KR20160129862A

KR20160129862A - B 세포 고갈 치료요법에 반응성인 b 세포 악성 종양을 식별하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20160129862A
Application number: KR1020167026836A
Authority: KR
Inventors: 마이클 쿠지오라; 의홍 야오; 코우스트브 랜드; 필립 제트 브로흔; 케이티 슈트라이허
Original assignee: 메디뮨 엘엘씨
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2015-03-04
Publication date: 2016-11-09
Also published as: WO2015134631A3; EP3114238A4; US20150252431A1; RU2016138431A; EP3114238A2; CN106460036A; US20170088628A1; AU2015227251A1; WO2015134631A8; WO2015134631A2; CA2940464A1; MX2016010948A; BR112016020043A2; JP2017510255A

Abstract

본 발명은 B 세포 고갈 치료요법(예를 들어, 항-CD19 항체로의 치료)에 반응성인 환자를 식별하기 위한 miR-629의 사용을 특징으로 하는 조성물 및 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 B 세포 악성을 가지는 대상체를 식별하기 위한 miR-629의 사용을 특징으로 한다.

Description

B 세포 고갈 치료요법에 반응성인 B 세포 악성 종양을 식별하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR IDENTIFYING B CELL MALIGNANCIES RESPONSIVE TO B CELL DEPLETING THERAPY}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 특허 출원은 참조로서 본원에 포함된 2014년 3월 4일에 출원된 미국 예비 특허 출원 번호 US 61/947,755의 혜택을 주장한다.

전자 제출된 참조로서 포함된 물질

본원과 함께 제출되고 다음과 같이 식별되는 컴퓨터 판독 가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록이 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다: 2015년 3월 4일에 생성된 "MR629-100WO1SequenceListing.TXT,"로 명명된 하나의 8,585 바이트의 ASCII(Text) 파일.

급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 비호지킨 림프종(NHL)을 포함하는 대부분의 인간 백혈병 및 림프종은 B 세포 기원이다. 단일클론 항체(mAb)를 이용하여 B 세포 제한 표면 항원을 표적화함으로써 B 세포 고갈에 기반한 치료적 접근이 크게 주목 받고 있다. 인간 분화의 클러스터(CD) 항원 19는 B 세포 특이적 표면 항원으로서 B 세포 기원의 악성 종양을 치료하기 위한 치료적 단일클론 항체(mAb) 접근법의 매력적인 표적이다. 향상된 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 가지는 친화도 최적화 및 무푸코실화 CD19 단일클론 항체가 B 세포 악성 종양 전임상 모델에서 강한 항종양 활성을 가지는 것으로 나타났다.

B 세포 악성 종양은 다양한 병원성 기전으로부터 발생하고, 분자 수준에서의 이러한 악성 종양을 특징화하는 방법이 환자를 층상화하는데 유용함으로써 환자들에게 신속하게 유효한 치료요법을 안내한다는 점에 대한 인식이 증가하고 있다. B 세포 악성 종양을 가지는 대상체의 반응성을 예측하기 위한 개선된 방법이 절실히 필요하다.

아래에 기술된 바와 같이, 본 발명은 B 세포 고갈 치료요법(예를 들어, 항-CD19 항체로의 치료)에 반응성인 대상체를 식별하기 위한 miR-629의 사용을 특징으로 하는 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하기 위한 miR-629의 사용을 특징으로 한다.

일 양태에서, 본 발명은, 일반적으로, 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체(예를 들어, 인간)에 대한 치료요법을 선택하는 방법을 제공하되, 상기 감소의 검출이 항-CD19 항체 치료요법에 대한 대상체를 선택한다.

다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 방법을 제공하되, 상기 감소의 검출이 대상체가 항-CD19 항체 치료에 반응성인 것으로 식별한다.

다른 양태에서, 본 발명은 정량적 PCR 또는 miRNA 마이크로어레이 분석에 의해 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체에 대한 치료요법을 선택하는 방법을 제공하되, 상기 감소의 검출이 항-CD19 항체 치료요법에 대한 대상체를 선택한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 정량적 PCR 또는 miRNA 마이크로어레이 분석에 의해 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 방법을 제공하되, 상기 감소의 검출이 대상체가 항-CD19 항체 치료에 반응성인 것으로 식별한다.

여전히 다른 양태에서, 본 발명은 선택된 대상체에게 유효량의 항-CD19 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 선택된 대상체를 치료하는 방법을 제공하되, 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계에 의해 대상체가 선택된다.

다른 양태에서, 본 발명은 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체에게 약물을 투여하는 방법을 제공하되, 대상체는 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계에 의해 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체에서 B 세포를 고갈시키는 방법을 제공하되, 이러한 방법은, 대상체는 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계로서, 상기 감소의 검출이 대상체가 항-CD19 항체 치료요법에 대해 반응성인 것으로 식별하는 단계; 및 대상체에게 항-CD19 항체를 투여함으로써, 대상체 내 B 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다.

여전히 다른 양태에서, 본 발명은 miR-629에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 함유하는 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 키트는 항-CD19 항체 치료요법에 반응성인 대상체를 선택하거나 식별하기 위한 키트의 용도에 대한 안내를 더 함유한다.

다른 양태에서, 본 발명은 miR-629에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 및 항-CD19 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 일 구현예에서, 키트는 항-CD19 항체 치료요법에 반응성인 대상체를 선택하거나 식별하기 위한 키트의 용도에 대한 안내를 더 함유한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에게 miR-629를 표적으로 하는 저해 핵산 분자의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별된 대상체에서 항-CD19 항체 반응성을 유도하거나 증가시키는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 B 세포를 고갈시키는 방법을 제공하되, 이러한 방법은 대상체에게 유효량의 miR-629를 표적으로 하는 저해 핵산 분자와 항-CD19 항체를 조합하여 투여함으로써, 대상체에서 B 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 항-CD19 항체와 조합된 miR-629를 표적으로 하는 저해 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 증가된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 방법을 제공하되, 상기 증가의 검출이 대상체가 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 정량적 PCR 또는 miRNA 마이크로어레이 분석에 의해 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 증가된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 방법을 제공하되, 상기 증가의 검출이 대상체가 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별한다. 일 구현예에서, 참조 수준은 건강한 대조군 대상체의 혈액 시료 내 존재하는 miR-629 발현의 수준이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체에 대한 치료요법을 선택하는 시험관 내 방법을 제공하되, 상기 감소의 검출이 항-CD19 항체 치료요법에 대한 대상체를 선택한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 시험관 내 방법을 제공하되, 상기 감소의 검출이 대상체가 항-CD19 항체 치료에 반응성인 것으로 식별한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 정량적 PCR 또는 miRNA 마이크로어레이 분석에 의해 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 위한 치료요법을 선택하는 시험관 내 방법을 제공하되, 상기 감소의 검출이 항-CD19 항체 치료요법에 대한 대상체를 선택한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 정량적 PCR 또는 miRNA 마이크로어레이 분석에 의해 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 시험관 내 방법을 제공하되, 상기 감소의 검출이 대상체가 항-CD19 항체 치료에 반응성인 것으로 식별한다.

다른 양태에서, 본 발명은 시험관 내 방법에서 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 선택된 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 항-CD19 항체의 용도를 제공하되, 대상체는 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계에 의해 선택된다. 일 구현예에서, 항-CD19 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 저푸코실화 또는 무푸코실화된다. 또 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체에서 B 세포를 고갈시키기 위한 약제의 제조에서의 항-CD19 항체의 용도를 제공하되, 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는 시험관 내 방법에서 대상체가 치료를 위하여 선택되되, 상기 감소의 검출이 대상체를 항-CD19 항체 치료요법에 반응성인 것으로 식별한다. 일 구현예에서, 항-CD19 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 저푸코실화 또는 무푸코실화된다. 또 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별된 대상체의 치료를 위한 약제의 제조에서 miR-629를 표적으로 하는 저해 핵산 분자의 용도를 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 B 세포를 고갈시키기 위한 약제의 제조에서 miR-629를 표적으로 하는 저해 핵산 분자의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 저해 핵산 분자는 안티센스 핵산 분자, siRNA, 또는 shRNA이다.

다른 양태에서, 본 발명은 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별된 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조에서 항-CD19 항체와 조합된 miR-629를 표적으로 하는 저해 핵산 분자의 용도를 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 증가된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 시험관 내 방법을 제공하되, 상기 증가의 검출이 대상체가 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별한다.

다른 양태에서, 본 발명은 정량적 PCR 또는 miRNA 마이크로어레이 분석에 의해 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 증가된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 시험관 내 방법을 제공하되, 상기 증가의 검출이 대상체가 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별한다.

본원에 기술된 임의의 위의 양태 또는 본 발명의 임의의 다른 양태의 다양한 구현예에서, 참조 수준은 miR-629 발현의 수준을 시료 내 존재하는 다른 마이크로 RNA들의 발현 수준과 비교하는 단계; 항-CD19 항체로의 치료에 반응성이 아닌 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체로부터 수득한 시료 내 miR-629 발현의 범위를 결정하는 단계; 또는 항-CD19 항체 치료에 대해 감소된 민감성, 화학요법의 항증식성 효과에 대한 내성, 또는 화학요법으로 유도된 아폽토시스에 대한 내성을 가지는 대상체 또는 세포주에서 miR-629 발현의 범위 또는 수준을 측정하는 단계에 의해 수득된다. 위의 양태의 다른 구현예에서, 참조 수준은 델타-델타 Ct 방법을 사용한 miR-629의 발현에서의 배율 변화를 측정하는 단계에 의해 수득된다. 위의 양태의 다른 구현예에서, 참조 수준은 대상체의 군집에서 miR-629 발현의 수준 또는 범위를 측정하는 단계에 의해 수득된다. 임의의 위의 양태의 다양한 구현예에서, 대상체는 B 세포 기원의 림프종 또는 백혈병(예를 들어, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 다발성 골수종, 또는 만성 림프구성 백혈병)을 가진다. 위의 양태의 다른 구현예에서, miR-629 발현은 비반응성 소포성 림프종을 가지는 대상체에 비해 반응성 소포성 림프종을 가지는 대상체로부터 수득한 혈액 시료에서 약 3 내지 5배 더 낮다. 위의 양태의 다른 구현예에서, miR-629 발현은 비반응성 미만성 거대 B 세포 림프종을 가지는 대상체에 비해 반응성 미만성 거대 B 세포 림프종을 가지는 대상체에서 약 5 내지 7배 더 낮다. 위의 양태의 다른 구현예에서, 혈액 시료는 전혈, 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 시료, 혈청, 또는 혈장이다. 위의 양태의 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 위의 양태의 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 저푸코실화 또는 무푸코실화된다. 위의 양태의 또 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 함유한다. 위의 양태의 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 함유한다. 위의 양태의 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 함유한다. 위의 양태의 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 함유한다. 위의 양태의 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 MEDI-551이다. 위의 양태의 다른 구현예에서, 저해 핵산 분자는 안티센스 핵산 분자, siRNA, 또는 shRNA이다. 위의 양태의 다른 구현예에서, 저해 핵산 분자는 항-CD19 항체 이전에 또는 이와 동시에 투여된다.

본 발명의 다른 특징 및 이점들은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명확해질 것이다.

