CN106455541A - 肺生物反应器 - Google Patents

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Abstract

提供一种气道器官生物反应器装置及其使用方法，以及使用该方法生产的生物人工气道器官，和使用该生物人工气道器官治疗受试者的方法。所述生物反应器包括：器官室；连接器官室和储池系统并包括动脉线、静脉线和气管线的输入线；连接室和储池系统的输出线，输入和输出线中的泵；控制流交换的控制器；连接至器官室的室压传感器。

Description

肺生物反应器
本申请要求2014年3月14日提交的美国临时申请号61/953,191的优先权，在此通过引用将其并入。
技术领域
本发明涉及肺生物反应器组件和方法。
背景技术
肺移植代表对于许多经历以肺衰竭为典型的状况，例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊性纤维化、肺动脉高压、肺癌、和先天性肺疾病等的患者的最后希望。肺移植的典型等待时间可以是2年以上，导致等待名单上的人30％的死亡率。
发明内容
一方面，一种气道器官生物反应器装置包括：器官室，其配置为容纳灌注入流体的器官基质支架或器官；连接所述器官室和储池系统的输入线，其中所述输入线包括下述任何：流体线、动脉线、静脉线、气管线或输入泵；连接所述器官室和所述储池系统的输出线，其中所述输出线包括输出泵；控制器，其配置为通过所述输入线和所述输出线控制所述器官室与所述储池系统之间的流体交换；和连接至所述器官室的室压传感器，其中所述室压传感器配置为记录并向所述控制室传输室压。
另一方面，一种提供湿式成熟肺器官的方法包括：提供配置为连接至动脉线、静脉线和气管线的器官室；提供包括气道和丰富(substantial)血管系统的肺组织基质；将所述气道连接至所述气管线；将所述肺组织基质连接至所述动脉线和所述静脉线；在下述至少之一上用细胞接种所述肺组织基质：所述动脉线、所述静脉线或所述气管线；给所述肺组织基质提供充分时间的湿式通气，以发生第一期望程度的器官成熟，从而生产湿式成熟器官；和任选地在湿式通气期间在所述器官室中维持基本上恒定的流体水平。
还在另一方面，一种保存、修复和/或改变肺器官的方法包括：提供配置为连接至动脉线、静脉线和气管线的器官室；提供包括气道和丰富血管系统的湿式成熟肺或收集肺；将所述气道连接至所述气管线；将所述湿式成熟肺或所述收集肺连接至动脉线和静脉线；通过至少所述动脉线或所述静脉线在所述湿式成熟肺或所述收集肺上灌注培养基；通气向所述湿式成熟肺或所述收集肺提供充足时间的干式通气以产生或维持功能性肺器官；和使气管压力波动最小化。
实施方式可包括一个或多个下列特征。
在一些实施方式中，输入泵、输出泵、或二者为双向泵。
在特定实施方式中，所述控制器配置为借助以下任一种方式通过所述输入线和所述输出线控制所述器官室与所述储池系统之间的流体交换：控制所述双向泵的方向，或控制所述双向泵的泵循环持续时间。
在一些实施方式中，所述控制器配置为响应从所述室压传感器传输的数据通过所述输入线和所述输出线控制所述器官室与所述储池系统之间的流体交换。
在特定实施方式中，所述输入线包括所述动脉线、所述静脉线、和所述气管线。
在一些实施方式中，所述气管线连接至所述器官室和正压歧管，并包括：气源；连接至所述气源的蓄压器(pressure reservoir)；和连接至所述蓄压器的泄压阀，其中所述正压歧管由所述控制器控制。
在特定实施方式中，所述正压歧管配置为沿着所述气管线施加连续正压。
在一些实施方式中，所述动脉线和所述静脉线之一或二者包括压力传感器、流体泵、或者压力传感器和流体泵二者。
在特定实施方式中，所述动脉线包括第一压力传感器和第一泵，各自由所述控制器控制；所述静脉线包括由所述控制器控制的第二压力传感器；和所述气管线包括第三压力传感器和第三泵，各自由所述控制器控制。
在一些实施方式中，所述第三泵为双向的。
在特定实施方式中，所述动脉线和所述静脉线连接至所述储池系统，所述气管线连接至通气器。
在一些实施方式中，气压控制模块连接至所述器官室，其中所述气压控制模块包括：气体入口线，其包括入口压力阀、入口蓄压器和入口压缩器；和气体出口线，其包括出口压力阀、出口蓄压器和出口压缩器，其中所述控制器控制下列任一：入口压力阀、入口压缩器、出口压力阀或出口压缩器。
在特定实施方式中，所述器官室包括室压传感器和双向排水室泵，各自由控制模块控制，所述控制模块响应由所述室压传感器传输的数据而控制双向排水泵。
在一些实施方式中，通过使静脉线中的压力水平与培养基储池中的压力水平平衡来实现防止经肺压力梯度(transpulmonary pressure gradient)。
在特定实施方式中，所述器官室还包括连接至所述器官室的气压控制模块，其中所述气压控制模块：在吸气阶段在所述器官室中生成负压；对于稳定阶段维持器官室压；和在呼气阶段在所述器官室中生成正压。
在一些实施方式中，湿式通气包括：将所述气管线连接至培养基储池，其中所述气管线包括连接至所述控制器的双向气管泵；用所述双向气管泵用培养基使所述肺组织基质扩张；和用所述双向气管泵将培养基从所述肺组织基质抽出而使所述肺组织基质收缩。所述培养基在湿式通气期间不断更新。
在特定实施方式中，湿式通气包括：将所述气管线连接至培养基储池，其中所述气管线包括各自连接至所述控制器的第一泵和第二泵；用所述第一泵用培养基使所述肺组织基质充胀；和使用所述第二泵将培养基从所述肺组织基质抽出而使所述肺组织基质收缩。所述培养基在湿式通气期间不断更新。
在一些实施方式中，所述控制器响应由连接至所述气管线的气管压力传感器传输的数据而控制所述双向气管泵。
在特定实施方式中，使气管压力波动最小化包括：将所述气管线连接至培养基储池，其中所述气管线包括各自连接至控制器的通气器和气管压力传感器；使用所述通气器用气体使所述湿式成熟肺或所述收集肺充胀；和使用所述通气器使所述湿式成熟肺或所述收集肺收缩。所述控制器引起所述通气器将所述湿式成熟肺或所述收集肺充胀或收缩，以使由所述气管压力传感器感知的所述气管压力波动最小化。
在一些实施方式中，使任意气管压力波动最小化包括：提供连接至所述气管线和控制器的正压歧管，和提供连接至所述气管线和所述控制器的气管压力传感器。所述正压歧管包括：蓄压器；连接至所述蓄压器的气源；和泄压阀。所述控制器响应由所述气管压力传感器传输的数据而控制压缩器或泄压阀。
在特定实施方式中，所述蓄压器具有适当大小以使吸气和呼气期间的压力波动最小化。
在一些实施方式中，所述器官室还包括连接至所述器官室的气压控制模块。所述气压控制模块：在吸气阶段在所述器官室中生成负压；维持稳定期的器官室压；和在呼气阶段在所述器官室中生成正压。
在特定实施方式中，使气管压力波动最小化包括：提供连接至所述气管线和控制器的正压歧管，和提供连接至所述气管线和所述控制器的气管压力传感器。所述正压歧管包括：蓄压器；连接至所述蓄压器的气源；和泄压阀。所述控制器响应由所述气管压力传感器传输的数据而控制压缩器或泄压阀；和所述器官室包括连接至所述器官室的气压控制模块。所述气压控制模块：在吸气阶段在所述器官室中生成负压；维持稳定期的器官室压；和在呼气阶段在所述器官室中生成正压。
在一些实施方式中，生产功能性肺。
在特定实施方式中，器官为全肺或其血管化部分。
在一些实施方式中，具有受损的或降低的肺容量的受试者通过将本文所述的肺移植入所述受试者中来治疗。
在特定实施方式中，灌注细胞培养基。
在特定实施方式中，流体(如细胞培养基、液体或空气)灌注到器官基质上和/或器官基质中。
在一些实施方式中，去细胞化(decellularized)的肺组织基质、肺器官或收集肺为(或来自、或具备其大小)人肺、或来自猪、绵羊、牛、马、狗、猫或其它大型动物的肺。
除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以使用与本文中所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料来实施本发明，但是下文描述了合适的方法和材料。本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利、和其它参考文献通过引用而并入本文。在冲突的情况中，应当以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法、和实例仅是例示性的，而并不意图为限制性的。
在附图和下文描述中列出了本发明的一个或多个实施方案的详情。本发明的其它特征、目的、和优点将会从描述和附图以及从权利要求书变得明显。
附图说明
图1为示例性灌注肺生物反应器的示意图。
图2为配置为利用灌注系统提供负压湿式通气的示例性肺生物反应器的示意图。
图3-3a为由图4代表的示例性正压歧管的示意图。
图4为包括负压干式通气系统的具有单独的培养基储池和监控的静脉排出的示例性肺生物反应器的示意图。
图5为包括正压湿式通气系统和灌注系统的示例性肺生物反应器的示意图。
图6为包括正压干式通气系统和灌注系统的示例性肺生物反应器的示意图。
图7为连接至器官培养室的气压控制模块的示意图。
图8为包括负压湿式通气系统的具有灌注系统并具有如图7所示的气压控制模块的示例性肺生物反应器的示意图。
图9为包括负压干式通气系统的具有如图3所示的正压模块和图7所示的气压控制模块的示例性肺生物反应器的示意图。
图10A为临床示例性肺生物反应器的示意图。
图10B-C为与肺培养物相关的生理数据的图，包括来自分离的肺培养物的示例通气量(上)和压力(下)轨迹。上图中的不连续性表示逸出PEEP阀的体积；VT表示潮气体积；RR表示呼吸率；PT表示气管压力；POC表示器官室压力；I表示吸气时间；E表示呼气时间。
图10D为体内对肺的作用力的示意图。
图11A为表示猪肺的短期(24h)分离肺培养(ILC)后的器官重量变化的生理数据的图。
图11B为表示猪肺的短期ILC期间从PA到PV的培养基的溶解O2、溶解CO2、以及葡萄糖含量的变化的生理数据的图。示出的数据覆盖了每种条件的三个独立的短期ILC。对于各组培养的肺，培养基每24小时取样5-7次。
图11C为示出短期ILC后猪肺组织的苏木精和伊红染色结果的图(比例尺，250μm)。
图11D为示出短期ILC后猪肺组织的TUNEL测定结果。细胞核和TUNEL阳性细胞分别为蓝色和绿色(比例尺，150μm)。
图11E为表示短期ILC后猪肺组织中TUNEL阳性细胞定量的生理数据的图。
图12A为猪肺的长期ILC(72h)期间从PA到PV的培养基的溶解O2、溶解CO2、葡萄糖和乳酸盐含量的变化的生理数据的图。示出的数据覆盖了每种条件的四个独立的长期ILC。对于各组培养的肺，培养基每24小时取样3-5次。
图12B为表示在长期ILC下猪肺的氧交换功能的生理数据的图(左)。功能测试后PA(橙色)和PV(绿色)pO2值(右)。
图12C为表示长期ILC下培养的猪肺的灌注动力学的生理数据的图。生物反应器系统中的总培养基体积(上)。肺动脉流速(QPA，上数第二)。肺动脉压(PPA，下数第二)。肺血管阻力(PVR，下)。黑线表示平均值。灰线表示平均值±SEM。
图12D示出长期ILC后猪肺组织的示例性TUNEL图像(左)。TUNEL阳性细胞定量(右)。
图12E示出长期ILC之前(0h)和之后(72h)猪肺组织的组织学和免疫荧光分析的图像。苏木精和伊红染色(H&E，比例尺，250μm)。VE-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、ZO-1和pro-SPB(红色，细胞核为蓝色，比例尺50μm)。
图13A为表示单一人肺的长期(72h)ILC期间从PA到PV的培养基的溶解O2、溶解CO2、葡萄糖和乳酸盐含量的变化的生理数据的图。培养基每24小时取样4次。
图13B为表示在长期ILC下人肺的氧交换功能的图(左)。功能试验后PA(橙色)和PV(绿色)pO2值(右)。
图13C为表示长期ILC下培养的人肺的灌注动力学的生理数据的图。生物反应器系统中的总培养基体积(上)。肺动脉流速(QPA，上数第二)。肺动脉压(PPA，下数第二)。肺血管阻力(PVR，下)。黑线表示平均值。灰线表示平均值±SEM。
图13D示出长期ILC后人肺组织的示例性TUNEL图像(左)。TUNEL阳性细胞定量(右)。
图13E示出长期ILC之前(0h)和之后(72h)猪肺组织的组织学免疫荧光分析的图像。苏木精和伊红染色(H&E，比例尺，250μm)。VE-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、ZO-1和pro-SPB(红色，细胞核蓝色，比例尺50μm)。
图14A-14C为在生理热条件(physiothermal conditions)下用0.6ml/min KHB还有5％右旋糖酐灌注的与大鼠肺保存相关的生理数据的图。14A；示出调节主室压力0--8cmH2O、呼吸率为20/min的描图。14B为示出PA灌注压的时程的柱状图，表明灌注压随时间维持。14C为示出也随时间降低的动态顺应性(dynamic compliance,Cdyn)的柱状图。在本实验中，分离的肺经4小时的灌注而发展水肿。Cdyn定义为潮气体积(ml)除以峰主室负压值(cmH2O)。
图15A-B为在生理热条件下用0.6ml/min KHB灌注的与大鼠肺保存相关的生理数据的图。15A为示出PA灌注压的时程的柱状图，表明压力逐渐降低。15B为示出也随时间降低的动态顺应性(Cdyn)的柱状图。在本实验中，分离的肺通过4小时的灌注变得水肿。
图15C为示出用苏木精和伊红灌注后染色肺样品的结果的图像。左图示出100×的对照，而右图示出100×下的灌注6小时后的样品。该图像示出在该生物反应器中尸肺的6h的灌注和通气后正常肺结构和细胞完整性的维持。
