粒酶B、颗粒酶A、颗粒酶M、组织蛋白酶D、穿孔素1、CD63、CD96、和干扰素调节因子7(图18B)。实施核转染是使用以下的方法：将NK-92细胞(ATCC公司#CRL-2407)以0.2-1.5e6个细胞/mL的密度维持在含有2mM谷氨酰胺、10％FBS和10ng/mL IL-2(派普泰克公司(PeproTech)#200-02)的高级RPMI(生命技术公司(LifeTech))培养基中并且每3-4天进行传代培养。使用Amaxa细胞系核转染试剂盒R和Amaxa核转染II装置(龙沙)进行Nk-92细胞核转染，如下所示。十二孔组织培养板的准备是通过利用1.5mL的培养基填充适当数量的孔并预培养在湿润的37℃/5％CO2培养箱中。核转染工作溶液是通过加入0.45mL补充液至2.05mL细胞系核转染溶液R中来制备。对于单个核转染，5e6细胞于室温在90xg下离心10分钟，再悬浮于100ul室温的核转染工作溶液中，并与200nM的miR-629模拟品、抑制剂或打乱型对照进行组合。细胞/RNA悬浮液被转移至小槽，放置于核转染II(Nucleofector II)装置中，并应用U-001NK程序。小槽从装置移走，并加入500uL预平衡的培养基。然后将样品转移至准备的12孔平板(终体积大约是每孔2mL培养基/细胞)并且培养在湿润的37℃/5％CO2培养箱中。如上文所报道，在对使用抗-CD19抗体(MEDI-551)而不是利妥昔单抗的体外抗体依赖性细胞毒性具有高敏感性和低敏感性的细胞系之间miR-629的表达显著地不同。预先指定miR-629(在其它miR之间)用于检测临床试验1期和2期中B细胞恶性肿瘤以评估在预测患者对于抗-CD-19抗体(MEDI-551)治疗的响应方面的临床实用性。出人意料地，在对于抗-CD19抗体(MEDI-551)治疗响应或不响应的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者之间在基线血液样品中的miR-629表达显著不同。这个影响在单试剂(1期)和化疗联合研究(2期)中是可再现的。这个效果使用利妥昔单抗没有观察到。有趣地，具有低水平miR-629的患者显示出对于抗-CD19抗体(MEDI-551)而不是利妥昔单抗的增加的响应率。这个观察可能是由于(至少部分地)miR-629通过存在于外排体中或通过其它的方式改变NK细胞活化标志物的能力。这些结果支持miR-629在介导响应抗-CD19抗体(MEDI-551)、而不是利妥昔单抗中的作用。

RNA分离

利用微小RNA PAX基因血液RNA试剂盒(microRNA PAXgene Blood RNA kit)(凯杰公司(Qiagen)，德国希尔登)，从淋巴瘤和白血病患者的PAX基因血管提取总RNA。对于慢性淋巴细胞性白血病患者的细胞系和PBMC样品，使用miRVana miRNA分离试剂盒(miRVanamiRNA Isolation Kit)(生命技术公司(Life Technologies))根据制造商的说明分离样品。RNA纯化和浓度由分光光度计(260/280>1.9)测定。RNA质量是在Agilent 2100生物分析仪上利用RNA 6000 Nano评估的。