도 1a는 항-CD19 항체에 낮은 민감성을 가지는 세포주에 비해 항-CD19 항체 치료에 높은 민감성을 가지는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL) 세포주에서 감소하는 miR-629 발현을 보여주는 그래프이다.
도 1b는 항-CD19 항체 투여에 높은 민감성 및 낮은 민감성을 보여주는 세포주에서 발현 강도 miR 특징을 보여주는 그래프이다. 도 1b는 miR-629가 항-CD19 항체 치료에 높은 민감성을 가지는 DLBCL 세포주에서 유의하게 낮다는 것을 보여준다.
도 2는 miR-629 발현이 진행성 질환(PD)을 가지는 비반응자 대비 항-CD19 항체로의 치료에 대해 완전하거나 부분적인 반응(CR/PR)을 보이는 미만성 거대 B 세포 림프종 환자에서 더 낮다는 것을 보여주는 산점도이다.
도 3은 miR-629 발현이 소포성 림프종 비반응자(PD)보다 항-CD19 항체 치료(CR/PR)에 반응하였던 소포성 림프종 환자로부터 수득한 전장 혈액 시료에서 더 낮다는 것을 보여주는 산점도이다.
도 4는 miR-629 발현이 비반응자보다 항-CD19 항체 치료(CR/PR)에 반응하였던 만성 림프구성 백혈병 환자로부터의 전장 혈액 시료에서 더 낮다는 것을 보여주는 산점도이다.
도 5a 및 5b는 치료 전 만성 림프구성 백혈병 환자로부터 수득한 전혈에서 측정된 miR-629 발현을 보여주는 산점도이다. 환자의 리툭시맙-ICE 치료요법(도 5b) 대 항-CD19 항체-ICE 치료요법(도 5a)에 대한 반응을 특성화하였다.
도 5c 및 5d는 각각 항-CD19 항체(MEDI-551) 또는 리툭시맙 치료에 높은 민감성 및 낮은 민감성을 나타내는 세포주에서 발현 강도 miR 특징을 보여주는 산점도이다.
도 5e는 기준선 miR-629 발현이 항-CD19 항체(MEDI-551) 및 화학요법에 반응하는 DLBCL 환자에서 더 낮다는 것을 보여주는 산점도이다. 이러한 효과는 리툭시맙으로는 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 모든 용량(2 mg/kg 및 4 mg/kg의 MEDI-551 및 375 mg/m²의 리툭시맙)으로 치료된 환자로부터 수득되었다.
도 5f는 기준선 miR-629 발현이 항-CD19 항체(MEDI-551) 및 화학요법에 반응하는 DLBCL 환자에서 더 낮다는 것을 보여주는 산점도이다. 화학요법은 다음과 같이 투여되는 ICE 또는 DHAP였다: ICE는 다음과 같은 IV 주입을 통해 투여될 것이다: 24시간 동안 연속적으로 이포스파미드 5 g/m² 2일차에 메스나를 이용함; 2일차에 카보플라틴 AUC = 5 mg/mL x 분(800 mg 최대); 1, 2, 및 3일차에 에토포시드 100 mg/m²) 21일 주기. DHAP는 다음과 같이 IV 주입을 통해 투여될 것이다: 1, 2, 3, 및 4일차에 덱사메타손 40 mg; 투여 주기의 1일차에 24시간 동안 연속적으로 시스플라틴 100 mg/m²; 21일 주기에서 2일차에 12시간(2 용량) 후 반복되는 3시간 주입으로 시타라빈 2 g/m². 이러한 데이터는 2 mg/kg 항-CD19 항체(MEDI-551)로 치료된 환자로부터 수득되었다.
도 6a 내지 6c는 산점도이다. 도 6a 및 6b는 miR-629 발현 수준이 항-CD19 항체(CR/PR)에 반응하였던 DLBCL 환자에서 치료 전 및 후에 유사하였다는 것을 보여준다(도 6a 및 6b). 도 6c는 miR-629 발현 수준이 치료 후 진행성 질환(PD)을 가지는 DLBCL 환자에서 증가하였다는 것을 보여준다.
도 7a 및 7b는 miR-629가 건강한 자원자에 비하여 림프종(미만성 거대 B 세포 림프종 및 소포성 림프종)를 가지는 환자에서 더 높다는 것을 보여주는 산점도이다. 도 7a는 miRNA 마이크로어레이 분석을 사용해 수득한 결과를 보여준다. 도 7b는 TaqMan 정량적 PCR을 사용하여 수득한 결과를 보여준다.
도 8는 특정한 세포 유형에서 miR-629 발현을 보여주는 산점도이다.
도 9a 내지 9c는 miR-629 과발현에 관한 것이다. 도 9a는 miR-629/GFP 발현 벡터를 보여주는 것이다. 도 9b는 miR-629/GFP 발현 벡터를 발현하는 세포에서 GFP 발현을 보여주는 현미경 사진이다. 도 9c는 DLBCL 세포주 Karpas-422에서 miR-629의 발현을 보여주는 그래프이다. 렌티바이러스 miR-629 발현 벡터로의 형질도입 후, Karpas-422 세포가 GFP 발현을 사용하여, 낮은 miR-629군 및 높은 miR-629군의 2개의 군으로 분류되었다. miR-629 발현은 두 군에서 증가하지만, 증가된 GFP 발현을 가지는 군에서 더 높다.
도 10a 및 10b는 미처리 대조군 세포에 비해 5 μM 또는 10 μM 에토포시드로 처리되었던 miR-629를 과발현하는 Karpas-422 림프종 세포에서의 카스파제 활성화를 보여주는 그래프이다. miR-629 과발현이 Karpas-422 림프종 세포를 화학요법(에토포시드)으로 유도된 아폽토시스로부터 보호하였다. miR-629를 과발현하는 세포의 다수의 클론이 생성되었다. miR-629의 발현이 증가하면, 화학요법(에토포시드)으로 유도된 아폽토시스로부터의 더 큰 보호가 관찰된다.
도 11a 및 11b는 벡터 단독(스크램블)으로 형질전환된 대조군 세포에 비해 에토포시드로 처리되었던 miR-629를 과발현하는 Karpas-422 림프종 세포에서의 세포 증식 검정의 결과를 보여주는 그래프이다. miR-629 발현은 세포를 화학요법(에토포시드)으로 유도된 세포 증식의 소실로부터 보호하였다. 이처럼, miR-629를 과발현하는 세포의 다수의 클론을 생성하였다. miR-629의 발현이 증가하면서, 화학요법(에토포시드)으로 유도된 증식의 소실로부터의 더 큰 보호가 관찰된다.
도 12a 및 12b는 그래프이다. 도 12a는 벡터 단독을 발현하는 대조군 세포에 비해 낮은 또는 높은 수준으로 miR-629를 발현하는 Karpas 422 세포에서 시험관 내 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 검정의 결과를 보여주는 것이다. ADCC 결과는 이러한 결과가 miR-629 수준의 증가에 따른 MEDI-551에 대한 ADCC 반응에서의 전환을 보여주기 때문에 유의하다. 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 이러한 결과는 miR-629가 MEDI-551에 대한 반응을 매개하는데 직접적인 역할을 가질 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 도 12b는 낮거나 높은 수준의 miR-629를 발현하는 세포에서 자발적인 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 방출을 보여준다. LDH 방출은 수년간 림프종에서의 알려진 예측 인자이고 임상 시행에서 일상적으로 측정된다. 이러한 결과는 miR-629가 림프종 세포주에서 LDH 방출이 증가시켰다는 것을 보여준다. 따라서, miR-629 발현 수준이 종양의 공격성과 관련되었을 가능성이 있다. 이는, 부분적으로, miR-629와 MEDI-551에 대한 반응 사이의 상호연관성을 설명할 수 있다.
도 13는 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 가지는 환자에서 항-CD19 항체(MEDI-551)로의 치료에 대한 반응의 로지스틱 회귀 분석을 나타낸 것이다. 점은 반응자(상단) 및 비반응자(하단)를 나타낸다. 데이터는 miRNA 특징 발현이 CLL에서 MEDI-551 반응의 잠재적인 예측 바이오마커라는 것을 보여준다.
도 14a 내지 d는 항체 의존성 세포독성(ADCC) 검정에서의 결과를 보여주는 그래프이다. miR-629는 특정한 세포 유형에서 과발현되었고, 그런 다음, 세포를 항-CD19 항체(MEDI551)로 처리하였다.
도 15a 및 15b는 항-CD19 항체(MEDI551) 치료에 대한 민감성이 다양한 9종의 세포주에서 알로피코시아닌(APC)이 접합된 이차 항체를 사용하여 분석된 CD19(도 15a) 및 CD20(도 15b) 발현을 보여주는 그래프이다. 평균 형광 강도(MFI)비가 대조군으로 형질감염된 세포, miR로 형질감염된 세포, 및 비형질감염된 세포에서 측정되었다. CD19나 CD20 모두 miR-629 과발현 후 변화하였다.
도 16은 DLBCL 환자로부터의 기준선 혈액 시료에서 miR-629 발현 수준(정상 혈액에 비교한 배율 변화)이 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 하이드록시다우노마이신(또는 독소루비신), 빈크리스틴 또는(ONCOVIN ®)로 명명됨, 및 프레드니솔론(R-CHOP)(Alencar, et al., Clin Cancer Res; 17(12) June 15, 2011)을 포함하는 화학요법 조합으로의 치료 후 증가된 환자 생존율을 예측하는 것으로 이전에 보여진 혈액에서의 miRNA 발현 특징과 상호연관되지 않는다는 것을 보여주는 그래프이다. R-CHOP 반응에 관련된 miRNA 특징은 DLBCL 혈액에서 MEDI-551 반응에 관련된 miRNA 특징과 상호연관되지 않는다.
도 17은 miR-629가 miR-629를 안정적으로 과발현하는 세포로부터 단리된 엑소좀 내에 존재하였다는 것을 보여주는 그래프이다. 실제로, miR-629는 이러한 엑소좀 내에서 12 내지 20배 더 높은 수준으로 존재하였다.
도 18a 및 18b는 자연 살해(NK) 세포에 대한 miR-629 뉴클레오펙션의 효과의 예비 분석을 보여주는 그래프이다. miR-629 발현은 뉴클레오펙션 후 증가하였고(도 18a); 세포 용해 경로 및 관련된 자연 살해 세포 활성화/부착 경로에서의 유전자의 발현이 40 내지 60%만큼 감소하였다. 분석된 유전자는 그랜자임 B(GZMB), GZMA, GZMM, 카텝신 D(CTSD), 퍼포린 1(PRF1), CD63, CD96, 및 인터페론 조절 인자 7을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 공통적으로 이해되는 의미를 가진다. 아래의 참조는 당업자에게 본 발명에 사용된 많은 용어들의 일반적인 정의를 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al.(eds.), Springer Verlag(1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology(1991). 본원에 사용된, 다음의 용어들은, 다르게 명시되지 않는 한, 아래에서 용어에 대해 기술된 의미를 가진다.

"B 세포 악성 종양"이라는 용어는 B 세포 계통의 세포로부터 유래한 임의의 악성 종양을 포함한다.

"CD19"는 항-CD19 항체 또는 이의 단편에 결합하는 약 90 kDa의 항원을 의미한다. CD19는 줄기 세포 단계에서부터 혈장 세포로의 최종 분화까지 B-계통 세포에서 발견된다. 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 항체(예를 들어, MEDI-551)에 의해 표적화된 CD19 항원은 인간 CD19 항원이다. 하나의 예시적인 CD19 항원의 서열이 GenBank 등록 번호 AAA69966로 제공되고 아래에 서열 번호 9로 나타나 있다.

1 mppprllffl lfltpmevrp eeplvvkvee gdnavlqclk gtsdgptqql twsresplkp 61 flklslglpg lgihmrplas wlfifnvsqq mggfylcqpg ppsekawqpg wtvnvegsge 121 lfrwnvsdlg glgcglknrs segpsspsgk lmspklyvwa kdrpeiwege ppcvpprdsl 181 nqslsqdltm apgstlwlsc gvppdsvsrg plswthvhpk gpksllslel kddrpardmw 241 vmetglllpr ataqdagkyy chrgnltmsf hleitarpvl whwllrtggw kvsavtlayl 301 ifclcslvgi lhlqralvlr rkrkrmtdpt rrffkvtppp gsgpqnqygn vlslptptsg 361 lgraqrwaag lggtapsygn pssdvqadga lgsrsppgvg peeeegegye epdseedsef 421 yendsnlgqd qlsqdgsgye npedeplgpe dedsfsnaes yenedeeltq pvartmdfls 481 phgsawdpsr eatslgsqsy edmrgilyaa pqlrsirgqp gpnheedads yenmdnpdgp 541 dpawggggrm gtwstr

"항-CD19 항체"는 CD19 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 의미한다. 일 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

"miR-629"는 다음의 서열(서열 번호10)(가공 전)을 포함하거나 이를 가지는 마이크로 RNA를 의미한다:

1 tccctttccc aggggagggg ctgggtttac gttgggagaa cttttacggt gaaccaggag 61 gttctcccaa cgtaagccca gcccctcccc tctgcct.(NCBI 등록 번호 NR_030714).

다른 구현예에서, 성숙 miR-629 마이크로 RNA는 다음의 서열인 서열 번호 11을 포함하거나 이를 가진다:

61-guucucccaacguaagcccagc -82(miRBase 등록 번호 MIMAT0003298).

miR-629의 기능 및/또는 발현은, 예를 들어, miRIDIAN 마이크로 RNA hsa-miR-629-3p 해리핀(hairpin) 저해제(ThermoScientific으로부터 상업적으로 입수가능함)을 이용하여 저해될 수 있다.

"델타 CT 방법"은 각각의 림프종/백혈병 환자 시료의 델타-Ct를 결정하는 것을 의미하되, 델타-Ct는 miR-629의 임계 주기(Ct))값에서 4종의 하우스키핑 유전자(RNU48, RNU24, U6, 및 U47)의 평균 Ct 값을 뺀 것으로 계산된다. 그런 다음, 모든 정상 개체(암 환자 시료에 대해 기술한 바와 같이 계산됨)에 대한 평균 델타-Ct 값을 각각의 환자 시료에 대한 개별적인 델타-Ct 값으로부터 감하여 각각의 림프종/백혈병 환자 시료에 대한 델타-델타-Ct 값을 생성한다. 이는 다음의 식에 의해 배율 변화에 관련된다: 배율 변화 = 2^-(델타-델타-Ct).

본 개시에서, "포함하다(comprise)" "포함하는(comprising)" "함유하는(containing)" 및 "가지는(having)"등은 미국 특허법에 이들에 대하여 기술된 의미를 가질 수 있고 "포함하다(includes)" "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있다; "으로 본질적으로 이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는" 등은 미국 특허법에 기술된 의미를 가지고, 이러한 용어는 개방형으로 인용된 것을 초과하는 것의 존재로 인해 인용된 것의 기본적이거나 신규한 특성이 변하지 않는 한 인용된 것 이상의 존재를 허용하지만, 선행 기술 구현예는 배제한다.

B 세포의 "고갈"은 순환 B 세포 및/또는 특정한 조직(들)내 B 세포의 기준선 수준 대비 감소를 의미한다. 특정한 구현예에서, 고갈은 치료(예를 들어, 항-CD19 항체로의 치료) 전 대상체에 존재하는 수준에 비해 적어도 약 25%, 40%, 50%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상(예를 들어, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)이다. 특정한 일 구현예에서, 사실상 모든 검출가능한 B 세포가 순환 및/또는 특정한 조직(들)에서 고갈된다.

"검출하다"는 검출될 분석물의 존재, 부재 또는 양을 확인하는 것을 지칭한다. 일 구현예에서, 분석물은 miR-629이다.

"miR-629 저해 핵산 분자"는 포유 동물 세포에 투여될 때 miR-629의 발현에서의 감소를 초래하는 이중 가닥 RNA, siRNA, shRNA, 또는 안티센스 RNA, 또는 이의 일부, 또는 이의 모사체를 의미한다. 통상적으로, 핵산 저해제는 적어도 표적 핵산 분자의 일부, 또는 이의 오르소로그를 포함하거나, 표적 핵산 분자의 상보적 가닥의 적어도 일부를 포함한다. 일 구현예에서, miR-629 저해 핵산 분자는 적어도 약 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 심지어 90 내지 100%의 세포 내 miR-629 발현을 저해한다.