具体实施方式
本文件关于涉及气道器官生成和保存的方法和材料。本发明至少部分基于以下发现，即配置为生成功能性肺组织的生物反应器可用于为准备好移植入人和其它动物中的功能性气道器官的生长提供更实际的环境。通过给定的基质，例如人工的或去细胞化的肺组织基质生成肺组织。本发明还基于使用这种现实环境用于在延长的时间段内保存、修复和改变供体器官，从而提供更多改进且个性化的用于移植的移植物的用途。
如本文中所使用的，“功能性”肺组织执行正常的健康肺的大多数或所有功能，例如容许将氧从空气运输到血流中，及将二氧化碳从血流释放到空气中。它湿润吸入的空气，生成表面活性剂以降低肺泡中的表面张力，和/或生成并转运粘液以将吸入的微粒物质从远端向近端气道除去。
如本文中所使用的，术语“去细胞化的”和“无细胞的”使用或定义为使用标准的组织学染色方法在组织切片中完全或几乎完全没有可检出的胞内物、内皮细胞、上皮细胞、和细胞核。优选地，但不必要地，残留的细胞碎片也已经从去细胞化的器官或组织除去。
去细胞化的组织/器官基质
在本方法的一些实施方案中，肺组织在去细胞化的基质上生成。如下所述，用于制备去细胞化的肺组织基质的方法和材料是本领域中已知的。可以使用任何合适的材料来制备此类基质。在优选的实施方案中，组织基质可以是自去细胞化的肺组织形成的无细胞组织支架。例如，可以通过合适的方法来使诸如人肺等组织，如一个或一对人肺或其一部分，如人、猪、牛、灵长类、或禽类的尸肺或其一部分，进行去细胞化，以在维持组织或组织部分的形态学完整性和血管系统并保留胞外基质(ECM)蛋白的同时从组织除去天然的细胞。用于使哺乳动物肺组织去细胞化的方法记载于例如O'Neill JD等，Decellularization ofhuman and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.Ann ThoracSurg.2013Sep；96(3):1046-55；Nichols JE等，Production and assessment ofdecellularized pig and human lung scaffolds,Tissue Eng Part A.2013Sep；19(17-18):2045-62；Gilpin SE等，Perfusion decellularization of human and porcinelungs:Bringing the matrix to clinical scale.Journal of Heart and LungTransplantation.In press；Song JJ等，Bioartificial lung engineering.Am JTransplant.2012Feb；12(2):283-8；和Ott HC等，Regeneration and orthotopictransplantation of a bioartificial lung.Nat Med.2010 Aug；16(8):927-33。示例性去细胞化方法可以包括例如用液氮使组织(例如肺组织)重复冷冻-融化循环。在其它情况中，可以使组织受到阴离子或离子细胞破坏介质诸如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇(PEG)、或TritonX处理。还可以用核酸酶溶液(例如，核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶)处理组织，并在无菌磷酸盐缓冲盐水中温和搅动清洗。示例性方法是本领域已知的，例如O'NeillJD等，Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissueengineering.Ann Thorac Surg.2013 Sep；96(3):1046-55。在一些情况中，可以使用本领域中已知的方法和材料通过冲洗器官或组织的血管、导管、和/或腔来实施去细胞化。例如，如Maghsoudlou P等，Preservation of micro-architecture and angiogenic potentialin a pulmonary acellular matrix obtained using intermittent intra-trachealflow of detergent enzymatic treatment.Biomaterials.2013 Sep；34(28):6638-48所述。在冲洗步骤后，可以经由管线用如上文所描述的细胞破坏介质例如去离子水中的1％SDS灌注器官或组织。通过组织的灌注可以是顺行的或逆行的，并且可以交替方向以提高灌注效率。根据器官或组织的大小和重量和特定阴离子或离子去污剂及阴离子或离子去污剂在细胞破坏介质中的浓度，一般用细胞破坏介质以约2至约12小时/克组织来灌注组织。包括清洗，可以对器官灌注至多约12至约72小时/克组织。一般针对生理状况调节灌注，包括流速和压力，如5-100mmHg的压力，0.1-10倍于来源有机体或个体的生理心输出量的流速。
在另一示例性方法中，去细胞化方法包括将去污剂如(1)0.1％SDS、(2)2％脱氧胆酸钠(SDC)或(3)8mmol/升(3)3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(CHAPS)(pH12)去污剂在30cm H2O的恒压下通过肺动脉灌注。针对所有3种去污剂的方案包括：
1.用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行10-分钟的初始顺行清洗，
2.去污剂灌注，时间为使不透明或半透明基质显现(指示去细胞化)所需的时间加上初始时间的另外20％(如，70分钟+14分钟)，
3.15-分钟的去离子水清洗，和
4.另外172小时的PBS清洗，其中加入抗生素和抗真菌剂。
该去细胞化方法例如可包括在去离子水之后的另外1％Triton-X的清洗。SDC方案可以在SDC之前的0.1％Triton-X灌注以及SDC后的1mol/升NaCl清洗。
类似地，猪和人的肺去细胞化方法可包括在恒压下将去污剂或其它去细胞化剂通过肺动脉灌注，接着顺次用H2O、1％Triton-X溶液和PBS清洗。与大鼠肺类似，在目视观察和不透明或半透明的基质出现时，可认为去细胞化完成。起始器官中的可变性，其主要是由于收集期间预冲洗的范围，以及任何所得的血块可对灌注所需的时长有影响。一般而言，去细胞化灌注的时间可以例如自4至7天变化。
去细胞化的组织可以基本上由组织的所有或大多数区域的胞外基质(ECM)组分(包括血管树的ECM组分)组成(如，至少85重量％的纯度、90重量％的纯度、92重量％的纯度、95重量％的纯度、96重量％的纯度、97重量％的纯度、98重量％的纯度和99重量％的纯度)。ECM组分可以包括下列任意或所有项：纤连蛋白、肌原纤蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原家族成员(例如，胶原I、III、和IV)、糖胺聚糖、基体物质(ground substance)、网状纤维和血小板反应蛋白，其可保持组织为限定的结构例如基底膜。在优选的实施方案中，去细胞化的肺组织基质保留完整的血管系统。保留基本上完整的血管系统实现移植后组织基质与受试者血管系统的连接。另外，可以用例如照射(例如，UV、γ)来进一步处理去细胞化的组织基质，以降低或消除保留于去细胞化的组织基质之上或之中的任何类型的微生物的存在。
使用物理、化学、和酶手段来获得去细胞化的组织基质的方法是本领域中已知的，参见例如Liao等，Biomaterials 29(8)：1065-74(2008)；Gilbert等，Biomaterials 27(9)：3675-83(2006)；Teebken等，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.19:381-86(2000)。还可参见美国专利公开文本No.2009/0142836；2005/0256588；2007/0244568；及2003/0087428。
人工器官基质
在本方法的一些实施方案中，肺组织在人工器官基质上生成。用于制备人工器官基质的方法和材料是本领域中已知的。可以使用任何合适的材料来制备此类基质。在一个优选的实施方案中，人工器官基质可以是自多孔材料诸如例如聚乙醇酸、Pluronic F-127(PF-127)、Gelfoam海绵、胶原-糖胺聚糖(GAG)、血纤蛋白原-纤连蛋白-玻连蛋白水凝胶(FFVH)、和弹性蛋白开发的支架。参见例如Ingenito等，J Tissue Eng Regen Med.2009Dec17；Hoganson等，Pediatric Research,May 2008,63(5):520-526；Chen等，TissueEng.2005 Sep-Oct；11(9-10):1436-48。在一些情况中，人工器官基质可具有与肺泡单元相似的多孔结构。参见Andrade等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2007 Feb；292(2):L510-8。在一些情况中，植入的人工器官基质可表达器官特异性标志物(例如，克拉拉细胞、肺细胞、和呼吸表皮的肺特异性标志物)。在一些情况中，植入的人工器官基质可组织成可鉴定的结构(例如，人工肺基质中与肺泡和末端支气管相似的结构)。例如，用FFVH制成的植入的人工肺基质可在体外促进细胞附着、扩散和胞外基质表达，以及在体内促进表观移植(apparent engraftment)，对周围组织具有营养效应的证据。参见Ingenito等，见上文。还参见美国专利号7,662,409和6,087,552；美国专利公开号2010/0034791；2009/0075282；2009/0035855；2008/0292677；2008/0131473；2007/0059293；2005/0196423；2003/0166274；2003/0129751；2002/0182261；2002/0182241；和2002/0172705。
尸体的器官
本文所述的方法和装置也用于维持和制备尸体的肺以供移植使用。
自人和动物供体分离供体器官(如肺)的方法和材料是本领域中已知的。例如，记载于Pasque MK等，Standardizing thoracic organ procurement fortransplantation.J Thorac Cardiovasc Surg.2010Jan；139(1):13-7.和Bribriesco AC等Experimental models of lung transplantation.Front Biosci(Elite Ed).2013 Jan1；5:266-72。可以使用任何适当的方法来分离这些。这些供体器官可使用本文所述生物反应器维持足以准备移植用受体的时间，或者在促进全部器官或其部分的修复的条件下足以维持器官适于移植的时间。
在一些实施方案中，来自人器官供体的供体器官可改造为除去内皮衬里并随后用受体来源的表皮细胞重新接种，从而使免疫原性最小化。例如，这可经去离子水灌注、低去污剂浓度如0.05％聚多卡醇灌注、或酶溶液如DNAse或胶原酶灌注，通过渗透冲击完成。发现由于感染、物理性损坏如创伤、或由长期低灌注引起的缺血性损伤、或由供体条件如脑死亡引起的损伤而不适于立即移植的供体器官可使用本文所述装置和方法修复(如，通过安装，灌注，使用抗生素、细胞、生长因子刺激和抗炎处理来修复)。可通过遗传和细胞修饰而使动物来源的器官的免疫原性减少。
在一些情况中，供体肺可显示感染的射线照相或支气管镜检查的证据。为了控制生物负载和其它潜在的感染源，肺可安装在例如本文所述的装置上，并用抗生素和无菌溶液通过血管系统和气管冲洗。接着可例如用支气管镜从供体肺吸出溶液。该冲洗步骤可在培养之前和培养期间执行。在特定情况下，可发生死亡前的肺栓塞或心搏骤停后的血液凝结，导致血块形成的风险。分离的供体器官可安装并经肺静脉逆行冲洗以除去血块和/或可用溶栓物质灌注以裂解任何可能的血块。在一些情况下，在常与供体脑死亡相关的供体肺中，供体器官可含有高水平的炎性细胞因子和/或在肺泡巨噬细胞中的炎性状态(Venkateswaran RV等，The proinflammatory environment in potential heart andlung donors:prevalence and impact of donor management and hormonaltherapy.Transplantation.2009Aug 27；88(4):582-8)。这些肺可在器官培养之前和/或器官培养期间用抗炎药物处理(例如用其灌注)。在特定情况中，可灌注特异靶向炎性细胞类型的药物。该炎性状态还可导致毛细管渗漏并增加供体器官中的组织水，如下所述，例如Venkateswaran RV等，Measurement of extravascular lung water following humanbrain death:implications for lung donor assessment and transplantation.Eur JCardiothorac Surg.2013 Jun；43(6):1227-32。在保存期间，器官可用高渗溶液灌注，以便将组织水拉回到血管空间，从而恢复更健康的流体平衡和正常的肺顺应性。