TaqMan Q-PCR

对于TaqMan分析，使用Multiscribe RT和miRNA引物池根据制造商的说明将250-300ng总RNA逆转录成cDNA。在含有12.5μL 2X TaqMan预扩增主要混合物(TaqMan PreAmpMaster Mix)、2.5μL 10X Megaplex预扩增引物(Megaplex PreAmp primers)、7.5μL H₂O以及2.5μL RT产物的反应中使用TaqMan预扩增主要混合物和miRNA引物池来预扩增产生的cDNA。在循环之后，在DNA悬浮缓冲液(TEKnova，霍利斯特(Hollister)，加利福尼亚州)中按1:4稀释扩增的样品，并且保持在-20℃或立即用于PCR。使用BioMark实时定量PCR系统利用特异针对miR-629和管家参考基因RNU44、U6、U47、和RNU24的TaqMan试验(生命技术公司)对预扩增的材料进行实时PCR。大于28的循环阈值(Ct)被排除在计算外。使用四个参考基因(RNU44、U6、U47、和RNU24)的平均值计算ΔCt值。在ΔCt值被用于比较的情况下，值得注意的是ΔCt值与表达呈负相关，以至于ΔCt值越高，miR-629表达越低。利用在健康志愿者的miR-629表达作为对照，通过计算2^-ΔΔCt来确定倍数变化值。

稳定的细胞系产生

使用过量表达miR-629或打乱型miRNA对照(开放生物系统公司(OpenBiosystems)，阿拉巴马州汉茨维尔(Huntsville))的慢病毒载体以2-20的MOI转导弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系Karpas-422。转导的细胞扩增1-2周。利用RFP，细胞被荧光激活细胞分类(FACS)分选高miR-629和低miR-629群体。使用限制性稀释方法产生克隆。miR-629的过量表达由TaqMan QPCR估算。

细胞生长与细胞凋亡试验

过量表达miR-629的淋巴瘤细胞被5μM或10μM依托泊苷处理，然后测量细胞生长和细胞凋亡。依托泊苷处理24小时和48小时后，使用细胞滴度-Glo发光细胞活力检测(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay)(普洛麦格公司(Promega)，威斯康辛州麦迪逊)根据制造商的说明测定细胞生长。依托泊苷处理48小时后，使用半胱天冬酶-Glo3/7测定(普洛麦格公司)根据制造商的说明测定半胱天冬酶活性。在SpectraMax M5平板阅读器上(分子装置有限责任公司(Molecular Devices,LLC.)，加利福尼亚州桑尼维尔)收集所有的发光数据。

统计学分析

使用韦尔奇的t检验(Welch’s t-test)或曼-惠特尼U非参数检验(Mann-WhitneyU non-parametric test)，分析了微小RNA表达的倍数变化值，p值<0.05被认为显著。

其他实施例

从前述说明中，将显而易见的是，可以对本文所述的发明作出变更和修改以使其适应于各种用途和状况。这样的实施例也在下述权利要求的范围内。

在变量的任何定义中对要素清单的引用在本文中包括将所述变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或次组合)。在此的实施例的详述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。

本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用方式以相同的程度结合在此，如同每份单独的专利和出版物具体地且个别地指出通过引用的方式结合。

Claims

1.一种为具有B细胞恶性肿瘤的受试者选择疗法的方法，该方法包括在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测选择该受试者用于抗-CD19抗体疗法。

2.一种对具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者进行鉴定的方法，该方法包括在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测将该受试者鉴定为响应抗-CD19抗体治疗。

3.一种为具有B细胞恶性肿瘤的受试者选择疗法的方法，该方法包括通过定量PCR或miRNA微阵列分析在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测选择该受试者用于抗-CD19抗体疗法。

4.一种对具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者进行鉴定的方法，该方法包括通过定量PCR或miRNA微阵列分析在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测将该受试者鉴定为响应抗-CD19抗体治疗。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该参考水平是通过以下获得

比较miR-629表达水平与样品中存在的其它微小RNA的表达水平；

测定样品中miR-629表达的范围，这些样品是从具有不响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者中获得的；或者

测量受试者或细胞系中miR-629表达的水平或范围，该受试者或细胞系对于抗-CD19抗体治疗具有降低的敏感性，对于化疗的抗增生效应具有抗性，或对于化疗诱导的细胞凋亡具有抗性。

6.一种对被选择为具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者进行治疗的方法，该方法包括给予选择的受试者有效量的抗-CD19抗体，其中通过在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达来选择该受试者。