"참조"는 비교의 기준을 의미한다. 일 구현예에서, 참조 수준은 건강한 대조군 대상체로부터 수득하거나 항-CD19 항체 치료에 반응성이지 않은 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체로부터 수득한 전장 혈액 시료 내 miR-629 발현의 수준이다.

"miR-629 siRNA"는 표적 세포에서 miR-629 발현을 감소시킬 수 있는 이중 가닥 RNA를 의미한다. 최적으로, siRNA는 길이가 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 뉴클레오티드이고 3' 말단에 2개의 베이스의 돌출부를 가진다. 이러한 dsRNA는 개체 세포 또는 전체 동물에 도입될 수 있는데; 예를 들어, dsRNA는 혈류를 통해 전신적으로 도입되어 miR-629 핵산 분자의 발현을 감소시킬 수 있다.

"특이적으로 결합"은 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 인식하고 이에 결합하지만, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 자연적으로 포함하는 시료, 예를 들어, 생물학적 시료 내 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 항체, 프라이머, 또는 프로브를 의미한다. 일 구현예에서, 항-CD19 항체는 CD19 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것이다. 예시적인 항-CD19 항체가 당해 분야에 알려져 있고 본원에서 아래에 기술된다.

"대상체"는, 이에 제한되지는 않으나, 인간 또는 비인간 포유동물, 예를 들어, 소, 말, 개, 양, 고양이, 또는 뮤라인을 포함하는 포유동물을 의미한다.

본원에 제공된 범위는 범위 내 모든 값의 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50을 포함하는 군으로부터의 임의의 숫자, 숫자의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.

본원에 사용된, "치료하다," "치료하는," "치료," 등의 용어는 이와 관련된 장애 및/또는 증상을 감소시키거나 개선하는 것을 지칭한다. 일 구현예에서, B 세포 악성 종양의 치료는 B 세포 고갈, 대상체 내 종양의 성장 또는 증식의 감소 또는 안정화, 악성 종양 세포의 세포 사멸의 증가, 또는 환자 생존율의 증가를 초래한다. 불가능하지는 않지만, 장애 또는 병태를 치료하는 것이 이와 관련된 장애, 병태 또는 증상을 완전히 제거하는 것을 요구하는 것이 아니다라는 점이 이해될 것이다.

구체적으로 진술되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본원에 사용된, "또는"이라는 용어는 포함적인 것으로 이해된다. 구체적으로 진술되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본원에 사용된, "a", "an", 및 "the"라는 용어는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.

구체적으로 진술되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본원에 사용된, "약"이라는 용어는 당해 분야의 정상적인 관용의 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내인 것으로 이해된다. 약은 표준값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내인 것으로 이해될 수 있다. 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치값은 약이라는 용어에 의해 변형된다.

항-CD19( 16C4 ) 항체 서열의 기술

VH 도메인 서열 번호 1: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys The Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

VH CDR1 서열 번호 2: SSWMN

VH CDR2 서열 번호 3: RIYPGDGDTNYNVKFKG

VH CDR3 서열 번호 4: SGFITTVRDFDY

VL 도메인 서열 번호 5: Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly Ile Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile His Glu Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

VL CDR1 서열 번호 6: RASESVDTFGISFMN

VL CDR2 SEQ. ID NO: 7: EASNQGS

VL CDR3 서열 번호 8: QQSKEVPET

본 발명은 B 세포 고갈 치료요법(예를 들어, 항-CD19 항체로의 치료)에 반응성인 대상체를 식별하기 위한 miR-629의 사용을 특징으로 하는 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명은, 적어도 부분적으로, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체의 혈액 시료에서 miR-629 발현이 항-CD19 항체 치료에 대한 대상체의 반응을 특성화하는 데 사용될 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 아래에서 자세히 보고된 바와 같이, 시험관 내 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 검정을 사용하여 다수의 인간 비호지킨 B 세포 림프종 세포주가 항-CD19 항체 치료에 높거나 낮은 민감성을 가지는 것으로 식별되었다. miR-629 발현 수준은 항-CD19 항체 치료에 반응성인 미만성 거대 B 세포 림프종 대상체로부터의 혈액 시료에서 감소되었다. miR-629 발현 수준은 또한 항-CD19 항체 치료에 반응성인 소포성 림프종 대상체 및 만성 림프구성 백혈병 대상체로부터 수득한 혈액 시료에서 감소하였다.

따라서, 본 발명은 대상체 혈액 시료에서 miR-629 발현의 수준에 기반하여 항-CD19 항체 치료에 반응할 가능성이 있는 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하기 위한 방법을 제공한다.

생물학적 시료의 유형

대상체에서 항-CD19 항체 치료에 대한 B 세포 악성 종양의 반응성을 특성화하기 위해, 상이한 유형의 생물학적 시료에서 miR-629 발현의 수준을 측정하였다. 일 구현예에서, 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 또는 혈장 시료이다. 바람직한 일 구현예에서, 생물학적 시료는 말초 혈액 단핵구 세포, 림프구, 및 단핵구를 포함하는 혈액 시료이다.

miR-629 발현은 비반응성 대상체(예를 들어, 진행성 질환을 가지는 대상체)에서의 발현의 수준에 비해 항-CD19 항체 치료에 반응성인 대상체로부터 수득한 혈액 시료에서 적어도 약 3 내지 5배 또는 약 5 내지 7배 더 낮을 수 있다. 다른 구현예에서, miR-629 발현은 건강한 대조군보다 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체에서 적어도 약 5, 10, 20, 또는 30배 더 높다. 배율 변화 값은 당해 분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 결정된다. 일 구현예에서, 배율 변화는 건강한 자원자 또는 항-CD19 항체 비반응성 대상체에서 miR-629 발현을 이용한 2^-△△Ct를 계산함으로써 결정된다.

치료 방법의 선택

본원에서 아래에 보고된 바와 같이, 치료 방법을 선택하는 과정에서 B 세포 악성 종양으로 고통 받는 대상체를 miR-629 발현에 대해 시험할 수 있다. 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 가지는 것으로 특성화된 환자는 항-CD19 치료에 반응성인 것으로 식별된다.

다수의 표준 치료 계획이 선택된 환자를 위해 사용가능하다. 이러한 치료는 본 발명의 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, 항-CD19 치료는 ICE(이포스파미드, 카보플라틴 및 에토포시드)와 조합하여 투여된다.

CD19

분화의 인간 클러스터(CD) 항원 19는 막관통 수용체의 슈퍼패밀리를 포함하는 면역글로불린 도메인에 속하는 B 세포 특이적 항원이다. CD19는 CD19 발현이 하향조절될 때 전구-B 세포로부터 혈장 세포 단계까지의 계통에 걸쳐서 B 세포 상에 발현된다. CD19는 조혈모 세포 또는 전구-B 세포 단계 이전의 B 세포 상에는 발현되지 않는다. 중요하게, CD19의 발현은 B 세포의 악성 종양으로의 형질전환 후 유지되고, CD19는 B 세포 악성 종양의 대다수에 발현된다. B 세포 악성 종양 상 CD19의 널리 분포되고 상대적으로 안정한 발현은 이러한 항원이 mAb 기반 치료요법에 대한 매력적인 표적이 되게 한다.

항-CD19 항체

항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체는 대상체의 혈액 내 존재하는 miR-629 발현의 수준을 특성화하여 식별된다. 일단 치료를 위하여 선택되면, 이러한 대상체는 당해 분야에 알려진 임의의 항-CD19 항체를 실질적으로 투여받을 수 있다. 적합한 항-CD19 항체는, 예를 들어, 알려진 항-CD19 항체, 상업적으로 입수가능한 항-CD19 항체, 또는 당해 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 개발된 항-CD19 항체를 포함한다.

MEDI-551는 강한 ADCC 효과기 기능을 가지는 CD19 mAb이다. MEDI-551는 HB12b mAb의 인간화 및 친화도 최적화에 의해 개발된 CD19 mAb 항-CD19-2의 무푸코실화 형태이다(Kansas & Tedder, 1991; Yazawa et al, 2005; Herbst et al, 2010). MEDI-551는 FccRIIIA에 대한 증가된 친화도 및 향상된 ADCC 활성을 가지는 균일하게 무푸코실화된 mAb를 생성하는 절차인, 푸코실트랜스퍼라제-결핍 생성자 세포주에서 mAb 항-CD19-2의 발현에 의해 생성된다(Herbst et al., J Pharmacol Exp Ther, 2010. 335(1):213-222).

일정한 구현예에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 참조로서 포함된 항-CD19 항체 16C4(예를 들어, 미국 공개 번호 2008/0138336참조), 또는 이의 항원 결합 단편을 활용한다. 16C4는 강한 ADCC 효과기 기능을 가지는 것으로 나타난 CD19 mAb이다. 16C4는 HB12b mAb의 인간화 및 친화도 최적화에 의해 개발된 CD19 mAb 항-CD19-2의 무푸코실화 형태이다(Kansas G S and Tedder T F. J Immunol, 1991; 147:4094-4102; Yazawa et al., Proc Natl Acad Sci, 2005: 102(42):15178-15183; Herbst et al., J Pharmacol Exp Ther, 2010. 335(1):213-222). 16C4 및 MEDI-551은 모두 서열 번호 2, 서열 번호 3, 및 서열 번호 4 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR들, 및 서열 번호 6, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR들을 포함한다. 서열 번호 2 내지 4 및 서열 번호 6 내지 8의 CDR들은 서열 번호 1의 VH 및 서열 번호 5의 VL 내에 포함된다. 이처럼, 당업자는 서열 번호 2 내지 4 및 6 내지 8의 CDR들을 포함하는 항체도 또한 본 발명의 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 개시는 인간 CD19에 결합하는 항체 16C4의 유도체인 항체를 포함한다. 당업자에게 알려진 표준 기술은, 예를 들어, 아미노산 치환을 생성하기 위해 일상적으로 사용되는 부위 특이적 돌연변이 및 PCR 매개 돌연변이를 포함하는 돌연변이(예를 들어, 첨가, 결실, 및/또는 치환)를 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 도입하기 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, VH 및/또는 VK CDR 유도체는 16C4 항-CD19 항체의 원래의 VH 및/또는 VK CDR에 비해 25개 미만 아미노산 치환, 20개 미만 아미노산 치환, 15개 미만 아미노산 치환, 10개 미만 아미노산 치환, 5개 미만 아미노산 치환, 4개 미만 아미노산 치환, 3개 미만 아미노산 치환, 2개 미만 아미노산 치환, 또는 1개 미만 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, VH 및/또는 VK CDR 유도체는 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기(예를 들어, 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체에게 치명적이지 않은 아미노산 잔기)에 만들어진 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다. 돌연변이는 또한 VII 및/또는 VK CDR을 암호화하는 서열의 전체 또는 일부를 따라 무작위적으로, 예를 들어 포화 돌연변이에 의해 도입될 수 있고, 활성을 보유하는 돌연변이체를 식별하기 위해 생물학적 활성에 대해 얻어진 돌연변이체를 스크리닝할 수 있다. 돌연변이 후, 암호화된 항체가 발현될 수 있고 항체의 활성이 결정될 수 있다. 2종의 아미노산 서열의 백분율 동일성은, 이에 제한되지는 않으나, BLAST 단백질 검색을 포함하는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.

다른 구현예에서, 항-CD19 항체는, 예를 들어, 각각 그 전체가 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 출원 공개 20130330328, 20130183306, 20110104150에 기술되어 있다. 일정한 구현예에서, 본 개시의 항-CD19 항체는, 이에 제한되지는 않으나 HD37(IgG1, 카파)(DAKO North America, Inc., Carpinteria, Calif.), BU12(Callard et al., J. Immunology, 148(10):2983-7 (1992)), 4G7(IgG1) (Meeker et al., Hybridoma, 3(4):305-20 (1984 Winter)). J4.119(Beckman Coulter, Krefeld, Germany), B43(PharMingen, San Diego, Calif.), SJ25C1(BD PharMingen, San Diego, Calif.), FMC63(IgG2a)(Zola et al., Immunol. Cell. Biol. 69(PT6): 411-22 (1991); Nicholson et al., Mol. Immunol., 34:1157-1165 (1997); Pietersz et al., Cancer Immunol. Immunotherapy, 41:53-60 (1995)), 89B(B4)(IgG1)(Beckman Coulter, Miami, Fla.; Nadler et al., J. Immunol., 131:244-250 (1983)), 및/또는 HD237(IgG2b)(Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Vienna, Austria, 1989; and Pezzutto et al, J. Immunol., 138(9):2793-2799 (1987))을 포함하는 알려진 항-CD19 항체이다. 다른 구현예에서, 본 개시의 항-CD19 항체는 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0138336 및 2009/0142349 및 미국 특허 번호 7,462,352 및 7,109,304에 기술된 임의의 항-CD19 항체이다. 예시적인 구현예에서, 항-CD19 항체는 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0138336 및 아래에 기술된 바와 같은 16C4 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다.

본 발명에 유용한 항체는 면역글로불린, 단일클론 항체(전장 단일클론 항체를 포함함), 다중클론 항체, 적어도 2종의 상이한 에피토프 결합 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 인간 항체, 인간화 항체, 카멜화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편(예를 들어 항원 결합 부위), 이황화 결합 Fv(dsFv), 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본원에 개시된 항체에 대한 항-Id 항체를 포함함), 인트라바디, 및 위의 것 중 임의의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 예를 들어, 적어도 하나의 항원 결합 자리를 함유하는 분자를 포함한다.

항-CD19 항체는 단일클론 인간, 인간화 또는 키메라 항-CD19 항체를 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 항-CD19 항체는 원래의 항체(naked antibody), 면역접합체 또는 융합 단백질일 수 있다. 일정한 구현예에서, 항-CD19 항체는 순환 B 세포를 고갈시키기 충분한 양으로 인간 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 보체 의존성 세포 매개 세포독성(CDC), 및/또는 아폽토시스를 매개한다.