在一些情况中，保存液还可经由本文所述装置给予至肺以减少移植失败的风险。在一些实例中，保存液可包括低钾胞外型溶液，如或如表1所示的组合物。氨基酸、抗生素或试剂(如表2中示出的那些)也可加入保存液中。
表1 灌注液组成
表2 灌注液组成
ROS清除剂(谷胱甘肽/N-乙酰半胱氨酸)
第二信使(二丁酰cAMP(cAMP类似物))
糖代谢(胰岛素)
膜稳定剂(氢化可的松)
生长因子(VEGF,FGF)
氧载体(红细胞、全氟化碳、血红蛋白结合的氧载体)
在一些情况中，供体肺可能显示由各种因素导致的损伤的迹象，这些因素例如供体肺的品质、保存液的类型、收集和培养之间的时长等。为了减少和/或消除损伤度，可以将供体肺和/或其部分安装在例如本文所述的装置上，并通液体和/或干式通气。在一个实例中，气体经气管线灌注，而心室和/或动脉线用模拟生理参数的溶液如生理盐水溶液、含血溶液和/或保存液灌注。供体肺可保持安装直到供体肺需要移植和/或直到损伤的供体肺显示再表皮化和显示内皮屏障功能提高。如下所述，这些灌注方法可与细胞接种法组合。
细胞接种
在本文中所描述的一些方法中，用细胞，例如分化的或再生的细胞接种肺组织基质，例如去细胞化的肺组织基质或人工肺基质。
可以使用任何合适的再生细胞类型，诸如幼稚或未分化的细胞类型来接种肺组织基质。细胞可以在各阶段接种，包括但不限于干细胞阶段(如，诱导后)、祖细胞阶段、成血细胞阶段或分化阶段(如，CD 31+、vWF+)。如本文中所使用的，再生细胞可以包括但不限于祖细胞、前体细胞、和“成人”衍生的干细胞(包括脐带细胞(例如，人脐静脉内皮细胞))和胚胎干细胞。再生细胞还可以包括分化的或定型的细胞类型。适合于本文中所提供的方法和材料的干细胞可以包括人诱导的多能干细胞(iPSC)(如，未分化的、分化的内胚层、前内胚层(anteriolized endoderm)、TTF-1阳性肺祖细胞)、人间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞、多能成人祖细胞(MAPC)、iPS来源的间充质细胞、或胚胎干细胞。在一些情况中，还可以使用源自其它组织的再生细胞。例如，可以使用源自皮肤、骨、肌肉、骨髓、滑膜、或脂肪组织的再生细胞来形成干细胞接种的组织基质。
在一些情况中，本文所提供的肺组织基质可以可选地或进一步用分化的细胞类型例如(优选人)上皮细胞和内皮细胞接种。例如，肺基质可用内皮细胞经由血管系统(如通过动脉线或静脉线)接种、用上皮细胞经由气道(如通过气管线)接种。肺基质还可用一种或多种细胞类型(如，一种或多种类型的上皮和间充质细胞、成人外周血来源的上皮细胞、脐带血来源的上皮细胞、iPS来源的上皮细胞、祖细胞阶段的细胞(如平滑肌)、成人肺来源的细胞混合物(如大鼠-人)、商购的小气道上皮细胞或肺泡上皮细胞、胚胎干(ES)细胞来源的上皮细胞、和/或人脐静脉内皮细胞(HUVEC))接种。
任何类型的适合的商购培养基和/或培养基试剂盒可用于细胞的接种和培养。例如，SAGM培养基可用于小气道细胞(如，SAGM BulletKit，Lonza)和EGM-2试剂盒可用于内皮细胞(如，EGM-2BulletKit，Lonza)。可使用根据所接种的内皮细胞的类型定制的培养基(例如，通过增加或减少生长因子如VEGF)，如记载于例如Brudno Y等，Enhancingmicrovascular formation and vessel maturation through temporal control overmultiple pro-angiogenic and pro-maturation factors.Biomaterials 34(2013)9201-9209。在内皮细胞的情况中，一系列不同的培养基组合物可用于诱导细胞的接种、扩增、移植和成熟等不同阶段。例如，在第一阶段，细胞接种构建体可用‘血管生成培养基’灌注2-30天以增加内皮细胞的扩增、迁移和代谢。该培养基的特征在于高浓度的细胞因子，如5-100ng/ml的VEGF和5-100ng/ml的bFGF，并且存在通过活化蛋白激酶C来活化血管生成通路的肉豆蔻酸乙酸佛波醇酯(PMA)，例如5-100ng/ml PMA，和刺激内皮细胞萌芽的Ang-1。在第二阶段，细胞接种构建体接着可用支持内皮成熟和紧密连接形成的‘紧密化培养基’灌注。紧密化培养基具有较低水平的细胞因子，与血管生成培养基具有相同的基础组成但VEGF、bFGF和PMA的水平低(0.1-5ng/ml VEGF、FGF和PMA)。促进紧密连接形成并已示出减少肺水肿的氢化可的松可进一步加入到紧密化培养基以促进血管成熟。进一步地，前成熟因子(promaturation factors)如PDGF和Ang-2可添加到紧密化培养基以增强血管形成。可滴定这些因子的浓度以支持不同的血管大小。培养基的更改可逐步进行以避免细胞因子突然改变的有害影响。类似于内皮细胞支持培养基，顺序的培养基改变可用于引导上皮细胞的命运。初始培养基可含有例如10-200ng/ml的活化素A和0.01-1uM的Pi3K抑制剂如ZSTK 474，以诱导明确的内胚层，随后01-10uM的TGF-β抑制剂如A-8301和0.05-1uM的BMP4拮抗剂如DMH-1以诱导前内胚层，和最终的1-100ug/ml的BMP4、10-500ng/ml的FGF2、10-500nM的GSK-3β抑制剂如CHIR 99021、1-100nM的PI3K抑制剂如PIK-75和1-100nM的甲氨蝶呤以诱导肺祖细胞生成。
可以使用任何适用于分离并收集供接种用的细胞的方法。例如，诱导的多能干细胞一般可以通过转录因子诸如Oct4、Sox2、Klf4、c-MYC、Nanog、和Lin28的异位表达而从“重编程”为多能状态的体细胞获得。参见Takahashi等，Cell 131:861–72(2007)；Park等，Nature 451:141–146(2008)；Yu等，Science318:1917–20(2007)；Zhu等，Cell StemCell.7:651-5 2010；和Li等，Cell Res.21:196-204(2011)；Malik和Rao,Methods MolBiol.2013；997:23-33；Okano等，Circ Res.2013Feb 1；112(3):523-33；Lin和Ying,Methods Mol Biol.2013；936:295-312。外周血来源的单核细胞可自患者的血液样品分离并用于生成诱导多能干细胞。在其它实例中，诱导的多能干细胞可通过用优化来用于Oct4,Sox2,Klf4,c-MYC连同如转化生长因子β(SB431542)、MEK/ERK(PD0325901)和Rho-激酶信号传导(Thiazovivin)等小分子的高共表达的构建体来重编程而获得。参见Groβ等，Curr MolMed.13:765-76(2013)和Hou等，Science 341:651:654(2013)。用于自干细胞生成内皮细胞的方法于Reed等，Br J Clin Pharmacol.2013 Apr；75(4):897-906中综述。脐带血干细胞可以自新鲜的或冷冻的脐带血分离。间充质干细胞可以自例如粗制的未纯化的骨髓或经ficoll纯化的骨髓分离。可以依照本领域中已知的方法从活的或尸体的供体，例如从将接受生物人工肺的受试者分离并收集上皮和内皮细胞。例如，上皮细胞可以自皮肤组织样品(如钻取活组织检查)获得，而内皮细胞可以自血管组织样品获得。在一些实施方案中，经由放在血管系统中的导管将蛋白水解酶灌注到组织样品中。可以将经酶处理的组织的一部分进行进一步的酶和机械破坏。可以分离以此方式获得的细胞混合物以纯化上皮和内皮细胞。在一些情况中，基于流式细胞术的方法(例如，荧光激活的细胞分选)可用来基于特定细胞表面标志物的存在或缺失而分选细胞。此外，肺细胞(上皮、间充质和内皮)可自肺活检组织获得，肺活检组织可经由经支气管的和支气管内的活组织检查或经由肺组织的外科活组织检查得到。在使用非自体细胞的情况中，应当考虑选择免疫类型匹配的细胞，使得器官或组织在植入受试者中时不会被排斥。
可以将分离的细胞在缓冲溶液(例如，pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水)中漂洗，并在细胞培养基中重悬。可以使用标准的细胞培养方法来培养并扩充细胞群。一旦获得，细胞可用于接种组织基质，例如经由动脉或静脉线(内皮细胞)或通过气道(气管)线(表皮细胞)导入基质。例如，可以以任何合适细胞密度在体外用至少一种细胞类型接种组织基质。例如，用于接种基质的细胞密度可以是至少1×103个细胞/克基质。可以使用范围可以为约1×105至约1×1010个细胞/克基质(例如，至少100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、或10,000,000,000个细胞/克基质)的细胞密度。
在一些情况中，可以通过灌注接种以上文所描述的细胞类型和细胞密度接种如本文中所提供的去细胞化的或人工的肺组织基质。例如，可以使用流动灌注系统经由保留于组织基质中的血管系统(例如通过气管线)来接种去细胞化的肺组织基质。在一些情况中，可以在合适的条件下使用自动化流动灌注系统。此类灌注接种方法可以改善接种效率，并且在整个复合物中提供更均匀分布的细胞。可以使用定量生物化学和图像分析技术来评估静态或灌注接种方法后的接种细胞的分布。
在一些情况中，可以给组织基质注入一种或多种生长因子以刺激接种的再生细胞的分化。例如，可以给组织基质注入适合于本文中所提供的方法和材料的生长因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、TGF-β生长因子、骨形态发生蛋白(例如，BMP-1、BMP-4)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、基础成纤维细胞生长因子(b-FGF)例如FGF-10、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、或生长分化因子-5(GDF-5)。参见例如Desai和Cardoso，Respir.Res.3：2(2002)。可包封这些生长因子以控制时间释放。支架的不同部分可用不同的生长因子促进，以添加生长因子刺激的空间控制。
可以将接种的组织基质在接种后温育一段时间(例如从几小时至约14天或更多)以改善细胞在组织基质中的固定和渗透。可以在如下的条件下维持接种的组织基质，其中至少一些再生细胞可以在无细胞组织基质之内和之上增殖和/或分化。此类条件可以包括但不限于合适的温度(35-38摄氏度)和/或压力(如大气压)、电和/或机械活动(例如，经正压或负压通气，其中正端呼气压为1-20cmH2O、平均气道压力为5-50cmH2O和峰吸气压力为5-65cmH2O)、合适量的流体，例如O2(1-100％FiO2)和/或CO2(0-10％FiCO2)、合适量的湿度(10-100％)、和无菌或接近无菌的条件。此类条件还可以包括湿式通气、湿式至干式通气和干式通气。在一些情况中，可以将营养补充物(例如，营养物和/或碳源诸如葡萄糖)、外源激素、或生长因子添加到接种的组织基质。可以实施组织学和细胞染色以测定接种细胞增殖。可以实施任何合适的方法来测定接种细胞分化。一般而言，本文中所描述的方法会在例如如本文中所描述的气道器官生物反应器装置中实施。
如此，可以使用本文中所描述的方法来生成可移植的生物人工肺组织，例如用于对人受试者移植。如本文中所描述的，可移植的组织会优选地保留足够完整的血管系统，其可以与患者的血管系统连接。
本文中所描述的生物人工肺组织可以与包装材料组合以生成制造品或试剂盒。用于生产制造品的组分和方法是公知的。在生物人工组织外，制造品或试剂盒可以进一步包括例如一种或多种抗粘合剂、无菌水、药用载体、缓冲液、和/或用于促进体外和/或移植后功能性肺组织发育的其它试剂。另外，此类制造品中可以包含描述可如何使用其中含有的组合物的印刷的指南。制造品或试剂盒中的组分可包装在多种合适的容器中。
使用生物人工肺的方法
本文件还提供了使用生物人工肺组织及在一些情况中促进肺功能的方法和材料。在一些实施方案中，可以使用本文中所提供的方法来恢复患有损害或降低肺容量的疾病(例如，囊性纤维化病、COPD、肺气肿、肺癌、哮喘、肺动脉高压、肺创伤、或其它遗传性或先天性肺异常，例如支气管源性囊肿、肺发育不全和发育不良(pulmonary agenesis andhypoplasia)、多肺泡叶、肺泡毛细管发育异常、隔离，包括动静脉畸形(AVM)和弯刀综合征(scimitar syndrome)、肺淋巴管扩张(pulmonary lymphangiectasis)、先天性肺叶性肺气肿(CLE)、和囊性腺瘤样畸形(CAM)和其它肺囊肿)的患者中的一些肺功能。本文中所提供的方法还包括如下那些，其中受试者鉴定为需要特定的规定治疗，例如，升高的肺功能、或增加或改善的肺容量。