7.一种对被选择为具有响应抗-CD19抗体和化学治疗剂的治疗的B细胞恶性肿瘤的受试者进行治疗的方法，该方法包括给予选择的受试者有效量的抗-CD19抗体和化学治疗剂，其中通过在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达来选择该受试者。

8.一种对具有B细胞恶性肿瘤的受试者进行给药的方法，其中通过在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达而鉴定该受试者为具有响应抗-CD19抗体治疗的B细胞恶性肿瘤。

9.一种消耗具有B细胞恶性肿瘤的受试者的B细胞的方法，该方法包括

(a)在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平降低的miR-629表达，其中对所述降低的检测鉴定该受试者为响应抗-CD19抗体疗法；并且

(b)向该受试者给予抗-CD19抗体，从而消耗该受试者的B细胞。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该参考水平是通过以下获得

比较miR-629表达水平与样品中存在的其它微小RNA的表达水平；

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该受试者具有B细胞起源的淋巴瘤或白血病。

12.如权利要求11所述的方法，其中该受试者具有非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、或慢性淋巴细胞性白血病。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该血液样品是全血、外周血单核细胞(PBMC)样品、血清、或血浆。

14.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该抗-CD19抗体是人的、人源化的或嵌合的抗体。

15.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该抗-CD19抗体包含VH结构域，该VH结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

16.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该抗-CD19抗体包含VL结构域，该VL结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中该抗-CD19抗体是MEDI-551。

18.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中该受试者对于该抗-CD19抗体的响应是由miR-629介导的。

19.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中对miR-629降低的检测鉴定该受试者为具有增加的自然杀伤细胞活化。

20.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中在存在于该血液样品中的或分离自该血液样品的外排体中检测miR-629。

21.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中该受试者的选择进一步包括检测选自下组的自然杀伤细胞蛋白的表达水平，该组由以下各项组成：颗粒酶B(GZMB)、GZMA、GZMM、组织蛋白酶D、穿孔素1、干扰素调节因子7、CD63、CD96、NKp30、NKG2D、CD56、以及CD107a，或者检测编码所述蛋白的多核苷酸。

22.一种试剂盒，该试剂盒包括特异性地结合miR-629的引物或探针。

23.一种试剂盒，该试剂盒包括抗-CD19抗体和特异性地结合miR-629的引物或探针。

24.一种诱导或增加抗-CD19抗体在被鉴定为具有B细胞恶性肿瘤的受试者中的响应性的方法，该方法包括向该受试者给予有效量的、靶向miR-629的抑制性核酸分子。

25.一种消耗受试者体内的B细胞的方法，该方法包括向该受试者给予有效量的靶向miR-629的抑制性核酸分子联合抗-CD19抗体，从而消耗该受试者体内的B细胞。

26.如权利要求25所述的方法，其中该抑制性核酸分子是反义核酸分子、siRNA、或shRNA。

27.一种组合物，该组合物包括靶向miR-629的抑制性核酸分子联合抗-CD19抗体。

28.如权利要求27所述的组合物，其中该抑制性核酸分子是反义核酸分子、siRNA、或shRNA。

29.如权利要求25所述的方法，其中该抑制性核酸分子是先于或同时与该抗-CD19抗体给予。

30.一种对具有B细胞恶性肿瘤的受试者进行鉴定的方法，该方法包括在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平增加的miR-629表达，其中对所述增加的检测鉴定该受试者为具有B细胞恶性肿瘤。

31.一种对具有B细胞恶性肿瘤的受试者进行鉴定的方法，该方法包括通过定量PCR或miRNA微阵列分析在该受试者的血液样品中检测相对于参考水平增加的miR-629表达，其中对所述增加的检测鉴定该受试者为具有B细胞恶性肿瘤。

32.如权利要求30或31所述的方法，其中在存在于该血液样品中的或分离自该血液样品的外排体中检测miR-629。