본 발명의 방법에 유용한 항-CD19 항체는 인간에게 투여될 때 B 세포(예를 들어, 악성 B 세포)를 고갈시키거나 감소시킨다. B 세포의 고갈은 순환 B 세포, 또는, 이에 제한되지는 않으나, 골수, 비장, 장관련림프양조직, 및/또는 림프절과 같은 특정 조직에서 일어날 수 있다. 일 구현예에서, 항-CD19 항체는 순환 B 세포, 혈액 B 세포, 비장의 B 세포, 변연대 B 세포, 소포성 B 세포, 복막 B 세포, 및/또는 골수 B 세포를 고갈시킬 수 있다. 일 구현예에서, 항-CD19 항체는 전구체 B 세포, 초기 전구-B 세포, 후기 전구-B 세포, 거대-예비-B 세포, 소-예비-B 세포, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 항원으로 자극된 B 세포, 및/또는 혈장 세포를 고갈시킨다. 이러한 고갈은, 예를 들어, 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)에 의해서/의해서나, 및 의도된 리간드와 CD19의 상호작용을 차단함으로써/함으로써나, 보체 의존성 세포독성(CDC), B 세포 증식의 저해 및/또는 (예를 들어, 아폽토시스를 통한) B 세포 사멸의 유도를 통해 달성된다.

원한다면, 항-CD19 항체는 모 항체에 비해 향상된 ADCC 활성을 가지도록 조작된다. 향상된 ADCC 활성을 가지는 항체 변이체를 생성하기 위한 방법은 당해 분야에 알려져 있고 본원에서 아래에 기술된다. 일정한 구현예에서, 항-CD19 항체는 향상된 ADCC 활성을 가지는 무푸코실화 항체이다.

일정한 구현예에서, 항-CD19 항체는 IgG 이소형, 특히 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 인간 이소형 또는 인간 군집에서 발견되는 임의의 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 대립형질을 가지는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 인간 IgG 클래스의 항체는 혈청에서의 긴 반감기 및 다양한 효과기 기능의 매개능과 같은 유리한 기능적 특성을 가진다(Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 1 (1995)). 인간 IgG 클래스 항체는 다음의 4 서브클래스로 더 분류된다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4. IgG1 서브클래스는 인간에서 높은 ADCC 활성 및 CDC 활성을 가진다(Chemical Immunology, 65, 88(1997)).

다른 구현예에서, 항-CD19 항체는, 예를 들어, 위에 기술된 것과 같은 알려진 항-CD19 항체 이소형 변환된 변이체(예를 들어, IgG1 또는 IgG3 인간 이소형으로)이다. 다른 구현예에서, 항-CD19 항체는 인간 CD19에 면역특이적으로 결합하고, 당업자에게 알려진 방법(예를 들어, BIAcore 검정, ELISA)(Biacore International AB, Uppsala, 스웨덴)을 사용하여 평가한 바와 같이 3000 pM 미만, 2500 pM 미만, 2000 pM 미만, 1500 pM 미만, 1000 pM 미만, 750 pM 미만, 500 pM 미만, 250 pM 미만, 200 pM 미만, 150 pM 미만, 100 pM 미만, 75 pM 미만의 해리 상수(K_D)를 가진다. 다른 구현예에서, 본 개시의 항-CD19 항체는 인간 CD19 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있고, 당업자에게 알려진 방법(예를 들어, BIAcore 검정, ELISA)을 사용하여 평가된 바와 같이 25 내지 3400 pM, 25 내지 3000 pM, 25 내지 2500 pM, 25 내지 2000 pM, 25 내지 1500 pM, 25 내지 1000 pM, 25 내지 750 pM, 25 내지 500 pM, 25 내지 250 pM, 25 내지 100 pM, 25 내지 75 pM, 25 내지 50 pM의 해리 상수(K_D)를 가질 수 있다. 일정한 구현예에서, 본 개시의 항-CD19 항체는 인간 CD19에 면역특이적으로 결합할 수 있고 당업자에게 알려진 방법(예를 들어, BIAcore 검정, ELISA)을 사용하여 평가된 바와 같이 500 pM, 100 pM, 75 pM 또는 50 pM의 해리 상수(K_D)를 가질 수 있다.

효과기 기능 조작

원한다면, 항-CD19 항체 치료요법에 반응성인 것으로 식별된 대상체에게 효과기 기능에 대하여 변형된 항-CD19 항체가 투여되어, 예를 들어, B 세포 악성 종양을 치료하는데 있어서 항체의 효능을 향상시킨다. 예시적인 효과기 기능은 비특이적인 세포독성 세포가 표적 세포에 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 유발하는 세포 매개 반응인 항체 의존성 세포 매개 세포독성, 또는 ADCC이다. 세포독성 세포, 또는 효과기 세포는 하나 이상의 FcR을 발현하는 백혈구일 수 있다. 효과기 세포는 마우스에서 적어도 Fc 감마 RI, FC 감마 RII, Fc 감마 RIII 및/또는 Fc 감마 RIV를 발현시킨다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이러한 세포 중, ADCC를 매개하는 일차 세포는, Fc 감마 RIII를 발현하는 NK 세포이다. 단핵구는 Fc 감마 RI, Fc 감마 RII, Fc 감마 RIII 및/또는 Fc 감마 RIV를 발현한다. 조혈 세포 상 FcR 발현은 문헌(Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991))에 요약되어 있다.

항체의 효과기 기능을 향상시키기 위한 하나의 방법은 조작된 글리코형을 생성하는 것에 의한 것이다. 조작된 글리코형은 당업자에게 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 조작되거나 변이체 발현 균주를 사용함으로써, 하나 이상의 효소, 예를 들어 DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTI11)의 공동 발현에 의해, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체로부터의 세포주로부터의 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현시킴으로써, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형함으로써 생성된다. 조작된 글리코형을 생성하는 방법은 당해 분야에 알려져 있고, 이에 제한되지는 않으나, 각각 그 전체가 참조로서 본원에 포함된 문헌(Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180: Davies et al., 2001 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; 미국 특허번호 6,602,684; 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0157108(미국 출원 번호 10/277,370); 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0003097(미국 출원 번호 10/113,929); PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A 1; Potillegent.TM. technology(Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb.TM. glycosylation engineering technology(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland))에 기술된 것을 포함한다. 예를 들어, 각각 그 전체가 참조로서 본원에 포함된 문헌(WO 00061739; EA01229125; US 20030115614: Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49)을 참조한다. 또한 Fc 영역(예를 들어, IgG의 아스파라긴 297)에 존재하는 당화 자리의 제거를 초래하는 하나 이상의 아미노산 치환이 만들어질 수 있다. 나아가, 무당화 항체는 필수적인 당화 기전이 결여된 박테리아 세포에서 생성될 수 있다.

또한 감소된 양의 푸코실 잔기를 가지는 저푸코실화 항체 또는 증가된 2등분된 GlcNAc 구조를 가지는 항체와 같은 변형된 유형의 당화를 가지는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변형된 당화 패턴은 항체의 ADCC능을 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변형된 당화 기전을 가지는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변형된 당화 기전을 가지는 세포가 당해 분야에 기술되어 있고 본 개시의 재조합 항체를 발현시킴으로써 변형된 당화를 가지는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각 그 전체가 참조로서 본원에 포함된 문헌(Shields, R. L. et al.(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al.(1999) Nat. Biotech. 17:176-1), 뿐 아니라 미국 특허번호 6,946,292; 유럽 특허 번호 EP 1,176,195; PCT 공개 WO 03/035835; 및 WO 99/54342를 참조한다.

일 구현예에서, 항-CD19는 향상된 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 매개하는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 항-CD19 항체는 Asn297에 결합된 복합 N-글리코시드 결합 당 사슬을 가지는 Fc 영역을 포함하되, 푸코스가 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 결합되지 않고, 상기 Fc 영역이 향상된 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 매개한다.

당해 분야에 알려지고 본원에 기술된 시험관 내 검정이 본 개시의 조성물 및 방법에 사용된 항-CD19 항체가 ADCC를 매개할 수 있는지를 결정하는 데 사용할 수 있다. 예시적인 검정이 미국 특허번호 5,500,362 또는 미국 특허번호 5,821,337에 기술되어 있다. 특히, 이러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성이 생체 내, 예를 들어, Clynes 등의 문헌(Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 95:652-656(1998))에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 검정은 또한 상업적으로 입수가능한 키트, 예를 들어, CytoTox 96.TM.(Promega)을 이용하여 수행될 수 있다.

B 세포 악성 종양

B 세포 악성 종양은 특이적 B 세포 서브세트의 병리학적 확장을 특징으로 하는데, 예를 들어, 전구체 B 세포 급성 림프모구성 백혈병은 전구-B 세포/예비-B 세포 발달 단계에 상응하는 B 세포의 비정상적인 확장을 특징으로 한다. 악성 B 세포는 CD19와 같은 정상 B 세포 마커의 세포 표면 발현을 유지한다. 항-CD19 항체는, 따라서, 인간 대상체에서 악성 B 세포를 고갈시킬 수 있다.

본원에 기술된 항-CD19 항체를 포함하는 치료요법은 B 세포 악성 종양을 포함하는 B 세포 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 B 세포 악성 종양은, 이에 제한되지는 않으나, 저등급/소포성 NHL, 소 림프구(SL) NHL, 중간 등급/소포성 NHL, 중간 등급 미만성 NHL, 고등급 면역모세포성 NHL, 고등급 림프모구성 NHL, 고등급 작은 비절단 세포 NHL을 포함하는 B 세포 서브타입 비호지킨 림프종(NHL); 외투세포 림프종, 및 거대 질환 NHL; 버킷 림프종; 다발성 골수종; 예비-B 급성 림프모구성 백혈병 및 초기 B 세포 전구체로부터 유래된 다른 악성 종양; 일반 급성 림프구성 백혈병(ALL); 면역글로불린 돌연변이 CLL 및 면역글로불린 비돌연변이 CLL을 포함하는 만성 림프구성 백혈병(CLL); 털세포 백혈병; 눌(null) 급성 림프모구성 백혈병; 발덴스트롬 거대글로불린혈증; 배중심 B 세포 유사(GCB) DLBCL, 활성화 B 세포 유사(ABC) DLBCL, 및 유형 3 DLBCL을 포함하는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL); 전구 림프구성 백혈병; 경쇄 질환; 형질세포종; 골경화 골수종; 혈장 세포 백혈병; 불분명한 징후의 단일클론 감마글로불린장애(MGUS); 무증상 다발성 골수종(SMM); 무통성 다발성 골수종(IMM); 고전적인 및 결절성 림프구 우세형을 포함하는 호지킨 림프종: 림포형질세포 림프종(LPL); 및 위장관 점막 관련 림프 조직 림프종을 포함하는 변연부 림프종(MALT)을 포함한다.

이러한 암의 재발의 치료도 또한 포함된다. 림프구 우세 호지킨 질환(LPHD)은 방사선 또는 화학요법 치료에도 불구하고 자주 재발하는 경향이 있는 호지킨 질환의 유형이다. 만성 림프구성 백혈병은 백혈병의 4가지 주요한 유형 중 하나이다. 성숙 B 세포의 암은 림프구로 불리고, 만성 림프구성 백혈병은 혈액, 골수 및 림프 조직 내 세포의 진행성 축적으로 나타난다. 무통성 림프종은 평균 대상체가 수많은 병의 차도와 재발의 주기 후 6 내지 10년간 생존하는 천천히 성장하는 치유불가능한 질환이다.

원하는 수준의 B 세포 고갈은 질환에 좌우될 것이다. 일 구현예에서, 항-CD19 항체의 표적인 B 세포의 고갈은 질환의 진행을 제거하거나 감소시키기에 충분하다. 질환 진행은 전문의에 의해, 예를 들어, 종양 성장(크기), 암 세포 유형의 증식, 전이를 모니터링하고/하거나 특정한 암의 징후 및 증상을 모니터링함으로써 평가된다. 일 구현예에서, B 세포 고갈은 적어도 약 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 간 질환의 진행을 제거하거나 감소시키기에 충분하다. 다른 구현예에서, B 세포 고갈은 병에 차도가 있는 시간을 적어도 약 6, 9, 또는 12개월까지, 또는 심지어 약 2, 3, 4, 또는 5년까지 증가시킨다. 다른 구현예에서, B 세포 고갈은 질환을 치유하기에 충분하다. 일정한 구현예에서, 암 대상체에서 B 세포 고갈은 치료 전 기준선 수준의 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 심지어 100%만큼 악성 B 세포의 수 또는 수준을 감소시킨다.

신생물의 치료의 효능 또는 성공을 평가하기 위한 파라미터는 전문의(예를 들어, 종양학자)에게 알려질 것이다. 일반적으로, 전문의는 질환 진행에서의 감소, 병의 차도가 있는 시간의 증가, 안정적인 질환의 존재를 기대할 것이다. B 세포 신생물의 경우, 측정가능한 범주는, 예를 들어, 질환 진행까지의 시간, 전체적 및/또는 진행이 없는 생존의 지속기간의 중가를 포함할 수 있다. 백혈병의 경우, 골수 생검이 병의 차도의 정도를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 완전한 병의 차도는 치료 후 30일에 대상체의 골수에서 발견되는 모든 세포 중 5 퍼센트 미만을 이루는 백혈병 세포로 정의될 수 있다.

다음의 참조 문헌은 림프종 및 만성 림프구성 백혈병, 이들의 진단, 치료 및 치료 효능을 측정하기 위한 표준 의학적 절차를 기술한다. Canellos G P, Lister, T A, Sklar J L: The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K and Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, pp 1293-1338, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; and Rai, K and Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia. Chap. 72, pp 1350-1362, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000.