可以依照本文中所提供的方法来生成生物人工肺组织(例如，整个器官或其一部分)。在一些实施方案中，该方法包括对有此需要的受试者(例如，人患者)移植如本文中所提供的生物人工肺组织。在一些实施方案中，对患病或损伤组织部位移植生物人工肺组织。例如，可以将生物人工肺组织移植入受试者的胸腔中，替换不发挥功能或发挥功能不良的肺(或与其一起)；用于实施肺移植的方法是本领域中已知的，参见例如Boasquevisque等，Surgical Techniques:Lung Transplant and Lung Volume Reduction,Proceedings ofthe American Thoracic Society 6:66-78(2009)；Camargo等，Surgical maneuvers forthe management of bronchial complications in lung transplantation,Eur JCardiothorac Surg 2008；34:1206-1209(2008)；Yoshida等，“Surgical Technique ofExperimental Lung Transplantation in Rabbits,”Ann Thorac Cardiovasc Surg.11(1):7-11(2005)；Venuta等，Evolving Techniques and Perspectives in LungTransplantation,Transplantation Proceedings 37(6):2682-2683(2005)；Yang和Conte,Transplantation Proceedings 32(7):1521-1522(2000)；Gaissert和Patterson,Surgical Techniques of Single and Bilateral Lung Transplantation in TheTransplantation and Replacement of Thoracic Organs,第2版，Springer Netherlands(1996)。
所述方法可以包括在部分或完全除去受试者的肺的手术方法过程中和/或肺切除过程中移植如本文中所提供的生物人工肺或其一部分。该方法还可以包括自活的供体或尸体收集肺或其一部分并在本文中所述的生物反应器中保存或再生肺。在一些情况中，可以使用本文中所提供的方法来替换或补充受试者例如人或动物受试者中的肺组织和功能。
可以实施任何合适的方法来测定移植之前或之后的肺功能。例如，可以实施方法来评估组织愈合、评估功能性、及评估细胞向内生长(in-growth)。在一些情况中，可以将组织的一部分收集，并用固定剂诸如例如中性缓冲福尔马林处理。可以将此类组织的一部分脱水，包埋在石蜡中，并用切片机切片以进行组织学分析。可以将切片用苏木精和伊红(H&E)染色，然后安放于玻璃载玻片上以供形态学和细胞性的显微评估。例如，可以实施组织学和细胞染色来检测接种的细胞繁殖。测定法可以包括移植的组织基质的功能性评估或成像技术(例如，计算机断层摄影术(CT)、超声、或磁共振成像(例如，对比度增强的MRI))。测定法可以进一步包括在静息和生理应激下的功能性测试(例如，身体体积描记术(bodyplethysmography)、肺功能测试)。可以使用本领域中已知的方法，例如组织学、电子显微术、和机械测试(例如体积和顺从性的)来测定用细胞接种的基质的功能性。气体交换可以作为另一种功能性测定法测量。为了测定细胞增殖，可以例如通过检测胸苷掺入来测量胸苷激酶活性。在一些情况中，基于血液中的氧水平，可以实施血液测试来评估肺功能。
为了促进培养期间的功能测定，本文所述的生物反应器装置的任何线可包括取样口以允许功能参数(如pH、葡萄糖、乳酸盐、Na、K、Ca、Cl、碳酸氢盐(bicarb)、O2、CO2、sat)的单一或实时测量。还可使用比色测定将代谢物用于监控细胞数和活力，并且生物化学测定可用于检测细胞成熟(如，测量表面活性蛋白等)。例如，增加的表面活性蛋白浓度可指示培养肺具有足以抵抗干式通气的表皮细胞。在一些情况中，内皮屏障功能可用作血管成熟的标志物。肺可用不同大小的分子(如大小限定的右旋糖酐以及白蛋白)、微珠(大小从0.2到5um增加)、以及分离的红细胞灌注。之后可取样支气管肺泡灌洗液来评价这些标志物向肺泡腔的渗漏。例如，500-kDa的右旋糖酐可与支气管肺泡灌洗测定组合使用来确定保留在血管腔隙内的右旋糖酐的百分率。右旋糖酐保留的百分率的增加指示屏障功能的提高，这是因为对右旋糖酐的屏障功能取决于有活力的且功能性的内皮，而右旋糖酐将在连续灌注期间经时穿过裸露的血管基底膜(如在非细胞肺中)而扩散。例如，尸体的肺可将基本上所有的右旋糖酐保留在血管腔隙内，而无细胞肺可保留小百分比的右旋糖酐(如，10.0％±8.0％)。这些标志物向肺泡腔的高于耐受最小值(例如>10％的4um微珠，或大于20％的0.2um微珠)的渗漏可用于指示肺的成熟不足以抵抗干式通气。
在一些情况中，可以使用分子生物学技术诸如RT-PCR来定量代谢(如表面活性蛋白，粘蛋白-1)和分化标志物(如TTF-1、p63、表面活性蛋白C)的表达。可以使用任何合适的RT-PCR方案。简言之，可以如下收集总RNA，即将生物学样品(例如腱样品)均质化，实施氯仿提取，并使用旋转柱(例如，微量旋转柱(QIAGEN，Valencia，CA))或其它核酸结合基质来提取总RNA。在其它情况中，与肺细胞类型和此类细胞类型的不同分化阶段有关的标志物可用抗体和标准的免疫测定法来检测。
气道器官生物反应器装置
示例性气道器官生物反应器示于图1。贯穿整个说明书，肺会作为气道器官的例子提供。其它例子可以包括含层级血管系统结构的肺的一部分，如肺叶或肺段。能够支持自活的供体或尸体收集的肺的示例性生物反应器示于图8和9。本文所述的任何生物反应器可以配置为允许以仰卧位培养肺。
参考图1，生物反应器100的组件包括肺室101、培养器室102、动脉灌注泵103、动脉压104、动脉线105、静脉线106、气管线107、过滤器108、氧合器109、输出线112、控制模块110、静脉阀111、动脉流传感器114、静脉灌注泵116、静脉压力传感器118、静脉流传感器120和气管阀122。至少将肺室101封闭在培养器室102内以维持适合的温度和湿度。
生物反应器100允许通过肺动脉、肺静脉或其它合适的通道用氧合培养基恒压灌注(以氧合培养基)。肺室101容纳肺(未示出)。肺的肺动脉连接至肺动脉线105，肺的肺静脉连接至静脉线106，肺的气管连接至气管线107。生物反应器100为中压(neutral pressure)通气系统，这是因为无菌过滤器108以培养器室102的压力平衡肺室101中的压力，同时也以培养器的压力平衡气管线107，这是因为气管阀122一般是打开的。
在肺室101内，用细胞和培养基顺行灌注细胞基质以容许接种细胞，从而在肺基质中生长。灌注通过肺动脉线105对肺动脉进行和通过静脉线对肺静脉进行，而气管阀122保持打开。该配置允许细胞和培养基从动脉侧和静脉侧二侧到达毛细血管床并允许培养基通过无细胞基底膜扩散和经由气管或跨过胸膜离开基质。
动脉流传感器114和静脉流传感器120为能够测量这些线的流速的传感器(如跨声速流探针)。流速传感器可并入本文所述的任意生物反应器内的任意流体线(如任意输入或输出线、动脉线、静脉线、气管线或氧气交换线)。在特定实施方案中，流速还可基于管线的直径和相关泵的速度计算。
细胞和/或培养基通过肺血管流经动脉线104和静脉线107。为了再循环，培养基流经氧合器109。氧合的培养基接着流向动脉灌注泵103或静脉灌注泵116，使培养基通过生物反应器100循环。该泵受控制模块110的控制，控制模块110基于分别自动脉压力传感器104和静脉压力传感器118的压力读数来控制灌注泵104的速度和静脉泵116的速度。动脉和静脉灌注压可基于细胞的大小和数量来改变，从而优化细胞传递。控制模块110还能够读取数据(如来自动脉压力传感器104和静脉压力传感器118的阻力读数)。培养基完成回路，回到动脉线104和/或静脉线106。在最初的顺行接种期间，培养基在其到达毛细血管床之前或当其到达毛细血管床时扩散通过肺基质。为了引导培养基通过支架，气管阀122可打开或关闭以调整肺内的压力，从而引导培养基通过支架。在一些情况中，可使用逆行接种。在这些情况中，细胞和/或培养基流经静脉线107，氧合的培养基流向静脉灌注泵116，使培养基经过生物反应器100循环。如同顺行接种，为了引导培养基通过支架，气管阀122可打开或关闭以改变肺内的压力，由此引导培养基通过支架。
在肺的血管系统阻力之后，基质足以抵抗生理条件(如，由于肺基质的再内皮化而使血管阻力增加)，生物反应器100转换成顺行灌注。血管系统阻力通过动脉压力传感器104经时测量。随着血管系统的占据，穿过血管膜的扩散减少，引起动脉传感器104测量的压力增加(即，血管阻力的增加)。在一些实例中，颗粒通过生物反应器100灌注，监控它们的进程以确定穿过血管膜的扩散速率。
参考图2，生物反应器200的组件包括肺室201、培养器室202、培养基储池203、动脉灌注泵204、排泄泵205、动脉压力传感器206、室压传感器207、气管压力传感器208、静脉压力传感器209、动脉线210、静脉线211、气管线212、过滤器213、氧合器214、控制模块215和静脉阀216、气管阀212和输出线217。肺室201封闭在培养器室202内以维持适合的温度和湿度。
仍参考图2，生物反应器200组合流动灌注系统和负压通气。肺基质置于肺室202。流动灌注系统使用连接至肺的肺动脉的动脉线210。培养基从培养基储池203吸出并穿过氧合器214。氧合器214将例如来自入口点218和出口点219的空气与培养器室202周围的环境交换。在通过氧合器214后，动脉压力传感器206记录动脉压并将该数据传输至控制模块215。动脉压读数接着调整将培养基从储池泵向肺动脉的滚子泵(roller pump)。接着培养基通过输出线217循环出肺室201并使用排泄泵205泵入培养基储池203。排泄泵205为双向的且可用于在培养基储池203至肺室201之间循环培养基。该再循环还辅助维持肺室201中正确的pH。控制模块215基于由室压传感器207记录的压力读数控制排泄泵205的例如速度和/或方向。由于肺室201中室压的波动，液体流入和流出气管线212。由于静脉线211开向培养基储池203，静脉压向室压平衡，从而防止可引起流体从动脉流向组织的经肺压力梯度。通过监控室压并相应地泵送，可以维持肺室201中的培养基水平。
在负压湿式通气期间，流体进出肺基质引起肺室201中的压力波动。该波动还使肺基质扩张和收缩。该扩张引起反复的流体移动进出气管以及流体通过肺基质(如，通过肺静脉和淋巴管)转移至肺室201中。这些流体转移可以在整个培养期变化并可导致不稳定的培养条件、不期望的室压增加、培养基溢出、负压通气失败、和肺或肺移植物损伤。用室压传感器207监控肺室201压力使得控制模块215通过适当调整排泄泵205的方向和持续时间来校正这些流体转移。例如，由于肺室201中的培养基体积的增加，压力的增加由室压传感器207感知。该数据传输至控制模块215，激活灌注泵205足够时间以将过量的培养基从肺室201回流到培养基储池203直至恢复期望的压力。
如图2所示，生物反应器200还包括气管压力传感器208和静脉压力传感器209。气管压力传感器208测量气道(如气管)内的压力。气管线212通过气管阀221连接至培养基储池203，且气管线212内的压力与培养基储池203内的压力平衡。为了将气道压力限定到生理范围，可升高培养基储池203的高度以调整生成的气道正压。由于室压降低，气管压力也将在较小程度上降低。
生物反应器200还可使用静脉压力传感器209来主动监控静脉线212与培养基储池203之间的培养基交换速率。静脉在加载到系统中后当阀216关闭时由储池的水平控制，或者如果其为开启位置则由可附接至静脉阀216的阻力阀控制。例如，静脉瓣216通常为开启位置。低压读数(如<-5mmHg)可触发静脉瓣216关闭(如，自动或由操作者)，由此提供更多的静脉背压以防止毛细管后血管塌陷。如果压力读数高(如>20mmHg)，静脉瓣216可打开以降低静脉后负荷并使得向胞间隙和气道中的流体转移最小化。
仍参考图2，培养基室203中的压力通过无菌过滤器213与周围环境(如，培养器室)平衡。该交换还允许培养器室202与培养基储池203之间的气体(如二氧化碳)交换，这有助于维持系统中培养基的适当的pH值。培养基储池203的高度可相对于肺室201的高度调整。这引起湿式呼吸正压并影响与肺相关的气管气道压力。例如，培养基储池203设定在浸于培养基中的肺的上方4cm。这引起气道正压。
一般而言，由本文所述的任意传感器记录的压力处于取决于所培养的器官的生理范围内。例如，动脉范围可为平均10-35mmHg，肺室201可为平均-40至40mmHg。
参考图3，正压歧管300包括气管线304、蓄压器(pressure reservoir,PR)302、泄压阀(pressure release valve,prv)301、压缩器(compressor,comp)303(如压缩气源)、可充胀的呼吸袋(breathing bag,BB)306、和歧管压力传感器308。气管线304连接至肺的气道(未示出)。压缩器303向蓄压器303提供正压，蓄压器302中的压力水平可通过泄压阀301调整(如，可减少压力)。在特定的实施方案中，正压歧管300为主动调整蓄压器302中的压力来应答气道中吸气和呼气相关的压力变化(如，由气管压力传感器408或由歧管压力传感器308记录的)的计算机化系统。可充胀的呼吸袋306附接至蓄压器302以适应吸气和呼气期间突然的体积变化，同时保持室、气管和肺中的压力恒定。可充胀的呼吸袋306的体积可根据待培养的肺的大小而变化。例如，可充胀的袋306的体积可为250cc至4000cc之间、至少250cc，小于4000cc、300cc至3500cc之间、400cc至3000cc之间、500cc至2500cc之间、600cc至2000cc之间、700cc至1500cc之间、和800cc至1000cc之间。可充胀的呼吸袋306的材料为任何挠性的、不透气的且无菌的材料(如，乳胶或橡胶)。歧管压力传感器308既帮助监控呼气末压力也实现在通气线中的流计算。
参考图3a，如上所述，正压歧管320包括气管线304、蓄压器(pressure reservoir,PR)302、泄压阀(pressure release valve,prv)301、压缩器(compressor,comp)303(如，压缩气源)、可充胀的呼吸袋(breathing bag,BB)306、和歧管压力传感器308。正压歧管320还包括吸气阀(inspiratory valve,iv)330、呼气阀(expiratory valve,ev)332和呼气泄压阀334。气管线304连接至肺的气道(未示出)。如参考图3所述，压缩器326向蓄压器302提供正压，蓄压器302中的压力水平可通过泄压阀324调整(如，可减少压力)。气管线328也连接至吸气阀330和呼气阀332。吸气阀330和呼气阀是允许流体如空气以一个方向流动并防止回流的单向阀。在呼气阶段，空气通过呼气阀332和呼气压力阀334从气管线流动至排气管(未示出)。由于吸气阀330，排出液并没有进入蓄压器302。在吸气阶段，空气通过吸气阀330从蓄压器经由气管线304流动至肺的气道。呼气泄压阀324确保呼气线在吸气阶段时保持正压，从而防止空气在吸气阶段时流过呼气线。
参考图4，生物反应器400的组件包括肺室401、培养器室402、培养基储池403、动脉灌注泵404、排泄泵405、动脉压力传感器406、室压传感器407、气管压力传感器408、静脉压力传感器409、动脉线410、静脉线411、气管线412、无菌过滤器413、氧合器414、控制模块415、静脉阀416和正压歧管300。生物反应器400除了灌注系统以外包括负压干式(例如使用空气)通气，且除了正压模块以外通常如上所述参照生物反应器200配置。肺室401中的压力是可变的以充胀或收缩肺基质。
在吸气阶段，肺室401内的压力降至低于气道压力，从而造成气道负压。该负压引起流体从血管系统向组织转移，导致间质性水肿和气道分泌增多。气管线412和附连的管的阻力加剧了这些流体转移。在呼气阶段，肺室401内的压力增加，从而造成气道正压。如果气管对大气压开放或连接到中性压力，近侧的气道将受到室压的压缩并塌缩，导致末端气道和肺泡内空气滞留以及对肺基质的损害。如上所述，正压歧管300通过具有适合的大小如大约肺的10×潮气体积使吸气和呼气期间的压力波动最小化。控制模块415激活压缩器303或泄压阀301，如上所述维持蓄压器203中的恒压，压力在吸气和呼气阶段通过气管线412传输到气管。类似于生物反应器200，培养基通过灌注泵405在肺室401和培养基储池403之间更新。动脉压力传感器406与双向动脉灌注泵405之间的组合用于维持肺室401中适合的压力和/或培养基流体水平(如上所述)。
参考图5，生物反应器500的组件包括肺室501、培养器室502、培养基储池503、动脉灌注泵504、排泄泵505、湿式通气泵506、动脉压力传感器507、室压传感器508、气管压力传感器509、静脉压力传感器510、动脉线511、静脉线512、气管线513、无菌过滤器514、氧合器515、控制模块516和静脉阀517。肺室501容纳肺基质(未示出)。类似于生物反应器100、200和400，肺的肺动脉连接至动脉线511，肺的肺静脉连接至静脉线512，肺的气管连接至气管线513。除了生物反应器200的特征以外，生物反应器500还包括连接至气管线513的湿式通气泵506。湿式通气泵506使得能够正压流体通气。湿式通气泵506从培养基储池503抽出新鲜培养基并通过气管线513泵送培养基，从而用流体(如培养基)使肺充胀。湿式通气泵506为双向的并从气管线吸入流体从而使肺收缩。由于湿式通气泵直接从培养基储池503抽取，肺基质不断由新鲜的培养基充胀。控制模块516基于由气管压力传感器509传输的压力读数控制湿式通气泵506的操作(如，持续时间、方向和速度)。例如，在吸气期间施加5至45cmH2O的吸气正压，而在呼气期间施加5-15cm H2O的呼气压。
在湿式通气和干式通气模式中，通气可以是压力控制的(PC)或体积控制的(VC)。在压力控制模式中，泵以确定的速率提供确定的吸气压和确定的呼气压达确定的一段时间(吸气时间,呼气时间)，并有正压、中性压力和负压平台期的可能性。在体积控制通气模式中，泵生成确定的吸气压直至已吸入一定体积，接着保持确定的平台期，然后生成呼气压直至呼出一定体积，或者直至已达到某一确定的目标压力，接着泵可保持在中性压力或确定的呼出平台压力下。体积变动可通过流量计的变化(如，基于热、基于压差或超声波)测量。这些流量计必须接近肺室连接至气管线以提供最精确的流测定。
如关于生物反应器200所述，从肺组织向图室501的任何流体转移使用双向排泄泵505自动回流至培养基储池503。控制模块516基于从室压传感器508收集的数据激活排泄泵505。
参考图6，生物反应器600的组件包括肺室601、培养器室602、培养基储池603、动脉灌注泵604、排泄泵605、动脉压力传感器606、室压传感器607、气管压力传感器608、静脉压力传感器609、动脉线610、静脉线611、气管线612、无菌过滤器613、氧合器614、控制模块615、阀控制静脉排出器616和通气器617。如上文关于生物反应器100、200、400和500讨论的，在生物反应器中，肺基质通过动脉线灌注培养基。
仍参考图6，生物反应器600包括通气器617，使得能够正压干式通气。通气器617为双向的并通过气管线612将气体(如空气)泵入和泵出肺基质。该气体运动引起肺基质以类似于典型的肺功能的方式充胀和收缩。生物反应器600可在器官培养末期时用于再生肺移植物和肺的功能性试验。例如，气管线可包括至少一个端口用于试验气管压力传感器608与通气器617之间的通气动态。气管线还可包括允许使用者使用肺移植物的支气管镜评价用的系统而不污染系统的一个或多个端口。各输入或输出线还可含有至少一个帮助血气分析的端口以帮助实时氧气测定。
参考图7,气压控制模块700包括入口压力阀703、入口蓄压器(pressurereservoir,PR)705、入口压缩器(compressor,comp)701、入口线707、出口压力阀704、出口蓄压器706、出口压缩器702、出口线和PPC控制器709。入口线707和出口线708连接至包括室压传感器710的肺室712(如上所述)。入口和出口压缩器701、702用气体(如空气)装载入口和出口蓄压器705、706。入口和出口压力阀703、704(如螺线管阀)以及入口和出口压缩器701、702受PPC控制器709控制。在吸气阶段，出口阀704打开并向移植室712中生成负压。一旦由室压传感器710记录到目标负压(如-20cmH2O)，出口阀704关闭。在吸气和呼气期间室压可在-50至+100cmH2O的范围内。一旦达到正常肺的肺顺应性，室压更接近地模拟胸膜内压的生理范围(如，-10至+25cmH2O)。在适合的平台期后，呼气阶段开始，其中入口压力阀703打开并允许肺室712内部生成正压。一旦由室压传感器710记录到目标正压(如25cmH2O)，入口阀703关闭。入口和出口蓄压器705、706大小适当以使得能够快速调整肺室712中的压力。入口和出口蓄压器防止和/或减少由入口或出口压缩器701、702生成的振动伪影(vibration artifacts)。在一些实施方案中，压力平衡的斜率可通过置于入口线707和/或出口线708中的附加阻力阀(未示出)来调整。如上所述，通气可为压力控制(PC)或体积控制(VC)。
参考图8，生物反应器800的组件包括肺室801、培养器室802、培养基储池803、动脉灌注泵804、排泄泵805、动脉压力传感器806、室压传感器807、气管压力传感器808、静脉压力传感器809、动脉线810、静脉线811、气管线812、过滤器813、氧合器814、控制模块815、静脉阀816和PPC模块700。
生物反应器800通常如关于生物反应器200所述进行配置并添加PPC模块700。肺室801中的压力通过PPC模块700调节(如上所述)。该配置允许负压通气而没有大量进出肺室801的流体转移。排泄泵维持室801中恒定的流体水平，而吸气期间的负压和呼气期间的正压由PPC模块700完成。通过用PPC模块700替换正负通气源，整个培养过程中的培养基的发泡、由于湍流造成的图损伤和设备故障得以防止和/或减少。此外，生物反应器800容易适应不同的肺基质大小(如，成人肺、儿童肺、或任何动物(如哺乳动物)肺)，这是由于PPC模块700能够达到不同的生理呼吸率。如上所述，在湿式通气期间，相对于肺室801的高度而增加培养基储池803的高度，由此引起通过气管线的液体静压，来维持气道正压。
参考图9，生物反应器900的组件包括肺室901、培养器室902、培养基储池903、动脉灌注泵904、排泄泵905、动脉压力传感器906、室压传感器907、气管压力传感器908、静脉压力传感器909、动脉线910、静脉线911、气管线912、过滤器913、氧合器914、控制模块915、静脉阀916、平衡线918、过滤器限流器(occluder)917、PPC模块700和正压歧管300。生物反应器900的组件除了添加连接至气管线911的正压歧管300以外一般如关于生物反应器800所述进行配置。该配置使得生物反应器900能够如关于生物反应器800所述生成负压通气，并在吸气和呼气的整个过程中生成和维持气道正压(通过气管线911)。生物反应器900还配置为适应大基质尺寸(如，成人肺和儿童肺)并由于添加平衡线918和限流器917而适用于长期培养。
在常规条件(如室内空气、自发通气)下的人体中，常规测量为：来自气管/气道的净压力“pt”≈0cmH2O；胸膜间腔压力(interpleural space pressure)“pp”≈-5—8cmH2O；动脉压“pa”≈13mmHg；静脉压“pv”≈6mmHg(平均pv9.5mmHg)；和间隙压力pi≈-5mmHg。使用斯塔林方程(Starling equation，参见Granger HJ,Laine GA等。Dynamics and controlof transmicrovascular fluid exchange.Staub NC,Taylor AE编辑。Edema.New York:Raven Press；1984.p.189–228)，计算可证实肺经历了间隙和淋巴负压，这可促进淋巴引流。例如，使用下列等式：
Jv＝LS[(Pmv-Ppmv)-σ(∏mv-∏is)]，
其中LS≈0.2mL/min/100g/mm Hg(Kf或流滤过系数，测量对流体的渗透性和血管表面积)；Pmv≈5至10mm Hg(微血管(≈毛细管)液体静压)；Ppmv≈-5至7mm Hg(周围微血管或间隙液体静压)；σ≈0.5至0.8(渗透反射系数，确定跨血管系统的膨胀压梯度对净驱动压的相对贡献，测量规定膜(如内皮)对特定溶质(如白蛋白)的渗透性，在膜全透时的0与全不透时的1之间变化)；Πmv≈24mm Hg(肺的微血管系统中血液的膨胀压)；和Πpmv≈14mm Hg(周围微血管小间隙中的膨胀压)，所得外在压力≈1.5-2mmHg，大约10-20cc/min的净流体流入胞间隙。来自气管/气道(pt)和来自胸膜间腔(pp)的净压为-5mmHg，结果间隙和淋巴负压促进淋巴引流。
呼吸期间整个肺实质的净负压及其波动以及肺组织的拉伸组合起到将间隙液排出的泵的作用，如例如Bhattacharya J等，Lung expansion and the perialveolarinterstitial pressure gradient.J Appl Physiol 1989；66:2600-5中所讨论的。因此，增加的自发通气导致增加的淋巴流动，如例如Albelda SM等，Effects of increasedventilation on Lung lymph flow in unanesthetized sheep.J Appl Physiol(1985).1986Jun；60(6):2063-70所述。
在用于肺评价的标准间接体外肺灌注(EVLP)方案中，将值设为：pt≈7.5cmH2O，pp为0mmHg，pa≈13mmHg，pv≈6mmHg(平均pv 9.5mmHg)。应用如上所述的等式，在理想环境下(假定灌注液的生理膨胀压和渗透反射系数)流向胞间隙的净流体流量大约为10-20cc/分钟。在该设定下，肺被分离并因而缺乏通常由胸壁施加的生理对压、胸膜间腔压力和间隙压力的波动、以及所产生的双向跨肺梯度。随着时间流逝，这导致静水性间质性肺水肿和最终的肺泡水肿和器官衰竭。这已作为回路诱导的肺损伤记述于例如Erasmus ME等中，Normothermic ex vivo lung perfusion of non-heart-beating donor lungs in pigs:from pretransplant function analysis towards a 6-h machinepreservation.Transpl Int 2006；19:589–593。
参考图9，肺室901和培养基储池903之间的压力平衡线918和过滤器913上的限流器917平衡肺室901和培养基储池903之间的压力。这确保在呼吸循环的所有阶段两个室之间的压力相等。该调整可适用于本文所述的所有生物反应器，小型动物和大型动物/人二者，并可用于正负压通气模式和湿干式通气模式。该压力平衡的引入，线918使得能够建立双向跨肺梯度。换言之，肺可从内部经Ppm 300压缩(从而建立气道正压)，并从外部经PPC模块700压缩(从而建立室正压)。
该双向跨肺梯度的目的在于防止长期分离肺培养上间质性水肿，并通过将间隙液推入血管系统来治疗(例如在之前损伤的肺中)已经形成的水肿，因而改善肺功能(如，顺应性、扩散性、重量和大小)。如果静脉压可相对于室压调整则可达到该梯度。通过调整培养基储池903的高度，进而调整静脉插管中水柱的高度并引流肺静脉回流至培养基室903，静脉压904可保持在高于或低于室压的恒定水平。基本上，两个室之间的平衡允许负压通气期间恒定的肺静脉。相反，如果不维持平衡且Pv保持恒定，则肺室901中的负压将导致静脉流中降低的静脉引流或反转(如部分或完全)，而肺室901中的正压将使肺静脉塌陷，导致流出阻塞。