키트

본 발명은 항-CD19 항체 치료에 대한 대상체의 반응성을 특성화하기 위한 키트를 제공한다.

일 구현예에서, 키트는 CD19 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 유효량의 항체를 함유하는 치료적 조성물을 단위 투여 형태로 포함한다.

본 발명의 진단 키트는 상대적인 miR-629의 발현을 측정하기 위한 시약(예를 들어, miR-629 및 하우스키핑 참조 유전자에 대한 TaqMan 프라이머/프로브)을 제공한다.

일부 구현예에서, 키트는 치료적 또는 진단 조성물을 함유하는 멸균 용기를 포함하는데; 이러한 용기는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 가방, 파우치, 블리스터 팩, 또는 당해 분야에 알려진 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 적층된 종이, 금속 호일, 또는 약제를 수용하기에 적합한 기타 물질로 만들어질 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 키트는 miR-629 발현 및 항-CD19 항체를 측정하기 위한 시약을 포함한다. 원한다면, 키트는 miR-629 발현을 측정하기 위한 안내 및/또는 B 세포 악성 종양, 예를 들어, 항-CD19 항체 치료에 반응성인 것으로 선택된 악성 종양을 가지는 대상체에 대한 항-CD19 항체를 투여하기 위한 안내를 포함한다. 특정한 구현예에서, 안내는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 치료제의 설명; B 세포 악성 종양 또는 이의 증상의 치료 또는 예방을 위한 투여 일정 및 투여; 주의 사항; 경고; 지시; 반대 지시; 과잉 투여 정보; 부작용; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참조. 안내는 (존재한다면) 용기에 직접적으로 인쇄될 수 있거나 용기에 적용된 표지 또는 용기 내에 또는 용기와 함께 공급되는 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더일 수 있다.

저해 핵산

저해 핵산 분자는 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 발현을 저해하는 이러한 올리고뉴클레오티드이다. 아래에서 자세히 보고된 바와 같이, 본 발명은 혈액 시료에서 miR-629 발현을 측정함으로써 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 대상체에서 B 세포 악성 종양을 식별하기 위한 방법을 제공하되, 참조에 비해 상대적인 miR-629 발현의 감소의 검출은 항-CD19 항체 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별한다. 이러한 발견의 관점에서, 대상체에서 miR-629의 발현을 감소시키는 방법은 대상체에서 항-CD19 항체 반응성을 유도하거나 향상할 것일 가능성이 있다.

따라서, 본 발명은 miR-629를 표적으로 하고 miR-629의 발현을 감소시키는 단일 및 이중 가닥 저해 핵산 분자(예를 들어, DNA, RNA, 및 이의 유사체)를 제공한다. 예시적인 저해 핵산 분자는 siRNA, shRNA, 및 안티센스 RNA를 포함한다.

siRNA

짧은 21 내지 25개의 뉴클레오티드 이중 가닥 RNA는 유전자 발현을 하향 조절하는데 효과적이다(본원에 참조로서 포함된 Zamore et al., Cell 101: 25-33; Elbashir et al., Nature 411: 494-498, 2001). 포유동물에서의 siRNA의 접근법의 치료적 효과가 McCaffrey 등(Nature 418: 38-39.2002))에 의해 생체 내에서 입증되었다.

miR-629의 서열이 주어지면, siRNA는 miR-629의 발현을 감소시키도록 설계될 수 있다. 이러한 siRNA는 miR-629 발현을 감소시키기 위해 대상체에게 전신적으로 투여될 수 있다. miR-629를 표적으로 하는 21 내지 25개 뉴클레오티드 siRNA는, 예를 들어, B 세포 악성 종양을 치료하기 위한 치료제로서 사용된다.

본 발명의 저해 핵산 분자는 발현의 RNA 간섭(RNAi) 매개 녹다운을 위한 이중 가닥 RNA로서 채용될 수 있다. RNAi는 관심 있는 특정한 단백질의 세포 발현을 감소시키기 위한 방법이다(Tuschl, Chembiochem 2:239-245, 2001; Sharp, Genes & Devel. 15:485-490, 2000; Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genet. Devel. 12:225-232, 2002; and Hannon, Nature 418:244-251, 2002에 보고됨). dsRNA의 형질감염 또는 플라스미드 기반 발현 시스템을 이용한 siRNA의 발현을 통한 세포 내로의 siRNA의 도입은 포유동물 세포에서 기능의 소실 표현형을 생성하기 위해 점점 더 많이 사용되고 있다

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 핵염기 올리고머의 8개 및 9개 사이의 연속적인 핵염기를 포함하는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자가 제조된다. dsRNA는 이중화된 RNA의 2개의 구분되는 가닥 또는 자가 이중화된 단일 RNA 가닥(작은 헤어핀(sh)RNA)일 수 있다. 통상적으로, dsRNA는 약 21 또는 22 염기쌍이지만, 원한다면 더 짧거나 더 길 수 있다(최대 약 29 핵염기). dsRNA는 표준 기술(예를 들어, 화학적 합성 또는 시험관 내 전사)을 사용하여 제조될 수 있다. 키트는, 예를 들어, Ambion(Austin, Tex.) 및 Epicentre(Madison, Wis.)로부터 입수가능하다. 포유동물 세포에서 dsRNA를 발현시키기 위한 방법은, 각각이 참조로서 본원에 포함된, 문헌(Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002; Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002. Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002; Sui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002; Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002; Miyagishi et al. Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; 및 Lee et al. Nature Biotechnol. 20:500-505 2002)에 기술되어 있다.

작은 헤어핀 RNA(shRNA)는 스템 루프 구조를 가지는 RNA 서열을 포함한다. "스템 루프 구조"는 대개 단일 가닥 뉴클레오티드(루프 부위)의 영역에 의해 한 측면 상에 결합된 이중 가닥 또는 이중화(스템 부위)를 형성하는 것으로 알려지거나 예상되는 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 이차 구조를 가지는 핵산을 지칭한다. "헤어핀"이라는 용어는 또한 본원에서 스템 루프 구조를 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 구조는 당해 분야에 잘 알려져 있고 이러한 용어는 당해 분야에서 알려진 의미와 일치하도록 사용된다. 당해 분야에 알려진 바와 같이, 이차 구조는 정확한 염기 짝짓기를 필요로 하지 않는다. 따라서, 스템은 하나 이상의 염기 미스매치 또는 돌출부(bulge)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 염기 짝짓기는 정확할 수 있는데, 즉 어떠한 미스매치도 포함하지 않을 수 있다. 다수의 스템 루프 구조가, 예를 들어, 핵산 링커, miRNA 플랭킹 서열(flanking sequence), 다른 분자, 또는 일부 이의 조합과 같은 링커를 통해 서로 연결될 수 있다.

본원에서 사용된, "작은 헤어핀 RNA"라는 용어는 전구체 miRNA(예비-miRNA)를 형성하는 통상적인 스템 루프 shRNA를 포함한다. 비록 범위에서 일부 차이가 있을 수 있지만, 통상적인 스템 루프 shRNA는 19 내지 29 bp 범위의 스템, 및 4 내지 30 bp 범위의 루프를 포함할 수 있다. shRNA는 DNA 벡터로부터 발현되어 지속적인 침묵(silencing) 및 거의 모든 세포 유형으로의 고수율 전달을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 예시적인 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 배큘로바이러스 및 조류 바이러스 벡터를 포함하는 레트로바이러스를 포함하고 이러한 벡터를 포함하는 것은 안정적인, 단일 카피 유전자 통합을 가능하게 한다. 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유래될 수 있는 레트로바이러스는, 이에 제한되지는 않으나, 몰로니 뮤라인 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유암 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 패키징 세포주에 형질도입되어 생성자 세포주를 형성하기 위해 채용될 수 있다. 형질감염될 수 있는 패키징 세포의 예는, 이에 제한되지는 않으나, 그 전체가 참조로서 본원에 포함된 문헌(Miller, Human Gene Therapy 1:5-14(1990))에 기술된, PE50l, PA3l7, R-2, R-AM, PA12, T19-14x, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DAN 세포주를 포함한다. 벡터는 당해 분야에 알려진 임의의 수단을 통해 패키징 세포에 형질도입될 수 있다. 생성자 세포주는 DNA 복제 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성한다. 그런 다음, 이러한 레트로바이러스 벡터 입자는 시험관 내 또는 생체 내에서 진핵 세포에 형질도입되기 위해 채용될 수 있다. 형질도입된 진핵 세포는 DNA 복제 단백질을 발현할 것이다.

본 발명의 안티센스 서열을 포함하는 촉매 RNA 분자 또는 리보자임은 핵산 분자의 생체 내 발현을 저해하기 위해 사용될 수 있다. 안티센스 RNA 내 리보자임 서열의 포함은 이들에게 RNA-절단 활성을 부여함으로써, 구조체의 활성을 증가시킨다. 표적 RNA-특이적 리보자임의 설계 및 용도는 각각이 참조로서 포함된 문헌(Haseloff et al., Nature 334:585-591. 1988) 및 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0003469 A1에 기술되어 있다.

따라서, 본 발명은, 또한, 결합 부문(arm)에, 8개 및 9개 사이의 연속적인 핵염기를 가지는 안티센스 RNA를 포함하는 촉매 RNA 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 촉매 핵산 분자는 해머헤드 또는 헤어핀 모티프로 형성된다. 이러한 해머헤드 모티프의 예는 문헌(Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8:183, 1992)에 기술되어 있다. 헤어핀 모티프의 예는 문헌(1988년 9월 20일에 출원된 미국 일련 번호 07/247,100에 부분적으로 연속인 1989년 9월 20일에 출원된 Hampel et al., "RNA Catalyst for Cleaving Specific RNA Sequence,", Hampel and Tritz, Biochemistry, 28:4929, 1989, 및 Hampel et al., Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990)에 기술되어 있다. 이러한 특이적인 모티프는 본 발명을 제한하는 것이 아니며 당업자는 본 발명의 효소 핵산 분자에서 중요한 모든 것은 하나 이상의 표적 유전자 RNA 영역에 상보적인 특이적인 결합 자리를 가지고, 기질 결합 자리 내 또는 주위에 분자에 RNA 절단 활성을 부여하는 뉴클레오티드 서열을 가진다는 것이라는 점을 인식할 것이다.

핵산 구조체를 세포에 도입하기 위한 임의의 방법이 필수적으로 채용될 수 있다. 핵산을 도입하는 물리적인 방법은 구조체를 함유하는 용액의 주사, 구조체에 의해 둘러싸인 입자에 의한 포격, 세포 조직 시료 또는 유기체를 핵산의 용액에 적심, 또는 구조체의 존재 하 세포 막의 전기천공을 포함한다. 바이러스 입자로 패키징된 바이러스 구조체는 세포 내로의 발현 구조체의 효율적인 도입 및 암호화된 shRNA의 전사를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 핵산을 세포에 도입하기 위한 당해 분야에 알려진 다른 방법, 예를 들어, 지질 매개 담체 이송, 화학물, 예를 들어 인산칼슘 매개 이송 등이 사용될 수 있다. 따라서 shRNA를 암호화화는 핵산 구조체는 다음의 활동 중 하나 이상을 수행하는 성분과 함께 도입될 수 있다: 세포에 의한 RNA 흡수의 향상, 이중화 가닥의 어닐링 촉진, 어닐링된 가닥의 안정화, 또는 그렇지 않으면 표적 유전자의 저해의 증가.

세포 내 발현을 위해, DNA 벡터, 예를 들어 RNA 폴리머라제 II 또는 RNA 폴리머라제 III 프로모터를 포함하는 플라스미드 벡터가 채용될 수 있다. 내인성 miRNA의 발현은 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 프로모터에 의해 조절되고, 일부 사례에서, shRNA는 RNA 폴리머라제 III 프로모터에 비하여 Pol II 프로모터에 의해 가장 효율적으로 유도된다(Dickins et al., 2005, Nat. Genet. 39: 914-921). 일부 구현예에서, shRNA의 발현은, 제한 없이, RNA 폴리머라제 II형 프로모터를 포함하는 유도성 프로모터 또는 조건 발현 시스템에 의해 조절될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 유용한 프로모터의 예는 테트라사이클린-유도성 프로모터(TRE-tight를 포함함), IPTG-유도성 프로모터, 테트라사이클린 전사 촉진 인자 시스템, 및 역 테트라사이클린 전사 촉진 인자(rtTA) 시스템이다. 항시적 프로모터가 또한 사용될 수 있는데 세포- 또는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 모든 세포 및 조직 유형에서 발현되도록 많은 프로모터는 보편적일 것이다. 일정한 구현예는 시험관 내 및 생체 내 연구에서 가장 효과적인 조건 유전자 발현 시스템 중 하나인 테트라사이클린-반응성 프로모터를 사용한다. 유도성 shRNA의 기술에 관해서는 각각이 참조로서 본원에 포함된 국제 특허 출원 PCT/US2003/030901(공개 번호 WO 2004-029219 A2) 및 문헌(Fewell et al., 2006, Drug Discovery Today 11: 975-982)을 참조한다.

폴리뉴클레오티드의 전달

원래의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 유사체는 포유동물 세포 내로 도입될 수 있고 관심 있는 유전자의 발현을 저해할 수 있다. 그렇지만, 올리고뉴클레오티드 또는 다른 핵염기 올리고머의 세포 내 전달을 돕는 제형을 활용하는 것이 바람직할 수 있다(예를 들어, 각각이 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 번호 5,656,611, 5,753,613, 5,785,992, 6,120,798, 6,221,959, 6,346,613, 및 6,353,055 참조).