本发明会在以下实施例中进一步描述，所述实施例并不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。
实施例
实施例1–基于无细胞肺支架和人源肺祖细胞的肺再生
背景：
已如下所述使用胚胎上皮细胞生成肺移植物，例如Ott HC等，Regeneration andorthotopic transplantation of a bioartificial lung.Nat Med.2010 Aug；16(8):927-33和Song JJ等，Enhanced in vivo function of bioartificial lungs inrats.Ann Thorac Surg.2011 Sep；92(3):998-1005。为了将该项技术转化为临床应用，应使用患者来源的细胞。这些细胞可源自朝向表型预先分化的源自IPS的细胞。
方法：
从成年路易斯大鼠整块(en block)收集含心脏和气管的大鼠肺。供体器官通过0.1％十二烷基硫酸钠(“SDS”)灌注和随后的经肺动脉盐水洗涤来去细胞化。然后将所得肺支架安装在如上所述的图2中的能够负压湿式通气的生物反应器中。将3千万个人脐带内皮细胞和1亿个处在定形内胚层阶段的预先分化的人iPS细胞(经皮肤成纤维细胞重编程衍生的BJRiPS细胞)分别经由肺动脉和气管同时递送。接着将肺移植物安装在生物反应器中并在静态器官培养下维持2小时使得细胞能够移植。接着以3mL/分钟的速率开始培养基灌注。湿式通气以移植室中-20至+10厘米H2O范围内的压力和8cm H2O的连续湿式气道正压开始。这些条件下的培养维持总计10天。在实验结束前，使用以35cm H2O的峰吸入压、5cm H2O的吸入正压、以及100％和21％的FiO2的正压通气来使肺通气。从静脉线中取出血气样品。接着从生物反应器收集肺移植物。右肺用于组织学生化和遗传组织分析。左肺用作肺移植物并正位移植到大鼠模型中。
结果：
观察内皮和预先分化的IPS细胞的细胞移植。细胞活力通过TUNEL染色证实并发现在培养结束时超过75％。气体交换在实验结束时通过血气分析证实。在所有的再生移植物中完成了左肺成功的手术移植。
实施例2-通过灌注和负压通气的肺保存：大鼠肺模型
背景：
供体肺目前以冷缺血状态转运。已努力在正常的热灌注和通气期间体外保存肺。目前最先进的设备也不允许维持具有良好活力的供体器官超过6至48小时。组织水肿和机械性损伤导致在此期间组织损伤和移植失败。所有目前可用的系统都使用正压干式通气，这在缺乏保护性胸壁下导致肺移植物的机械性损伤。我们设计了负压湿干式通气生物反应器并检查能够长期(>7天)维持有活力的肺组织的能力。
方法：
将3个月大的SD400大鼠用异氟烷麻醉并全身注射3000单位的肝素，接着经肺动脉用冷却到4摄氏度的10ml的PBS冲洗后，从中整块收集含心脏和气管的肺。将气管、肺动脉(PA)和左心房(LA)以无菌方式冲洗。将肺置于500ml器官室(主室)并在37摄氏度下在培养器中培养。将如图4所述的生物反应器用于本试验。
将气管线连接至正压歧管系统，提供含有5％CO2和余量的氧气或环境空气的连续气道正压(CPAP)。将PA线连接至灌注线，灌注线也连接至填充有灌注液的储池。灌注液由500ml的RPMI、1640Glutamax、500mg白蛋白、50ml胎牛血清、5ml抗生素/抗真菌液(每mL中10,000单位的青霉素、10mg的链霉素、25ug的两性霉素B)组成。主室和储池由重调管连接，也是为了使灌注液能够在两室之间循环。至少每隔一天更换灌注液。灌注和回流均通过蠕动泵(Ismatec,Cole-Parmer)调节。接近于PA线监控灌注线压力。主室和储池以蠕动泵(P-230,Harvard Apparatus)通过通气管连接，这能够通过移入和移出负压肺通气用的空气和流体而在主室建立正压和负压。
在通过PEEP/CPAP肺培养6或7天并用或不用负压肺通气来灌注后，固定肺、石蜡包埋并切片。进行H&E染色和TUNEL染色。
结果：
利用如下设定维持稳定分离的肺培养：15cm H2O PEEP，5％CO2和余量的空气，灌注速率1-3ml/min，在主室压力从+10mm Hg降至-20mm Hg下负压通气，呼吸率2至4，取决于多快达到目标负压。所测量的灌注线压力为8.4至30mm Hg。
关于组织学，在培养七天后观察正常外观的肺组织的一些区域。Tunnel染色证实了所保存的细胞活力。
实施例3—人肺支架的再细胞化和培养
分离来自4岁小儿供体的左肺，并将右肺成功插管和完全去细胞化。去细胞化后，将上下右叶分离并用于再细胞化和培养。
对于细胞接种和培养，分离肺叶的主要动脉和静脉并用设计为允许灌注液被动引流的血管插管进行插管。将管插入主气道并通过生物反应器室的盖子连接。该系统还允许恒定流量或压力控制的培养基灌注。
方法
将总计500×106的肺的肺泡上皮细胞(PAEpiCs,ScienCell)通过缓慢注射递送至气道，接着2小时37℃静态温育。以60ml/min的速率开始用1.5L体积的肺的肺泡细胞生长培养基灌注，产生～8-10mmHg的压力。灌注和培养在收集组织用于分析前维持4天。培养期间没有观察到污染。
结果
整个肺组织中多个区域的组织学分析证实了异种细胞保留但包括强再细胞化的多个区域。细胞分布的不一致性(patchy nature)可能是由于细胞递送的变化。肺的再细胞化区域显示高水平的沿肺支架自然结构的细胞附着和伸长。进一步的TUNEL细胞活力分析表明在4天培养中发生非常低水平的凋亡。
实施例4—尸体猪肺
本实施例记述了验证实验，其中将一组尸体猪连接至生物反应器并试验生物反应器的功能。
方法
得到一组尸体猪肺用于试验。插管肺动脉和气管，将器官置于器官室内，并将插管连接至其相应的输入(分别为灌注线和通气线)。在尝试器官通气之前开始用含肝素的磷酸盐缓冲盐水灌注。实施灌注的恒定流量和恒定压力模式。
结果
一旦实现成功灌注，试验器官室的增压模式。在通气器官时增压模式均成功。然而以压力目标增压(+20mmHg至-150mmHg)导致器官体积更加明显的变化。进行通气18小时(过夜)以确认生物反应器功能的一致性。将用于尸体肺第一试验的生物反应器参数总结于表3。
本实验并不包括连接至PPM歧管的通气袋。这导致由于通气线和膨胀的器官内有限的气体体积使器官室需要较大的负表压来通气器官。足够大的通气袋的添加应当缓解该膨胀，使气体自由流入流出肺，响应器官室压力变化而不是膨胀和接触。
表3 用于尸体猪肺试验的生物反应器设定的总结
参数 值或模式
温度(C) 25(台式)
通气类型 干式
PEEP 20mbar
通气气体 碳合气(Carbogen)
增压模式 压力目标
器官室压力目标 +20mmHg和-150mmHg
蓄压器范围：真空 -250mmHg至-500mmHg
蓄压器范围：压缩 1900mmHg至2200mmHg
灌注模式 恒压
灌注压力目标 +70mmHg相对于大气压
灌注液 1×PBS+肝素
灌注体积 4L
总通气时间 18h
实施例5—猪肺的保存(短期24小时)
本实施例记述了通气实验，其中分离的猪肺连接至生物反应器以验证经短期分离肺培养的生物反应器功能。监控整个培养过程中的器官室压力(图10A,POC)、PA压力(PPA)、PV压力(PPV)、PEEP室压(PPEEP)和气管压力(PT)。经由National Instruments的紧凑型数据采集(cDAQ)系统组合定制开发的LabVIEW程序(National Instruments,Woburn,MA)实现灌注参数、通气参数的控制和生物反应器事件的记录。
系统中的负压通气为压力控制的且受四个参数支配：呼吸率(RR)、吸入呼出(I:E)比、下限器官室压力目标(POC-下限)和上限器官室压力目标(POC-上限)。RR决定了各次呼吸的长度，而I:E比限定了各次呼吸进入吸气或呼气状态的时间间隔。POC-下限和POC-上限分别表示在吸入和呼出期间维持器官室的气压。POC-下限和POC-上限之差决定了呼吸的大小和肺的外部暴露的压力范围。因此，这些目标相对于PEEP室压的位置影响通气期间的P跨壁。对于这些实验，POC-上限设为接近于PEEP室压，POC-下限设为低于其10-15mmHg，依赖于肺的充分呼气的弹性回缩，以便不使招募的气道塌缩。在培养期间根据表4调整这些参数以维持膨胀并减少任何可见水肿的累积。大约以与培养基取样一样的频率进行调整，每24小时3-7次。
表4 培养参数调整表
方法
使用无菌技术取出供体肺并置于层流净化罩中。使用定制连接器(如，各种软管倒钩配件，Cole-Parmer,Vernon Hills,IL)将气管(T)、肺动脉(PA)和左心室口(PV)插管。接着将肺置于器官室(Instron TERM,Norwood,MA)中用于培养，并将PA、PV和气管的插管附连至其相应的连接。临床规模的生物反应器(图10A)包括容纳肺移植物的气密的器官室，起到流体储池的作用，并提供生理灌注和通气用连接。器官室和配室置于37℃培养器内以维持分离的肺培养的整个时期内的温度。该设定的重要特征在于能够在完全密闭的系统中长时间(可能数周)维持无菌器官培养，能够使培养基更换、取样和器官干预。
使用屠宰场猪肺(n＝8)以热缺血时间>1h和冷缺血时间>24h进行生物反应器功能的初步验证。对于试验的各组肺，将PA、PV和气管插管，采用组织活检作为对照，在器官室内连接之前将器官称重。然后开始培养基灌注(灌注线在连接至PA前装填有2L培养基)，募集肺，建立PEEP，并用培养器空气(21％O2，5％CO2)开始负压通气。培养基含有DMEM，增补有1×GlutaMAX、1×MEM氨基酸(Cat.#s 12800-017、35050-061和11130-051，LifeTechnologies,Carlsbad,CA)、1％v/v抗生素/抗真菌素、和110nM的氢化可的松(Cat.#sA5955和H6909Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，含有10％w/v BSA(Cat.#A2153,Sigma)作为胶体或者不含胶体。维持培养24小时，在此期间在PA和PV周期性取样灌注液。通过从PV排出室中除去1-2L的PV流出物，向器官室补充等量或更大体积的新鲜培养基，每24小时更换两次培养基。在整个培养过程中连续监控灌注和通气压。在分离肺培养之后，从室中取出肺，称重并采集组织样品用于组织学。
灌注液分析
从PA上游和PV下游取出灌注液(培养基)样品。在培养期间使用含CG8+盒(Abbott)的i-STAT 1分析仪(Abbott Point of Care Inc.,Princeton,NJ)测量pH、PO2、PCO2和葡萄糖来分析灌注液组成。短期ILC实验中不测量灌注液的乳酸盐含量。培养基组分的更改表示为PA和PV测量之差。因而负值表示减少，正值表示增加。
组织学和免疫荧光法
将组织样品在10％福尔马林中在真空下固定过夜，之后转移至70％乙醇，在石蜡中包埋，以5μm切片用于染色。苏木精和伊红(H&E)染色用于评价一般形态学特征。末端脱氧核糖酰转移酶dUTP缺口末端标记测定(Promega DeadEnd Fluorometric TUNEL System,Promega Corporation,Madison,WI)用于评价凋亡。通过评价每个组织样品中六个随机视野的每个20×视野(大约0.3419mm2)中TUNEL阳性细胞的百分比来进行凋亡定量。将来自各个试验的肺的两个以上的组织样品用于定量。CellProfiler[19,20]用于确定每个图像中的TUNEL阳性细胞数。
通过下列步骤进行组织切片的一次标记：第一脱蜡和再水化组织切片，接着在高压釜中于柠檬酸溶液(抗原揭露液，基于柠檬酸的，Cat.#H-3300，Vector LaboratoriesInc.,Burlingame,CA)中进行抗原修复，在PBS中洗涤切片，用PBS中的5％驴血清(Cat.#S-30-100ML,EMD Millipore,Darmstadt,Germany)封闭30分钟，并用一抗温育载玻片过夜(18小时)。使用针对VE-钙粘蛋白(Cat.#sc-9989,Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)、E-钙粘蛋白(Cat.#610181,BD Biosciences,San Jose,CA)、ZO-1(Cat.#61-7300,LifeTechnologies,Grand Island,NY)和pro-SPB(Cat.#AB3430,EMD Millipore)的一抗。通过下列步骤进行一抗的二次标记：在PBS中的0.1％的Tween中进行第一洗涤组织切片，接着用相应的二抗温育30分钟，再次用PBS中的0.1％Tween洗涤，并用含DAPI的封固剂(DAPIFluoromount-G,Cat.#0100-20,SouthernBiotech,Birmingham,AL)封固载玻片。
物性参数的计算
跨壁压(PTM)计算为PTM＝PT–POC且为施加到肺以促进通气的机械应力的测量指标。正PTM对应于吸入，负PTM对应于呼出。器官重量的百分比变化计算为ΔW器官＝(W终–W初)/W初*100。葡萄糖和乳酸盐的质量消耗率(Δ葡萄糖和Δ乳酸盐)计算为从PA到PV的浓度变化乘以灌注流速。肺血管阻力(PVR)计算为PVR＝(PPA–PPV)/Q，其中Q为灌注流速。除非另有说明，所有数据表示为平均值±标准差或表示为箱形图。