본 발명의 실행은, 다르게 지시되지 않는 한, 당업자의 이해의 범위 내에 속하는 분자 생물학(재조합 기술을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 채용한다. 이러한 기술은, 예를 들어, 문헌("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991))에 완전히 설명되어 있다. 이러한 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 생성하는데 적용될 수 있고, 이처럼, 본 발명의 제조 및 실행 시 고려될 수 있다. 특정 구현예를 위한 특히 유용한 기술이 이어지는 섹션에서 논의될 것이다.

다음의 실시예는 당업자에게 본 발명의 완전한 개시 및 검정, 스크리닝 및 치료적 방법을 어떻게 제조하고 사용하는지에 대한 설명을 제공하기 위해 기술되며 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주한 것의 범위를 제한하고자 하는 의도가 아니다.

실시예

실시예 1: miR -629 수준은 항-CD19 항체 민감성 세포주에서 감소한다.

시험관 내 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 검정을 사용하여 다수의 인간 비호지킨 B 세포 림프종 세포주가 항-CD19 항체 치료에 높거나 낮은 민감성을 가지는 것으로 식별되었다. 특히, Karpas-422, 인간 B 세포 비호지킨 림프종, Oci-Ly-19, 미만성 거대 세포 림프종, SUD-HL-6, 소포성 B 세포 림프종(ATCC® CRL2959™), 및 Toledo 세포주, 비호지킨 림프종 모델 시스템은 항-CD19 항체 치료에 높은 민감성을 가지는 것으로 식별되었다. 반대로, DB(미만성 거대 세포 림프종), ARH-77(EBV로 형질전환된 B 림프아구성 세포주), 및 RL(비호지킨 림프종 B 세포주)은 항-CD19 항체 치료에 낮은 민감성을 가지는 것으로 식별되었다.

이러한 세포주는 마이크로 RNA 발현을 분석함으로써 특성화하였다. 마이크로 RNA/miRNA는 다수의 표적 mRNA의 번역을 저해하는 작은 단일 가닥 RNA 분자이다. miRNA의 역할이 심혈관 질환, 당뇨병, 암, 및 기타 질환에서 식별되어 있다. 다양한 치료제에 대한 반응을 예상하는 데 있어서의 miRNA의 역할은 잘 이해되어 있지 않다.

흥미롭게도, 항-CD19 항체 치료에 대한 민감성이 다양한 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL 또는 DLBL) 세포주 사이에서 상이하게 발현되는 17종의 miRNA가 식별되었다. 이러한 차이점은 Affymetrix miRNA 마이크로어레이 및 TaqMan qPCR을 포함하는 다수의 플랫폼에서 관찰되었다.

다음의 마이크로 RNA가 유의한 차이를 가졌다: miR-629; miR-99b; miR-let-7e; miR-15a; 및 miR-29a. 가장 유의한 차이는 miR-629의 발현에 있었다. miR-629 발현 수준은 항-CD19 항체에 낮은 민감성을 가지는 세포주보다 항-CD19 항체 치료에 높은 민감성을 가지는 미만성 거대 B 세포 림프종 세포주에서 유의하게 낮았다(도 1a 및 1b). 낮은 민감성 대 높은 민감성의 결정에서, 높은 민감성 세포주에 대한 EC50은 시험관 내 ADCC 검정에서 낮은 민감성 세포주보다 적어도 100배(다른 경우, 1000배 이상) 더 낮았다.

요약하면, miR-629 발현은 항-CD19 항체(MED-551)로의 시험관 내 ADCC에 대해 높은 민감성(n=4) 대 낮은 민감성(n=3)의 세포주 사이에서 유의하게 차이가 났다. 이러한 효과는 항-CD19 항체에 대한 반응에 특이적인 것으로 보인다. miR-629 발현에서의 변형은 리툭시맙에 대한 반응성과 상호연관되지 않았다.

실시예 2: miR -629 발현은 항-CD19 항체 치료에 반응성인 미만성 거대 B 세포 림프종 환자에서 감소되었다 .

재발되거나 난치성 진행성 B 세포 악성 종양을 가지는 성인 대상체에서 임상 시험 번호 CP204, 1상, MEDI-551의 용량 증가 연구, CD19에 대해 유도된 인간화 단일클론 항체에서, miR-629 발현 수준은 단일 제제로서 항-CD19 항체 치료로 치료된 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 소포성 림프종(FL), 및 만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자로부터의 기준선 전장 혈액 시료에서 측정되었다.

항-CD19 항체 치료를 받는 환자는 완전한 또는 부분적인 반응을 가지는 것으로 카테고리화되었다.

● CR/PR(완전한 또는 부분적인 반응): 5명의 미만성 거대 B 세포 림프종, 6명의 소포성 림프종, 3명의 만성 림프구성 백혈병

● PD(진행성 질환): 10명의 미만성 거대 B 세포 림프종, 2명의 소포성 림프종, 및 3명의 만성 림프구성 백혈병

● SD(안정한 질환): 4명의 미만성 거대 B 세포 림프종, 3명의 소포성 림프종, 및 9명의 만성 림프구성 백혈병

miR-629 발현 수준은 MEDI-551 또는 리툭시맙 + 벤다무스틴(CP-1019)으로 치료받은 만성 림프구성 백혈병 환자로부터의 기준선 말초혈액단핵구 세포(PBMC) 시료에서 측정되었다.

● 22명의 MEDI-551로 치료받은 환자(10 CR/PR; 3 PD; 4 SD)

● 12명의 리툭시맙로 치료받은 환자(6 CR/PR; 2 PD; 2 SD)

놀랍게도, miR-629 발현은 비반응자(PD) 대비 항-CD19 항체로의 치료에 완전한 또는 부분적 반응(CR/PR)을 보인 미만성 거대 B 세포 림프종 환자에서 유의하게 낮았다(약 7배)(도 2). miR-629 발현은 항-CD19 항체로의 치료 전 전장 혈액 시료에서 측정되었다. 요약하면, I상 임상 시험 데이터는 기준선 miR-629 발현이 항-CD19 항체(MEDI-551)에 반응하였던 미만성 거대 B 세포 림프종 환자에서 더 낮았다는 것을 입증하였다. 흥미롭게도, miR-629 발현은 정상 대조군 대상체로부터 수득한 혈액 시료 내 존재하는 miR-629의 수준에 비해 미만성 거대 B 세포 림프종을 가지는 환자의 시료에서 유의하게 증가하였다.

miR-629 발현의 수준을 항-CD19 항체(MEDI-551) 더하기 ICE/DHAP 또는 리툭시맙 더하기 ICE/DHAP로 치료받은 환자 사이에서 비교하였다. miR-629 수준은 ICE/DHAP와 조합된 항-CD20 항체 치료요법에 반응하는 환자에 비해 ICE(이포스파미드, 카보플라틴 및 에토포시드)/DHAP와 조합하여 투여된 항-CD19 항체 치료에 반응하는 환자에서 증가하거나 감소하는 것을 특징으로 한다. 이러한 연구는 또한 리툭시맙으로의 치료에 반응하는 환자에 비해 항-CD19 항체에 반응하는 DLBCL 환자에서 특히 감소하는 임의의 miR-629의 변형을 특징으로 할 것이다. 본 연구의 결과는 도 5에 나타나 있다.

실시예 3: miR -629 발현은 항-CD19 항체 치료에 반응성인 소포성 림프종 환자에서 감소하였다.

miR-629 발현 수준은 항-CD19 항체로의 치료 전 소포성 림프종 환자로부터의 전장 혈액 시료에서 측정되었다. miR-629 발현은 정상 혈액에 비하여 소포성 림프종 혈액에서 유의하게 증가한다.

miR-629 발현은 (도 3)에서 소포성 림프종 비반응자(PD)보다 항-CD19 항체 치료(CR/PR)에 반응하였던 소포성 림프종 환자로부터 수득한 전장 혈액 시료에서 상당히 더 낮았다(약 5배).

실시예 4: miR -629 발현은 만성 림프구성 백혈병 환자에서 증가한다

miR-629 발현은 정상 대조군 대상체에서 수득한 혈액에 비해 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 가지는 환자로부터 수득한 전혈에서 증가하였다. 예비 결과는 miR-629 발현이 만성 림프구성 백혈병 비반응자보다 항-CD19 항체 치료(CR/PR) 에 반응하였던 만성 림프구성 백혈병 환자로부터 수득한 전장 혈액 시료에서 더 낮았다는 것을 나타내는 것으로 보인다(도 4). 이러한 초기 관찰은 추가적인 환자에 의해 확증될 것이다.

실시예 5: 예비 데이터는 miR -629 발현이 항-CD19 항체-ICE( 벤다무스틴 ) 치료에 반응성인 만성 림프구성 백혈병 환자에서 감소하였다는 것을 보여준다.

miR-629 발현은 치료 전 만성 림프구성 백혈병 환자로부터 수득한 전혈에서 측정되었다. 리툭시맙-ICE 치료요법 대 항-CD19 항체-ICE 치료요법에 대한 환자의 반응을 특성화하였다(도 5a 및 5b). 비록 시료 크기가 작지만, 리툭시맙-ICE으로 치료된 CR/PR 및 PD 환자 사이에서는 miR-629 발현 수준 사이에서 어떠한 연관도 발견되지 않았다(도 5b). 반대로, miR-629 발현 수준은 항-CD19 항체-ICE 반응성 만성 림프구성 백혈병 환자에서 더 낮았다.

실시예 6: miR -629 발현은 항-CD19 항체 치료에 반응성인 미만성 거대 B 세포 림프종 환자에서 낮았다

miR-629 발현은 항-CD19 항체(MEDI-551)에 높은 민감성을 가지는 미만성 거대 B 세포 림프종 세포주에서 더 낮았다(도 5c). 리툭시맙에 대한 민감성을 기반으로 하여 미만성 거대 B 세포 림프종 세포주에서 이러한 상관성은 관찰되지 않았다(도 5d). CP1088 임상에서 유사한 관찰이 미만성 거대 B 세포 림프종 환자에서 이루어졌다(도 5e).

miR-629 발현은 치료 전 미만성 거대 B 세포 림프종 환자로부터 수득한 전장 혈액 시료에서 측정하였다. 19명의 환자가 항-CD19 항체(MEDI-551) 및 화학요법(ICE 또는 DHAP)으로 이어서 치료받았다. 17명의 환자는 리툭시맙으로 치료받았다. 흥미롭게도, miR-629 발현은 비반응자(SD/PD) 대비 항-CD19 항체(MEDI-551) 치료(CR/PR)에 반응하였던 환자에서 유의하게 낮았다(약 4배)(도 5e). 이는 환자가 2 mg/kg 또는 4 mg/kg의 항-CD19 항체(MEDI-551)로 치료받았는지에 관계없이 사실이었다(도 5e 및 5f). 리툭시맙 반응성에 관하여 이러한 상관성은 관찰되지 않았다(도 5e).

실시예 7: miR -629 발현 수준은 항-CD19 항체 치료에 반응하지 않았던 환자에서 증가하였다.

흥미롭게도, miR-629 발현 수준은 항-CD19 항체(CR/PR)에 반응하였던 DLBCL 대상체에서 치료 전 및 후에 유사하였다(도 6a 및 6b). 반대로, miR-629 발현 수준은 진행성 질환(PD)을 가지는 환자에서 치료 후 증가하는 경향이 있었다(도 6c). 이러한 결과는 miR-629가 항-CD19 항체(MEDI-551)에 대한 반응성에서 특이적인 역할을 수행하여, 암 진행이 마이크로 RNA의 수준과 상호연관된다는 것을 나타낸다.

실시예 8: miR629 발현은 건강한 대조군에 비해 림프종 환자에서 더 높다.

miR-629는 TaqMan 정량적 PCR(도 7b) 또는 miRNA 마이크로어레이 분석(도 7a)을 사용하여 측정할 때 건강한 자원자에 비해 림프종(미만성 거대 B 세포 림프종 및 소포성 림프종)을 가지는 모든 환자에서 높다. 실시예 1 내지 6에서, miR-629는 TaqMan 정량적 PCR에 의해 측정되었다.

림프종 혈액에서 miR-629의 공급원은 알려져 있지 않다. 그렇지만, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 또는 만성 림프구성 백혈병에서 B 세포의 수의 변형을 반영하는 것 같지는 않다. 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 또는 만성 림프구성 백혈병 환자에서 miR-629 수준 및 기준선 B 세포 개수(CD19 또는 CD20) 사이의 관련성은 관찰되지 않았다.

miR-629는 건강한 전혈에 비해 미만성 거대 B 세포 림프종 환자의 전혈에서 더 높은 수준(최소 16배)으로 발현되었다. miR-629 수준은 다른 세포 유형에 비해 정상 단핵구 및 B 세포에서 높다. miR-629 발현은 CD14⁺ 및 CD19⁺ 세포에서 높다. 이러한 수준은 미만성 거대 B 세포 림프종/소포성 림프종 환자에서 관찰되는 것보다 상당히 낮은 채로 유지된다(도 8).

실시예 9: miR -629 과발현은 화학요법으로 유도된 아폽토시스 및 세포 증식의 소실로부터 보호한다

miR-629를 과발현하는 Karpas-422 세포주를 도 9a에 나타낸 miR-629 발현 벡터를 사용하여 제조하였다. Karpas-422 세포는 시험관 내 ADCC에서 항-CD19 항체(MEDI-551)에 고도로 반응하고 낮은 수준의 miR-629를 가지는 DLBCL 세포주이다. 세포는 또한 miR-629 발현 수준에 대한 시각적인 모니터링을 제공하였던 GFP 보고자를 발현하였다(도 9b). 세포는 miR-629 발현 벡터 또는 miR-629 전구체 삽입물을 포함하지 않았던 대조군 벡터로 형질감염되었다. 그런 다음, 세포를 GFP 발현에 기반한 FACS로 miR-629을 높게 발현하는 군집 및 miR-629을 낮게 발현하는 군집으로 분류하였다. miR-629를 발현하는 단일 세포 콜로니를 또한 제한 희석으로 제조하였다. 상대적인 miR-629 발현의 수준이 도 9c에 나타나 있다.