结果
针对DMEM中10％的BSA(BSA,n＝5)和仅DMEM(DMEM,n＝3)灌注组的短期(24h)ILC条件列于表5。两组中的肺的培养前冷缺血时间>24小时。灌注和通气期间两组的PA压力维持在相对于器官室压力的20-40mmHg。培养期间调整PEEP、呼吸率、跨壁压和I:E比以保持膨胀，并减少任何可见水肿的累积但在组间是相似的。
相比于仅在DMEM中培养的肺，在10％BSA中培养24小时的肺显示出较大的器官重量变化百分比(图11a)。对于BSA组，在PA和PV的平均pO2值分别为131.7±6.5mmHg和79.2±8.1mmHg。对于DMEM组，在PA和PV的平均pO2值分别为156.1±6.8mmHg和101.5±2.5mmHg。整个培养期间在PA和PV的同时灌注液取样允许随着灌注实现培养基的溶解气体和葡萄糖含量的变化。来自两组的培养基揭示了溶解O2和葡萄糖的类似消耗与溶解CO2的相应产生(图11b)。这些观察在整个24小时培养期间始终一致。
取自短期ILC后的组织样品的组织学分析(图11c-d)揭示了天然肺结构(nativelung architecture)的维持(图11c)。TUNEL测定(图11d-e)示出凋亡细胞百分比的统计上不显著的少量增加(ANOVA,p＝0.6851)。
表5 短期ILC条件表
实施例6—猪肺的保存(长期72小时)
本实施例记述了验证实验，其中将分离猪肺连接至生物反应器以验证经长期分离肺培养的生物反应器功能。监控整个培养过程中的器官室压力(图10A,POC)、PA压力(PPA)、PV压力(PPV)、PEEP室压(PPEEP)和气管压力(PT)。经由National Instruments的紧凑型数据采集(cDAQ)系统组合定制开发的LabVIEW程序(National Instruments,Woburn,MA)实现灌注参数、通气参数的控制和生物反应器事件的记录。
生物反应器中的负压通气为压力控制的且受四个参数支配：呼吸率(RR)、吸入呼出(I:E)比、下限器官室压力目标(POC-下限)和上限器官室压力目标(POC-上限)。RR决定了各次呼吸的长度，而I:E比限定了各次呼吸进入吸气或呼气状态的时间间隔。POC-下限和POC-上限分别表示在吸入和呼出期间维持器官室的气压。POC-下限和POC-上限之差决定了呼吸的大小和肺的外部暴露的压力范围。因此，这些目标相对于PEEP室压的位置影响通气期间的P跨壁。对于这些实验，POC-上限设为接近于PEEP室压，POC-下限设为低于其10-15mmHg，依赖于肺的充分呼气的弹性回缩，以便不使招募的气道塌缩。在培养期间根据表6调整这些参数以维持膨胀并减少任何可见水肿的累积。大约以与培养基取样一样的频率进行调整，每24小时3-7次。
表6 培养参数调整表
方法
将冷缺血时间<1h的猪肺(n＝4)用于建立长期ILC。准备培养用器官，除了使用非胶体培养基以外，使用如上所述的步骤安装于器官室内。维持培养至少72小时，在此期间在PA和PV周期性取样灌注液。培养基还以短期ILC所述的相同间隔更换，如果器官室储池出现低(<1L)则添加额外的培养基。在整个培养过程中连续监控灌注和通气压。通过用100％O2(FiO2＝1.0)通气10分钟并观察灌注液中如在PV出口测量的O2分压变化来进行氧交换的功能性试验，其中ΔPV pO2＝PV pO2试验后–PV pO2试验前。该功能性试验方法经比较PA处和PV处的pO2来选择，这是由于系统以闭环灌注培养基且不在PA上游将灌注液脱氧。FiO2＝0.21和1.0时PV pO2值的比较揭示了在我们的生物反应器系统的环境下对肺通气以氧合灌注液的能力。在功能性试验期间中空纤维气体交换器供给有灌注时残留的培养空气。ILC后，将肺从室中取出，并采集组织样品用于组织学。
灌注液分析
从PA上游和PV下游取出灌注液(培养基)样品。在培养期间使用含CG8+盒(Abbott)的i-STAT 1分析仪(Abbott Point of Care Inc.,Princeton,NJ)测量pH、PO2、PCO2和葡萄糖来分析灌注液组成。CG4+盒用于测量长期ILC实验中的乳酸盐含量。培养基组分的更改表示为PA和PV测量之差，因而负值表示减少，正值表示增加。
组织学和免疫荧光法
将组织样品在10％福尔马林中在真空下固定过夜，之后转移至70％乙醇，在石蜡中包埋，以5μm切片用于染色。苏木精和伊红(H&E)染色用于评价一般形态学特征。末端脱氧核糖酰转移酶dUTP缺口末端标记测定(Promega DeadEnd Fluorometric TUNEL System,Promega Corporation,Madison,WI)用于评价凋亡。通过评价每个组织样品中六个随机视野的每个20×视野(大约0.3419mm2)中TUNEL阳性细胞的百分比来进行凋亡定量。将来自各个试验的肺的两个以上的组织样品用于定量。CellProfiler[19,20]用于确定每个图像中的TUNEL阳性细胞数。
通过下列步骤进行组织切片的一次标记：第一脱蜡和再水化组织切片，接着在高压釜中于柠檬酸溶液(抗原揭露液，基于柠檬酸的，Cat.#H-3300，Vector LaboratoriesInc.,Burlingame,CA)中进行抗原修复，在PBS中洗涤切片，用PBS中的5％驴血清(Cat.#S-30-100ML,EMD Millipore,Darmstadt,Germany)封闭30分钟，并用一抗温育载玻片过夜(18小时)。使用针对VE-钙粘蛋白(Cat.#sc-9989,Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)、E-钙粘蛋白(Cat.#610181,BD Biosciences,San Jose,CA)、ZO-1(Cat.#61-7300,LifeTechnologies,Grand Island,NY)和pro-SPB(Cat.#AB3430,EMD Millipore)的一抗。通过下列步骤进行一抗的二次标记：在PBS中的0.1％的Tween中进行第一洗涤组织切片，接着用相应的二抗温育30分钟，再次用PBS中的0.1％Tween洗涤，并用含DAPI的封固剂(DAPIFluoromount-G,Cat.#0100-20,SouthernBiotech,Birmingham,AL)封固载玻片。
物性参数的计算
跨壁压(PTM)计算为PTM＝PT–POC且为施加到肺以促进通气的机械应力的测量指标。正PTM对应于吸入，负PTM对应于呼出。器官重量的百分比变化计算为ΔW器官＝(W终–W初)/W初*100。葡萄糖和乳酸盐的质量消耗率(Δ葡萄糖和Δ乳酸盐)计算为从PA到PV的浓度变化乘以灌注流速。肺血管阻力(PVR)计算为PVR＝(PPA–PPV)/Q，其中Q为灌注流速。除非另有说明，所有数据表示为平均值±标准差或表示为箱形图。
结果
长期(72h)ILC条件和结果列于表7。肺在培养前具有大约1小时的冷缺血时间。灌注和通气期间长期ILC时的PA压力维持在器官室压力或相对于器官室压力之下20-40mmHg。培养期间调整PEEP、呼吸率、跨壁压和I:E比并减少任何可见水肿的累积但在组间是相似的。
长期ILC下的肺显示O2和葡萄糖的消耗与CO2的相应产生(图12a)，尽管比在短期ILC下试验的肺的程度低一些(图11b，注意y轴标尺)。在长期ILC下的肺中还观察到乳酸盐的相应产生(图12a)。长期ILC下的肺的功能性试验揭示了氧交换能力维持了整个72h(3天)的培养时间(图12b，左)。功能性试验后PA和PV的pO2值(图12b，右)揭示PV处的pO2大于PA，以及与用FiO2＝0.21(FiO2为0.21的平均PA pO2＝144.0±9.78mmHg)平衡时相比灌注液pO2的总体增加。培养基总体积随培养时间增加，这是由于在器官室储池出现低(<1L)时添加了新鲜培养基。始终一致的平均PA流速(QPA)产生长期ILC下肺在整个培养期间稳定的PPA和PVR(图12b)。
TUNEL测定(图11d-e)示出取自完整的72h培养期后的组织样品中凋亡百分比与对照组织相比的统计上不显著的少量增加(图12d,p＝0.0692)。H&E染色(图12e)揭示了长期ILC后肺结构的维持。长期ILC后收集的肺组织(图12e,72h)与培养前组织活检(图12e,0h)相比还保留VE-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、ZO-1和pro-SPB的表达和出现。
表7 长期ILC条件表
实施例7—单一人肺的保存(长期72小时)
本实施例记述了验证实验，其中将分离人肺连接至生物反应器以通过长期分离肺培养验证生物反应器功能。监控整个培养过程中的器官室压力(图10A,POC)、PA压力(PPA)、PV压力(PPV)、PEEP室压(PPEEP)和气管压力(PT)。经由National Instruments的紧凑型数据采集(cDAQ)系统组合定制开发的LabVIEW程序(National Instruments,Woburn,MA)实现灌注参数、通气参数的控制和生物反应器事件的记录。
我们的系统中的负压通气为压力控制的且受四个参数支配：呼吸率(RR)、吸入呼出(I:E)比、下限器官室压力目标(POC-下限)和上限器官室压力目标(POC-上限)。RR决定了各次呼吸的长度，而I:E比限定了各次呼吸进入吸气或呼气状态的时间间隔。POC-下限和POC-上限分别表示在吸入和呼出期间维持器官室的气压。POC-下限和POC-上限之差决定了呼吸的大小或肺的外部暴露的压力范围。因此，这些目标相对于PEEP室压的位置影响通气期间的P跨壁。对于这些实验，POC-上限设为接近于PEEP室压，POC-下限设为低于其10-15mmHg，依赖于肺的充分呼气的弹性回缩，以便不使招募的气道塌缩。在培养期间根据表8调整这些参数以维持膨胀并减少任何可见水肿的累积。大约以与培养基取样一样的频率进行调整，每24小时3-7次。
表8 培养参数调整表
方法
与新英格兰器官银行(NEOB)协调，以标准手术方式从心脏仍在跳动的供体获得了发现不适合移植的捐赠人肺。捐赠前的胸部的x射线显示少量基底肺不张，动脉氧张力为100％FiO2上116mmHg，表明受损的气体交换。将肺递送到冰上的无菌容器中并在到达后立即安装到生物反应器上。分离右肺，并在如上72小时的长期ILC中所述设定之前将PA、PV和气管插管。从收集到再灌注的冷缺血时间为5.5小时。
灌注液分析
从PA上游和PV下游取出灌注液(培养基)样品。在培养期间使用含CG8+盒(Abbott)的i-STAT 1分析仪(Abbott Point of Care Inc.,Princeton,NJ)测量pH、PO2、PCO2和葡萄糖来分析灌注液组成。CG4+盒用于测量长期ILC实验中的乳酸盐含量。培养基组分的更改表示为PA和PV测量之差，因而负值表示减少，正值表示增加。
组织学和免疫荧光法
将组织样品在10％福尔马林中在真空下固定过夜，之后转移至70％乙醇，在石蜡中包埋，以5μm切片用于染色。苏木精和伊红(H&E)染色用于评价一般形态学特征。末端脱氧核糖酰转移酶dUTP缺口末端标记测定(Promega DeadEnd Fluorometric TUNEL System,Promega Corporation,Madison,WI)用于评价凋亡。通过评价每个组织样品中六个随机视野的每个20×视野(大约0.3419mm2)中TUNEL阳性细胞的百分比来进行凋亡定量。将来自各个试验的肺的两个以上的组织样品用于定量。CellProfiler[19,20]用于确定每个图像中的TUNEL阳性细胞数。
通过下列步骤进行组织切片的一次标记：第一脱蜡和再水化组织切片，接着在高压釜中于柠檬酸溶液(抗原揭露液，基于柠檬酸的，Cat.#H-3300，Vector LaboratoriesInc.,Burlingame,CA)中进行抗原修复，在PBS中洗涤切片，用PBS中的5％驴血清(Cat.#S-30-100ML,EMD Millipore,Darmstadt,Germany)封闭30分钟，并用一抗温育载玻片过夜(18小时)。使用针对VE-钙粘蛋白(Cat.#sc-9989,Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)、E-钙粘蛋白(Cat.#610181,BD Biosciences,San Jose,CA)、ZO-1(Cat.#61-7300,LifeTechnologies,Grand Island,NY)和pro-SPB(Cat.#AB3430,EMD Millipore)的一抗。通过下列步骤进行一抗的二次标记：在PBS中的0.1％的Tween中进行第一洗涤组织切片，接着用相应的二抗温育30分钟，再次用PBS中的0.1％Tween洗涤，并用含DAPI的封固剂(DAPIFluoromount-G,Cat.#0100-20,SouthernBiotech,Birmingham,AL)封固载玻片。
物性参数的计算
跨壁压(PTM)计算为PTM＝PT–POC且为施加到肺以促进通气的机械应力的测量指标。正PTM对应于吸入，负PTM对应于呼出。器官重量的百分比变化计算为ΔW器官＝(W终–W初)/W初*100。葡萄糖和乳酸盐的质量消耗率(Δ葡萄糖和Δ乳酸盐)计算为从PA到PV的浓度变化乘以灌注流速。肺血管阻力(PVR)计算为PVR＝(PPA–PPV)/Q，其中Q为灌注流速。除非另有说明，所有数据表示为平均值±标准差或表示为箱形图。
结果
培养的第一人肺与之前试验的猪肺组的行为类似。在培养期间，平均PA压力为12.10mmHg，PEEP设为8.38mmHg。呼吸率保持在每分钟5次呼吸，I:E＝1.2，PTM在12.91至-4.47mmHg的范围内(ΔPTM＝17.38mmHg)。氧气和葡萄糖的消耗随着乳酸盐的产生以可比的程度存在(图13a)。不像猪肺，观察到朝向CO2从培养基中除去的趋势(图13a)。氧气交换功能也在整个培养期间维持(图13b，左)。功能试验后的PA和PV pO2值(图13b，右)揭示了PV处的pO2显著高于试验的猪肺，以及与用FiO2＝0.21(平均PA pO2＝145.1mmHg)平衡时相比灌注液pO2的总体增加。在器官室储池出现低(<1L)时添加了新鲜培养基，结果培养基总体积随培养时间增加(图13c，上)。再者，始终一致的平均QPA产生长期ILC下人肺在整个培养期间稳定的PPA和PV(图13c)。
也观察到小的、非统计学显著的凋亡增加(图13d,p＝0.1352)。组织学分析揭示了长期ILC后肺结构的维持(图13e,H&E)。长期ILC下的人肺也保留了VE-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、ZO-1和pro-SPB的表达和出现(图13e)。
实施例8—大鼠肺的保存
本实施例记述验证实验，其中将新分离的大鼠肺连接至生物反应器以试验生物反应器的功能。
方法
将大鼠肺在生理热条件下使用负通气保存。如图14A所示，将主室压力从0调整到-8cm H2O，呼吸率为20/min。
结果
在第一实验中，添加有5％右旋糖酐的KBH(0.6ml/min)灌注液(如图14B-C所示)导致灌注压和动态顺应性(Cdyn)在4小时内降低，肺变得完全水肿。Cdyn是肺品质的功能性参数。另外，当使用不含右旋糖酐的KHB(0.6ml/min)时灌注压和动态顺应性(Cdyn)也在6小时内降低。
采集用0.6ml/min的KHB以及5％右旋糖酐灌注的分离肺相关的生理数据(如图15A-C所示)。如图15A所示调节主室压力0--8cm H2O，呼吸率为20/min。参考图15B，示出PA灌注压的时程。如图15B所示，压力逐渐降低，动态顺应性(Cdyn)也降低。在本实验中，分离肺在4小时灌注后完全水肿。Cdyn定义为潮气量(ml)除以峰主室负压值(cmH2O)。参考图15C，没有分离肺被保存破坏或损伤的迹象。图15C为示出肺标本在用苏木精和伊红灌注后的染色结果的图像。左图，对照，100×。右图，灌注6小时后的样品，100×。该图像示出生物反应器中尸体肺的6h灌注和通气后的正常肺结构和细胞完整性的维持。
实施例9—从人供体分离原代肺表皮
本实施例记述了分离和扩增原代人肺表皮的方案。第一，修改的新生大鼠组织消化方案(方案A)，第二，改编自文献(Karp,P.H.et al.,Protocol B)的方案。
方法：
方案A-基于大鼠新生肺/肾消化。测定时间＝～3小时
1.制备消化培养基：1mg/ml分散酶(Stem Cell Technologies)，含1mg/ml胶原酶
2.将(a)外周肺组织～1.5”立方，或(b)主气道(分支细支气管)分配到50ml离心管
3.向各管添加20ml的消化培养基
4.使用小的尖头剪刀将肺快速切成小碎块
5.在消化缓冲液中37℃温育切碎的肺90分钟
6.从37℃移除样品并使组织暂时沉降
7.从样品吸取流体并通过100μm的过滤器
8.离心沉降滤液–300×g，5min
9.在红细胞裂解缓冲液中重悬并室温温育5-10min
10.添加当量体积的αMEM来洗涤
11.离心沉降–300×g，5min
12.计数并将细胞直接铺至培养瓶。
方案B-基于Mol Biol.2002；188:115-37的方法。测定时间＝～24小时
1.准备解离液：链霉素蛋白酶(Roche/Boehringer Mannheim,cat.no.165921)和脱氧核糖核酸酶1(Sigma,cat.no.DN-25)。对于100mL而言，在100mLαMEM中溶解140mg链霉素蛋白酶和10mg Dnase。
2.将(a)外周肺组织～1.5”立方，或(b)主气道(分支细支气管)分配到50ml离心管
3.向各管添加20ml的消化培养基
4.使用小的尖头剪刀将肺快速切成小碎块
5.在消化缓冲液中4℃温育切碎的肺24小时。解离期间不时颠倒试管以搅拌和打散细胞块。气管和支气管组织需要最低40h到最高96h。
6.为了结束解离，向解离液添加含10％FBS的αMEM。将离心管颠倒数次以搅拌细胞悬液。在特定的气道中重悬细胞团并铺在未涂布的组织培养皿上。温育悬浮液最低1h或更长时间以使成纤维细胞附着。气道表皮细胞在没有胶原预处理的情况下不会附着塑料表面。
7.从培养皿中收集未附着的细胞悬液，转移至涂布的平皿。
在通过方案A和方案B消化人供体肺后，将细胞铺在用(1)0.1％的明胶或(2)0.1mg/ml的胶原IV预涂布的培养瓶上。接着细胞在(1)DMEM、(2)SAGM、(3)AepiCM或(4)BEGM中生长。
结果：
培养24小时时评价细胞附着和形态学表明，方案B与平板上涂布胶原IV的组合产生更多的表皮样克隆。继续这些培养7天证实了相应的这些培养物的扩增能力。在DMEM中培养的细胞以成纤维细胞样细胞群快速生长过度，将这些培养物丢弃。
此时，将细胞传代并再铺板，从而进一步评价扩增能力。来自各条件的细胞等份还接种到人肺基质切片中以评价生物相容性。细胞基质培养4天后添加钙黄绿素AM染料表明培养物中高水平的活力和细胞生存力并观察到细胞与基质之间的相互作用。
还通过在培养第11天免疫荧光染色、接着传代一次来研究培养细胞的表型。异种表型表示1型肺泡细胞(T1α)、克拉拉细胞(CCSP)、气道表皮细胞(CK5)、基底细胞(p63)、II型肺泡细胞(E-Cad)和间充质细胞(波形蛋白)的子集。
其他实施方案
已经记述了本发明的多个实施方案。然而，将理解的是，可进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (28)

1.一种气道器官生物反应器装置，其包括：
器官室，其配置为容纳灌注入至少一种流体的器官基质支架或器官；
连接所述器官室和储池系统的输入线，其中所述输入线包括下述中的任意种：流体线、动脉线、静脉线、气管线或输入泵；
连接所述器官室和所述储池系统的输出线，其中所述输出线包括输出泵；
控制器，其配置为通过所述输入线和所述输出线控制所述器官室与所述储池系统之间的流体交换；和
连接至所述器官室的室压传感器，其中所述室压传感器配置为记录并向所述控制器传输室压。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述输入泵、所述输出泵、或二者为双向泵。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述控制器配置为借助以下任意方式通过所述输入线和所述输出线控制所述器官室与所述储池系统之间的流体交换：
控制所述双向泵的方向，或
控制所述双向泵的泵循环持续时间。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述控制器配置为响应从所述室压传感器传输的数据通过所述输入线和所述输出线控制所述器官室与所述储池系统之间的流体交换。
5.根据权利要求1所述的装置，其中所述输入线包括所述动脉线、所述静脉线、和所述气管线。
6.根据权利要求1所述的装置，其中所述气管线连接至所述器官室和正压歧管，所述正压歧管包括：
气源；
连接至所述气源的蓄压器；和
连接至所述蓄压器的泄压阀，
其中所述正压歧管由所述控制器控制。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述正压歧管配置为沿着所述气管线施加连续正压。
8.根据权利要求6所述的装置，其中：
所述动脉线和所述静脉线之一或二者包括压力传感器、流体泵、或者压力传感器和流体泵二者。
9.根据权利要求8所述的装置，其中：
所述动脉线包括第一压力传感器和第一泵，各自由所述控制器控制；
所述静脉线包括第二压力传感器和第二泵，各自由所述控制器控制；和
所述气管线包括第三压力传感器和第三泵，各自由所述控制器控制。
10.根据权利要求9所述的装置，其中所述第三泵为双向的。
11.根据权利要求5所述的装置，其中所述动脉线和所述静脉线连接至所述储池系统，和所述气管线连接至通气器。
12.根据权利要求1或6所述的装置，其进一步包括连接至所述器官室的气压控制模块，其中所述气压控制模块包括：
进气口线，其包括入口压力阀、入口蓄压器和入口压缩器；和
出气口线，其包括出口压力阀、出口蓄压器和出口压缩器，
其中所述控制器控制下列任意种：入口压力阀、入口压缩器、出口压力阀或出口压缩器。
13.一种提供湿式成熟肺器官的方法，所述方法包括：
提供配置为连接至动脉线、静脉线和气管线的器官室；
提供包括气道和丰富血管系统的肺组织基质；
将所述气道连接至所述气管线；
将所述肺组织基质连接至所述动脉线和所述静脉线；
在下述至少之一上用细胞接种所述肺组织基质：所述动脉线、所述静脉线或所述气管线；
给所述肺组织基质提供足以发生第一期望程度的器官成熟，从而生产湿式成熟器官的时间的湿式通气；和
任选地在湿式通气期间在所述器官室中维持基本上恒定的流体水平。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述器官室包括室压传感器和双向排水室泵，各自由控制模块控制，所述控制模块响应由所述室压传感器传输的数据而控制所述双向排水泵。
15.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括用培养基储池中的压力水平平衡所述静脉线中的压力水平来防止经肺压力梯度。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述器官室还包括连接至所述器官室的气压控制模块，其中所述气压控制模块：
在吸气阶段在所述器官室中生成负压；
对于稳定阶段维持所述器官室的压力；和
在呼气阶段在所述器官室中生成正压。
17.根据权利要求14所述的方法，其中湿式通气包括：
将所述气管线连接至培养基储池，其中所述气管线包括连接至所述控制器的双向气管泵；
使用所述双向气管泵用培养基使所述肺组织基质充胀；和
使用所述双向气管泵将培养基从所述肺组织基质抽出来使所述肺组织基质收缩，
其中所述培养基在湿式通气期间不断更新。
18.根据权利要求14所述的方法，其中湿式通气包括：
将所述气管线连接至培养基储池，其中所述气管线包括各自连接至所述控制器的第一泵和第二泵；
使用所述第一泵用培养基使所述肺组织基质充胀；和
使用所述第二泵将培养基从所述肺组织基质抽出而使所述肺组织基质收缩，
其中所述培养基在湿式通气期间不断更新。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述控制器响应由连接至所述气管线的气管压力传感器传输的数据而控制所述双向气管泵。
20.一种保存、修复和/或修饰肺器官的方法，所述方法包括：
提供配置为连接至动脉线、静脉线和气管线的器官室；
提供包括气道和丰富血管系统的权利要求13的湿式成熟肺，或收集肺；
将所述气道连接至所述气管线；
将所述湿式成熟肺或所述收集肺连接至动脉线和静脉线；
在所述湿式成熟肺或所述收集肺的所述血管系统上通过至少所述动脉线或所述静脉线灌注培养基；
向所述湿式成熟肺或所述收集肺提供足以产生或维持功能性肺器官的时间的干式通气；和
使气管压力波动最小化。
21.根据权利要求20所述的方法，其中使气管压力波动最小化包括：
将所述气管线连接至培养基储池，其中所述气管线包括各自连接至控制器的通气器和气管压力传感器；
使用所述通气器用气体使所述湿式成熟肺或所述收集肺充胀；和
使用所述通气器使所述湿式成熟肺或所述收集肺收缩，
其中所述控制器使得所述通气器引起所述湿式成熟肺或所述收集肺充胀或收缩，以使由所述气管压力传感器感知的所述气管压力波动最小化。
22.根据权利要求20所述的方法，其中使任意气管压力波动最小化包括：
提供连接至所述气管线和控制器的正压歧管，其中所述正压歧管包括：
蓄压器；
连接至所述蓄压器的气源；和
泄压阀，和
提供连接至所述气管线和所述控制器的气管压力传感器，
其中所述控制器响应由所述气管压力传感器传输的数据而控制压缩器或所述泄压阀。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述蓄压器具有适当大小以使吸气和呼气期间的压力波动最小化。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述器官室还包括连接至所述器官室的气压控制模块，其中所述气压控制模块：
在吸气阶段在所述器官室中生成负压；
对于稳定阶段维持所述器官室的压力；和
在呼气阶段在所述器官室中生成正压。
25.根据权利要求20所述的方法，其中：
使气管压力波动最小化包括：
提供连接至所述气管线和控制器的正压歧管，其中所述正压歧管包括：
蓄压器；
连接至所述蓄压器的气源；和
泄压阀，和
提供连接至所述气管线和所述控制器的气管压力传感器，
其中所述控制器响应由所述气管压力传感器传输的数据而控制压缩器或所述泄压阀；和
所述器官室包括连接至所述器官室的气压控制模块，其中所述气压控制模块：
在吸气阶段在所述器官室中生成负压；
对于稳定阶段维持所述器官室的压力；和
在呼气阶段在所述器官室中生成正压。
26.一种功能肺，其通过根据权利要求13-25任一项所述的方法生产。
27.根据权利要求26所述的功能肺，其中器官为全肺或其血管化部位。
28.一种治疗具有受损的或降低的肺容量的受试者的方法，所述方法包括将权利要求27所述的肺移植入所述受试者中。
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