도 10a 및 10b는 miR-629를 과발현하는 Karpas-422 림프종 세포에서 카스파제 활성화를 나타낸 것이다. 흥미롭게도, miR-629 과발현은 Karpas-422 림프종 세포를 화학요법(에토포시드)으로 유도된 아폽토시스로부터 보호하였다(도 10a 및 10b).

miR-629 과발현은, 또한, Karpas-422 림프종 세포를 화학요법(에토포시드)으로 유도된 세포 증식의 소실로부터 보호하였다(도 11a 및 11b). 따라서, B 세포 악성 종양에서 miR-629 수준을 감소시키기 위한 방법은 화학요법에 대한 민감성(즉, 화학요법의 세포 증식을 감소시키고 아폽토시스를 증가시키는 능력)을 회복시킬 것으로 기대된다.

실시예 10: miR -629 과발현은 자발적인 락테이트 데하이드로게나제 ( LDH ) 방출을 증가시켰다

miR-629 과발현은 시험관 내 자발적인 LDH 방출의 증가 및 시험관 내 ADCC에서 항-CD19 항체 치료에 대한 Ec50의 약간의 전이와 연관되었다(도 12a 및 12b).

실시예 11: 기준선 miR -629 발현은 MEDI-551 및 화학요법에 대한 반응을 예측한다

도 13은 항-CD19 항체(MEDI-551) 또는 리툭시맙으로 치료된 환자의 반응의 로지스틱 회귀 분석 및 miRNA 특징 발현(치료 전 PBMC 시료에서 측정되고 건강한 자원자에서의 발현에 대한 배율 변화로 나타냄)을 제공한다. miRNA 데이터 및 ≥ 1 기준선 후 질환 평가를 가지는 환자만 분석에 포함하였다. 도 13에 나타낸 곡선은 회귀 모델에 기반한 miRNA 특징 수준에 걸친 반응의 예측된 가능성을 나타낸 것이다. 2개의 곡선(치료와 바이오마커 사이 상호작용을 나타냄)을 가로지는 것은 miRNA 특징이 만성 림프구성 백혈병에서 항-CD19 항체(MEDI-551) 반응성에 대한 예측가능한 바이오마커일 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 기준선 miR-629 발현은 항-CD19 항체(MEDI-551) 및 화학요법에 대한 반응을 예측하지만, 리툭시맙 및 화학요법(ICE- 벤다무스틴)에 대해서는 그렇지 않다.

실시예 12: miR -629 발현 변형의 효과.

miR-629의 변형의 항-CD19 항체로의 치료(MEDI551)에 대한 민감성에 대한 효과를 연구하였다. 인간 백혈병 및 림프종 세포주인 Daudi, Toledo, 및 RL은 미국 세포 은행(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 수득하였고; Karpas 1106P, Karpas 422, OCI-Ly-19, MEC2는 독일 생물 자원 센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ, 독일)로부터 수득하였다. 세포주를 PrimeFect(Lonza)를 사용하여 50 uM의 miR-629 모사체(Karpas 1106P, Karpas 422, Daudi, MEC2, OCI-Ly-19, SU-DHL-6, 및 Toledo), miR-629 헤어핀 저해제(RL 및 ARH-77), 또는 각각의 음성 대조군 올리고뉴클레오티드(모두Dharmacon으로부터 얻음)로 24시간 동안 형질감염시켰다. CD19 및 CD20 표면 발현을 각각의 형광으로 표지된 단일클론 항체를 사용하여 유세포 분석(LSRII, BD Biosciences)으로 결정하였다. 표면 발현은 평균형광 강도(MFI)로 보고되고 miR-629 및 음성 대조군으로 형질감염된 세포뿐 아니라 미형질감염된 세포에 대하여 평균을 내었다. miR-629가 과발현되었을 때, MEC-2 및 Daudi 세포주는 항-CD19 항체(MEDI551)에 대해 15~25% 감소된 민감성을 나타내었던 반면(도 14a 및 14b), Toledo, 및 SU-DHL-6 세포주에서는 세포독성에서 15~20% 차이가 관찰되었다(도 14c 및 14d).

CD19 및 CD20 표면 발현에 대한 miR-629 과발현의 효과는 항-CD19 항체로의 치료(MEDI551)에 대한 민감성이 상이한 9종의 세포주에서 평가하였다(도 15a 및 15b). CD19 및 CD20 발현은 알로피코시아닌(APC) 접합 항체를 사용하여 측정되었다. 평균형광 강도(MFI)비는 대조군으로 형질감염된 세포, miR 형질감염된 세포, 및 비형질감염된 세포에서 측정되었다. CD19 또는 CD20 표면 발현에서는 miR-629 과발현에 대한 반응에서 어떠한 변형도 관찰되지 않았다. 이는 CD19 및 CD20 발현에서의 변형이 항-CD19 항체에 대한 세포의 민감성에서의 차이를 설명하지 않는다는 것을 시사한다(MEDI551).

실시예 13: R-CHOP 마이크로 RNA 특징 및 항-CD19 항체(MEDI-551) 마이크로 RNA 특징( miR -629 발현) 사이에는 상호연관이 존재하지 않는다.

miRNA 특징은 리툭시맙, 사이클로포스파미드, 하이드록시다우노마이신(또는 독소루비신), 빈크리스틴 또한 (ONCOVIN ®)으로 명명됨, 및 프레드니솔론을 포함하는 화학치료 조합 R-CHOP로 치료된 미만성 거대 B 세포 림프종 환자에서 생존의 증가를 예측하는 것으로 나타났다(Alencar et al., Clin. Cancer Res. 2011; 17:4125-35). DLBCL 환자로부터의 기준선 혈액 시료에서 이러한 특징의 발현 및 miR-629의 발현 사이에 어떠한 상호연관성도 관찰되지 않았다(도 16). 이러한 결과는 임상적으로 관찰된 MEDI-551 반응 연관 miRNA 특징의 특이성을 뒷받침하는 것이다.

실시예 14: miR -629는 엑소좀에서 관찰되었다.

엑소좀은 종양 세포를 포함하는, 모든 세포가 아닌 경우는, 대부분의 세포 유형에서 체액 내로 방출되는 세포 유래 소낭이다. 증거는 종양 발달 및 진행에 관련된 과정에서 엑소좀 매개 세포내 의사소통의 중요한 역할을 시사한다.

총 엑소좀 단리 키트(Invitrogen, cat #4478359)를 사용하여, 엑소좀을 mIR-629 또는 miRNA 스크램블 대조군을 안정적으로 과발현하는 Karpas-422 세포주의 상등액으로부터 단리하였다. 세포 배양 배지를 수확하였고 2,000xg로 30분간 회전시켜 세포 및 찌꺼기를 제거하였다. 무세포 배양 배지를 새로운 튜브로 옮겼고, 0.5 부피 총 엑소좀 단리 시약으로 처리하였다. 배양 배지 및 시약을 파이펫팅 또는 볼텍싱으로 균일한 용액이 얻어질 때까지 잘 혼합하였다. 시료를 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 항온배양 후, 시료를 10,000xg에서 1시간 동안 4℃에서 회전시켰다. 상등액을 빨아내고, 폐기하였고, 펠렛화된 엑소좀을 0.2 부피의 엑소좀 재현탁 완충액(Invitrogen, cat #4478545)에 재현탁하였다. 재현탁된 엑소좀을 상온에서 5~10분 간 항온배양하였다. 변성 용액을 37℃까지 미리 데웠고, 1 부피를 엑소좀 현탁액에 첨가하였다. 용액을 얼음에서 10분간 항온배양한 다음 시작 엑소좀 시료 부피에 비례하여 1 부피 산:페놀:클로로포름을 사용하여 추출하였다. 시료를 30 내지 60초간 볼텍싱하였고 13,000xg로 상온에서 5초간 회전시켰다. 수상을 새로운 튜브로 옮겼고 시료 당 1.25 부피 EtOH를 첨가하였다. 철저한 혼합 후, 700 uL 시료를 Zymo 컬럼(Zymo Research, ZR RNA MicroPrep, cat # R1060/R1061)에 넣었고 10,000xg로 15초간 회전시켰다. 모든 용해물이 필터를 통과할 때까지 이러한 절차를 반복하였다. 세척 I 700 uL를 첨가하고 위와 같이 회전시켰다. 세척 II를 500 uL를 사용하여 수행하였고, 위와 같이 회전시켰고 1X 반복하였다. 최종 회전을 10,000xg로 1분간 수행하여 남은 액체를 제거하였다. 엑소좀 RNA를 20 uL 사전가열된(95℃) 무 뉴클레아제수를 사용하여 신선한 수집 튜브에 용리하였다. 컬럼을 10,000xg로 30초간 회전시켰고 용리액을 추가적인 5 uL 무 뉴클레아제수를 포함하는 동일한 컬럼에 재적용하였고 동일한 조건 하에 2차로 회전시켰다. Pico Agilent 칩을 사용하여 시료를 정량하였고 반정량하였다. 흥미롭게도, miR-629는 miR-629를 과발현하는 세포주에 의해 분비된 엑소좀에서 확인되었다. miR-629는 대조군 세포에 비해 이러한 엑소좀에서 12~20배만큼 과발현되었다 (도 17).

이론에 얽매이길 바라지 않으면서, 종양에서 유래된 miR-629는 엑소좀을 통해 자연 살해(NK) 세포에 전달되어, NK 세포 활성화를 감소시킬 수 있다. NK 세포는 염증성 사이토카인을 생성하고, 자발적으로 표적 세포를 살상하는 과립성 림프구이다. miR-629의 기준선 수준이 높으면, 이러한 가설은 NK 세포 활성이 낮을 것이라는 것을 시사한다. 항-CD19 항체(MEDI551)는 따라서 NK 세포 매개 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 통해 감소된 활성을 가지고 치료에 대해 불량을 반응을 초래할 수 있다. 기준선에서 낮은 miR-629은 리툭산(또한 리툭시맙으로도 지칭됨)에 대해 증가된 반응을 초래하는 것으로 기대되지 않을 수 있는데, 이는 리툭산이 NK 세포 매개 ADCC에 추가하여 다른 작용 기전을 통해 작용하는 반면 MEDI551는 그렇지 않기 때문이다.

실시예 15: miR -629 과발현은 NK 세포 기능을 변형한다

NK 세포 기능에 대한 miR-629의 효과를 세포 용해 경로 유전자(예를 들어, 그랜자임 B(GZMB), GZMA, GZMM, 카텝신 B 및 D, 퍼포린 1), 세포 표면/부착 분자(예를 들어, CD96(TACTILE), CD63 그래눌로피신), 및 NK 세포 활성화 수용체를 포함하는, NK 세포 활성화 중 변형되는 것으로 알려진 유전자의 발현을 분석함으로써 평가한다. NK 세포 기능은, 또한, 인터페론-감마 또는 그랜자임 B ELISA에서 분석될 수 있다. 그랜자임은 세포독성 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포 내 세포질 과립에 의해 방출되는 세린 프로테아제이다. 그랜자임은 암 세포를 포함하는 표적 세포에서 프로그램된 세포 사멸을 유도한다.

초기 결과는 miR-629 과발현이 NK 세포 기능을 변형시킨다는 것을 나타낸다(도 18a 및 18b). NK 세포 기능에 대한 miR-629 과발현의 효과는 miR-629 뉴클레오펙션 후 분석되었다. miR-629 수준은 뉴클레오펙션 후 증가하였다(도 18a). 그리고 이러한 증가는 세포 용해 경로 및 NK 활성화/부착과 관련된 유전자에서 40~60% 감소를 초래하였다. 분석된 유전자는 그랜자임 B, 그랜자임 A, 그랜자임 M, 카텝신 D, 퍼포린 1, CD63, CD96, 및 인터페론 조절 인자 7을 포함한다(도 18b). 뉴클레오펙션은 다음의 방법론을 사용하여 수행되었다, NK-92 세포(ATCC #CRL-2407)를 2 mM 글루타민, 10% FBS 및 10 ng/mL IL-2(PeproTech # 200-02)를 포함하는 Advanced RPMI(LifeTech) 배지에서 0.2-1.5e6 세포/mL의 밀도로 유지시켰고 3~4일마다 계대배양하였다. NK-92 세포를 Amaxa Cell Line Nucleofector 키트 R 및 Amaxa Nucleofector II 장치(Lonza)를 다음과 같이 사용하여 뉴클레오펙션하였다. 1.5 mL 배양 배지를 적절한 수의 웰에 채워 12-웰 조직 배양 플레이트를 준비하였고 가습 37℃/5% CO2 항온배양기에서 사전항온배양하였다. 0.45 mL 보조제를 2.05 mL Cell Line Nucleofector 용액 R에 첨가하여 뉴클레오펙션 워킹 용액을 제조하였다. 단일 뉴클레오펙션의 경우, 5e6 세포를 상온에서 90xg로 10분간 회전하여 가라 앉히고, 100 uL RT 뉴클레오펙션 워킹 용액에 재현탁하였고 200 nM miR-629 모사체, 저해제 또는 스크램블 대조군과 조합하였다. 세포/RNA 현탁액을 큐벳으로 옮기고, Nucleofector II 장치에 넣었고, U-001 NK 프로그램을 적용하였다. 큐벳을 장치로부터 제거하였고, 500 uL 사전 평형화된 배양 배지를 첨가하였다. 그런 다음, 시료를 준비된 12-웰 플레이트(최종 부피 웰 당 대략 2 mL 배지/세포)로 옮기고 가습 37℃/5% CO2 항온배양기에서 항온배양하였다. 본원에서 위에 보고된 바와 같이, miR-629은 항-CD19 항체(MEDI-551)로의 시험관 내 항체 의존성 세포 세포독성에 높은 민감성 대비 낮은 민감성을 가지는 세포주 사이에서는 유의하고 상이하게 발현되었지만, 리툭시맙에서는 그렇지 않았다. miR-629(다른 miR 중)는 항-CD19 항체(MEDI-551) 치료에 대한 환자 반응의 예측에서의 임상 유용성을 평가하기 위한 B 세포 악성 종양 1상 및 2상 임상 시험에서 시험하기 위해 사전 지정되었다. 놀랍게도, miR-629 발현은 항-CD19 항체로의 치료(MEDI-551)에 반응하였거나 반응하는데 실패하였던 미만성 거대 B 세포 림프종을 가지는 환자 사이에서 기준선 혈액 시료에서 유의하게 달랐다. 이러한 효과는 단일 제제(Ph1) 및 화학치료 조합 연구 (Ph2)에서 재현가능하였다. 이러한 효과는 리툭시맙으로는 관찰되지 않았다. 흥미롭게도, 낮은 수준의 miR-629를 가지는 환자는 항-CD19 항체(MEDI-551)에 대해 증가된 반응률을 보였지만, 리툭시맙에 대해서는 그렇지 않았다. 이러한 관찰은, 적어도 부분적으로, 엑소좀 내 존재 또는 다른 수단을 통해 NK 세포 활성화 마커를 변형키는 miR-629의 능력에 기인한 것일 수 있다. 이러한 결과는 항-CD19 항체(MEDI-551)에 대한 반응을 매개하는 데 있어서의 miR-629의 역할을 뒷받침하지만, 리툭시맙에서는 그렇지 않다.

RNA 단리

총 RNA는 마이크로 RNA PAXgene 혈액 RNA 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 림프종 및 백혈병 환자 또는 건강한 자원자로부터의 PAXgene 혈액 튜브로부터 추출하였다. 만성 림프구성 백혈병 환자로부터의 세포주 및 PBMC 시료의 경우, 시료를 miRVana miRNA 단리 키트(Life Technologies)를 제조자의 안내에 따라 사용하여 단리하였다. RNA 순도 및 농도를 분광광도법으로 결정하였다(260/280>1.9). RNA 품질은 RNA 6000 Nano LabChip^®을 사용한 Agilent 2100 Bioanalyzer 상에서 평가하였다.

TaqMan Q- PCR

TaqMan 분석을 위해, Multiscribe RT 및 miRNA 프라이머 풀을 제조자의 안내에 따라 사용하여 250~300 ng의 총 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 얻어진 cDNA를 TaqMan PreAmp Master Mix 및 miRNA 프라이머 풀을 사용하여 12.5 uL 2X TaqMan PreAmp Master Mix, 2.5 uL 10X Megaplex PreAmp 프라이머, 7.5 uL H₂O 및 2.5 uL RT 생성물을 함유하는 반응물에서 사전증폭하였다. 사이클링 후, 증폭된 시료를 DNA 현탁 완충액(TEKnova, Hollister, CA)에 1:4로 희석하였고 -20℃에서 보관하거나 PCR용으로 즉시 사용하였다. 사전증폭된 물질에 대한 실시간 PCR은 miR-629 및 하우스키핑 참조 유전자 RNU44, U6, U47, 및 RNU24(Life Technologies)에 특이적인 TaqMan 검정을 사용한 BioMark 실시간 PCR 시스템으로 수행하였다. 28을 초과하는 사이클 임계(Ct)값은 계산에서 배제하였다. 델타 Ct 값(ΔCt)을 4종의 참조 유전자(RNU44, U6, U47, 및 RNU24)의 평균을 사용하여 계산하였다. 델타 Ct 값이 비교를 위해 사용되는 경우, 델타 Ct 값이 발현과 역관련됨으로, 높은 델타 Ct 값은 낮은 miR-629 발현이라는 주지하는 것이 중요하다. 배율 변화값은 대조군로서 건강한 자원자에서의 miR-629 발현을 이용하여 2^-△△Ct을 계산함으로써 결정되었다.

안정적인 세포주 생성

미만성 거대 B 세포 림프종 세포주 Karpas-422를 miR-629 또는 스크램블 miRNA 대조군을 과발현하는 렌티바이러스 벡터(Open Biosystems, Huntsville, AL)로 2~20의 MOI로 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 1~2주간 증식시켰다. RFP를 활용하여, 세포를 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 높은 miR-629 및 낮은 miR-629 군집으로 분류하였다. 콜로니를 또한 제한 희석 방법을 사용하여 생성하였다. miR-629의 과발현은 TaqMan QPCR에 의해 평가되었다.

세포 성장 및 아폽토시스 검정

miR-629를 과발현하는 림프종 세포를 5 μM 또는 10 μM의 에토포시드로 처리한 다음, 세포 생장 및 아폽토시스를 측정하였다. 세포 성장을 에토포시드 치료 24시간 및 48시간 후 제조자의 프로토콜에 따라 Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega, Madison, WI)로 측정하였다. 카스파제 활성화를 제조자의 프로토콜에 따라 Caspase-Glo 3/7 Assay(Promega)을 사용하여 에토포시드 치료 48시간 후에 측정하였다. 모든 발광 데이터는 SpectraMax M5 플레이트 판독기(Molecular Devices, LLC. Sunnyvale, CA)에서 수집하였다.

통계적 분석

마이크로 RNA 발현 배율 변화값을 웰치스 T 검정(Welch's t-test) 또는 맨-휘트니 U 비모수적 검정(Mann-Whitney U non-parametric test)을 사용하여 분석하였다. 0.05 미만의 p-값이 유의한 것으로 간주되었다.

다른 구현예

전술한 설명으로부터, 다양한 용도 및 조건에 적응하도록 본원에 기술된 발명에 변형들 및 수정들이 만들어질 수 있다는 것이 명백해질 것이다. 이러한 구현예들은 또한 아래의 청구범위의 범주 이내이다.

본원의 변수의 임의의 정의에서의 구성요소의 목록의 언급은 나열된 구성요소의 임의의 단일 구성요소 또는 조합(또는 하위조합)으로서의 이러한 변수의 정의를 포함한다. 본원의 구현예의 언급은 임의의 단일 구현예 또는 임의의 다른 구현예들과의 조합 또는 이의 일부로서 이러한 구현예를 포함한다.

본 명세서 내에 언급된 모든 특허들 및 간행물들은 각각의 독립적인 특허 및 간행물이 구체적이고 개별적으로 참조로서 포함된다고 지시된 바와 동등한 정도로 본원에 참조로서 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> MedImmune LLC <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR IDENTIFYING B CELL MALIGNANCIES RESPONSIVE TO B CELL DEPLETING THERAPY <130> MR629-100WO1 <150> US 61/947,755 <151> 2014-03-04 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr His Glu Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Ser Trp Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Val Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Gly Phe Ile Thr Thr Val Arg Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile His Glu Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys 85 90 95 Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe Gly Ile Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Ala Ser Asn Gln Gly Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Glu Thr 1 5 <210> 9 <211> 556 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 1 5 10 15 Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 20 25 30 Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 35 40 45 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ser 65 70 75 80 Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 85 90 95 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 100 105 110 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 115 120 125 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 130 135 140 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 145 150 155 160 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro 165 170 175 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro 180 185 190 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 210 215 220 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 225 230 235 240 Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 245 250 255 Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 260 265 270 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly 275 280 285 Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu 290 295 300 Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg 305 310 315 320 Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val 325 330 335 Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu 340 345 350 Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala 355 360 365 Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp 370 375 380 Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly 385 390 395 400 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu 405 410 415 Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu 420 425 430 Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly 435 440 445 Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu 450 455 460 Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser 465 470 475 480 Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly 485 490 495 Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln 500 505 510 Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala 515 520 525 Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp 530 535 540 Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg 545 550 555 <210> 10 <211> 97 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tccctttccc aggggagggg ctgggtttac gttgggagaa cttttacggt gaaccaggag 60 gttctcccaa cgtaagccca gcccctcccc tctgcct 97 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 guucucccaa cguaagccca gc 22

Claims

대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체에 대한 치료요법을 선택하는 방법으로서, 상기 감소의 검출이 항-CD19 항체 치료요법에 대한 상기 대상체를 선택하는 방법.
대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 방법으로서, 상기 감소의 검출이 상기 대상체가 항-CD19 항체 치료에 반응성인 것으로 식별하는 방법.
정량적 PCR 또는 miRNA 마이크로어레이 분석에 의해 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체에 대한 치료요법을 선택하는 방법으로서, 상기 감소의 검출이 항-CD19 항체 치료요법에 대한 상기 대상체를 선택하는 방법.
정량적 PCR 또는 miRNA 마이크로어레이 분석에 의해 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 방법으로서, 상기 감소의 검출이 상기 대상체가 항-CD19 항체 치료에 반응성인 것으로 식별하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 수준이,
miR-629 발현의 수준을 상기 시료 내 존재하는 다른 마이크로 RNA들의 발현 수준과 비교하는 단계;
항-CD19 항체로의 치료에 반응성이지 않은 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체로부터 수득한 시료 내 miR-629 발현의 범위를 결정하는 단계; 또는
항-CD19 항체 치료에 대해 감소된 민감성, 화학요법의 항증식성 효과에 대한 내성, 또는 화학요법으로 유도된 아폽토시스에 대한 내성을 가지는 대상체 또는 세포주에서 miR-629 발현의 수준 또는 범위를 측정하는 단계에 의해 얻어지는 방법.
선택된 대상체에게 유효량의 항-CD19 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 선택된 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출함으로써 상기 대상체가 선택되는 방법.
선택된 대상체에게 유효량의 항-CD19 항체 및 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 항-CD19 항체 및 화학요법제로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 선택된 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출함으로써 상기 대상체가 선택되는 방법.
B 세포 악성 종양을 가지는 대상체에게 약물을 투여하는 방법으로서, 상기 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출함으로써 대상체가 항-CD19 항체로의 치료에 반응성인 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별되는 방법.
B 세포 악성 종양을 가지는 대상체에서 B 세포를 고갈시키는 방법으로서,
(a) 상기 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 감소된 miR-629 발현을 검출하는 단계로서, 상기 감소의 검출이 상기 대상체가 항-CD19 항체 치료요법에 반응성인 것으로 식별하는 단계; 및
(b) 상기 대상체에게 항-CD19 항체를 투여함으로써, 대상체 내 B 세포를 고갈시키는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 수준이,
miR-629 발현의 수준을 상기 시료 내 존재하는 다른 마이크로 RNA들의 발현 수준에 비교하는 단계;
항-CD19 항체로의 치료에 반응성이 아닌 B 세포 악성 종양을 가지는 대상체로부터 수득한 시료에서 miR-629 발현의 범위를 결정하는 단계; 또는
항-CD19 항체 치료에 대해 감소된 민감성, 화학요법의 항증식성 효과에 대한 내성, 또는 화학요법으로 유도된 아폽토시스에 대한 내성을 가지는 대상체 또는 세포주에서 miR-629 발현의 수준 또는 범위를 측정하는 단계에 의해 얻어지는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 B 세포 기원의 백혈병 또는 림프종을 가지는 방법.
제11항에 있어서, 상기 대상체가 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 다발성 골수종, 또는 만성 림프구성 백혈병을 가지는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액 시료가 전혈, 말초혈액단핵구 세포(PBMC) 시료, 혈청, 또는 혈장인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD19 항체가 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD19 항체가 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD19 항체가 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD19 항체가 MEDI-551인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD19 항체에 대한 상기 대상체의 반응이 miR-629로 매개되는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, miR-629에서의 감소의 검출이 상기 대상체가 자연 살해 세포의 증가된 활성화를 가지는 것으로 식별하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, miR-629가 상기 혈액 시료로부터 단리되거나 상기 혈액 시료 내 존재하는 엑소좀에서 검출되는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 선택이 그랜자임 B(GZMB), GZMA, GZMM, 카텝신 D, 퍼포린 1, 인터페론 조절 인자 7, CD63, CD96, NKp30, NKG2D, CD56, 및 CD107a 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 자연 살해 세포 단백질의 발현의 수준을 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
miR-629에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 키트.
항-CD19 항체 및 miR-629에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 키트.
대상체에게 miR-629를 표적으로 하는 저해 핵산 분자의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별된 대상체에서 항-CD19 항체 반응성을 유도하거나 증가시키는 방법.
대상체에게 유효량의 miR-629를 표적으로 하는 저해 핵산 분자를 항-CD19 항체와 조합하여 투여함으로써, 대상체에서 B 세포를 고갈시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 B 세포를 고갈시키는 방법.
제25항에 있어서, 상기 저해 핵산 분자가 안티센스 핵산 분자, siRNA, 또는 shRNA인 방법.
항-CD19 항체와 조합하여 miR-629를 표적으로 하는 저해 핵산 분자를 포함하는 조성물.
제27항에 있어서, 상기 저해 핵산 분자가 안티센스 핵산 분자, siRNA, 또는 shRNA인 조성물.
제25항에 있어서, 상기 저해 핵산 분자가 상기 항-CD19 항체와 동시에 또는 이전에 투여되는 방법.
대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 증가된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 방법으로서, 상기 증가의 검출이 상기 대상체가 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별하는 방법.
정량적 PCR 또는 miRNA 마이크로어레이 분석에 의해 대상체의 혈액 시료에서 참조 수준에 비해 증가된 miR-629 발현을 검출하는 단계를 포함하는, B 세포 악성 종양을 가지는 대상체를 식별하는 방법으로서, 상기 증가의 검출이 상기 대상체가 B 세포 악성 종양을 가지는 것으로 식별하는 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, miR-629가 상기 혈액 시료로부터 단리되거나 상기 혈액 시료 내 존재하는 엑소좀에서 검출되는 방법.