CN106434650B - 一种抗鸡新城疫病毒的肽核酸及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗鸡新城疫病毒的肽核酸，针对鸡新城疫病毒NDV的HN和M蛋白的基因高度保守区域设计特异性强的两组反义核酸序列，能特异地与NDV的两个关键基因HN和M结合，且分布于NDV基因组的不同区域，该序列与上述靶基因反向互补，根据碱基互补原理，反义核酸序列特异性地与NDV(HN和M)的对应的靶基因相结合，诱导核酶等分子对靶基因进行降解，阻断靶基因的转录与表达，抑制NDV在宿主体内复制与装配，以达到防控鸡新城疫病毒的目的。

Description

一种抗鸡新城疫病毒的肽核酸及应用

技术领域

本发明涉及一种用于防控鸡新城疫病毒(NDV)的特异性抗病毒肽核酸(反义寡核苷酸)，尤其是涉及含有该反义核酸序列的药物组合物，及其在动物药物上的用途。

背景技术

新城疫(Newcastle Disease，ND)由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)感染引起的一种以呼吸道、消化道粘膜出血为典型病变的高度接触性、急性败血性禽类传染病。该病毒主感染鸡、珠鸡和火鸡等，最少有200多种鸟能够被感染，成为目前危害世界养禽业的极易传染的两大毁灭性疾病之一。ND对感染禽类的危害极为严重，因而世界各国均对其采取严格防范措施。被国际兽疫局OIE列为对畜禽危害最大的A类传染病之一。自1926年从印度瓜哇分离到NDV以来，NDV曾在世界范围内造成4次大规模的流行。首次大暴发起源于东南亚和英国，持续时间从1926到1960年，历时近30年，此次流行主要由基因Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型引起，该毒株未流入美国。随着NDV疫苗的广泛使用,此次大流行逐渐平息。第二次大流行始于20世纪60年代的远东，此次大流行主要由基因Ⅴ型和Ⅵ型引起，在短短的4年时间便由南美洲和印尼传入欧美等国家和地区，引起全球流行，主要原因与畜禽国际贸易密切相关。第三次流行始于1974年前后，疫源地尚无定论现在大多数学者认为是由鸽源新城疫病毒引起的。第四次流行发生于亚洲、中东、非洲、南美和欧洲，并一直流传至今，此次流行主要由新基因Ⅶ型引起的。特别是20世纪90年代后期，该病在世界范围内对养禽业造成了巨大的损失。介于ND自然宿主众多，流行范围广，因而对禽类养殖业危害严重，加上大老规模的强制使用疫苗，在临床上该病毒常表现为非典型症状。目前国内外兽医面研究人员对NDV的流行特点及趋势的研究极为关注。

关于国内ND的研究，1928年在我国已有记载，1935年在我国部分地区出现流行，40年代分离到国内标准强毒株(F48E8/F48E9株)。ND也是我国禽病中最为烈性的传染病之一，也曾经出现过4次大流行，且在我国许多地区每年都有流行，损失巨大。80年代前后预防接种工作已在养禽业中广泛推广，疫苗的广泛使用收到了良好的效果，许多省区基本上控制了这种疫病。但我国养殖环境复杂，集约化程度仍然不高，疫苗的使用效果仍不够理想。过去认为NDV可以感染水禽但并不致病，但自1997年在华南和华东地区分离到对鹅具有致病性的强毒株后，各地相继分离到对水禽具有高致病性的毒株。在我国，鸡与水禽长期混养，这种混养模式为病毒的相互传播提供良好的宿主环境。近年来，该病随着经济的发展和交往的频繁，新城疫的流行又有抬头的趋势，而且又具有了新的特点，许多地方检测到非典型新城疫，其造成的经济损失不言而喻。同时，目前NDV疫苗使用情况不规范，出现中毒、弱毒、灭活疫苗同时使用情况，这给防控ND带来极大困难，因而开发针对NDV的新型防控药物与措施显得尤为重要。

NDV的毒力千差万别，毒力变化机制极为复杂，可以由强变弱，也能够由弱变强，变异趋势引起禽病专家高度关注，这也是研究新型药物所必须考虑的。

NDV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒属。完整的病毒粒子近似球形，直径120～300nm，NDV病毒粒子内部为一直径约17nm的卷曲的核衣壳(由蛋白质相连结的单股RNA所形成)，其内带有RNA依赖的RNA聚合酶，外面包有脂质双层囊膜。其内层衬有一层特殊的M蛋白，囊膜的外层为具有纤突(8～12nm)的糖蛋白所覆盖,它们分别是具有血凝素和神经氨酸酶活性的HN蛋白和具有融合功能的F蛋白，HN和F蛋白与病毒的毒力有关。

典型的NDV为单股负链RNA病毒，整个基因组全长15586个核苷酸(经典的新城疫病毒基因组长度为15 186个nt，如LaSota和V4毒株等)，编码6种结构蛋白，即核衣壳蛋白(Np)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶(HN)及RNA聚合酶(L)，各蛋白在基因组上顺序为3’—NP—P—M—F—HN—L—5’。Collins等研究表明，在NDV感染细胞的胞浆中，病毒基因组RNA转录出三组mRNA，沉降系数分别18s、22～28s和35s。其中18sRNA包括5种3’端聚腺苷酸化的mRNA，分别编码NP、P、M、HN和F 5种病毒结构成分；35sRNA仅含单一编码L的信息。Nothern杂交试验显示，18s和35sRNA已经包含了整个基因组的遗传信息，其中22～28sRNA含有18sRNA的序列，可能是共价结合的18sRNA。在各基因间有一个3’-GAA保守序列。NDV mRNA在各组mRNA之前均有一个保守的起始信号3’-UGCCCAUCUU-5’,且每一基因末端含有转录的终止信号序列,即3’-AUUCUUUUUU5’序列和mRNA互补的polyA。mRNA的起始信号和polyA之间的距离不等通常在1～47个核苷酸之间。

M蛋白，NDV的M蛋白是一个由346个氨基酸组成的多肽，分子量为39.7kDa，基因长度为1241bp，有一个开放阅读框架。转录起始信号也是ACGGGTAGAA，翻译起始于ATG，终止于TAA。M蛋白是非糖蛋白，位于病毒囊膜内侧面，一部分镶嵌在囊膜内，另一部分与核衣壳相邻，共同构成囊膜的支架。M蛋白至少有两个功能区：一为是蛋白质在脂质双层上的嵌合部位；二为区域与病毒核心中的核衣壳结构相互作用有关。M蛋白有多种功能，1).通过与细胞膜、病毒糖蛋白的胞质区以及核衣壳的相互作用而参与病毒的装配过程，进而对形成具有感染性的病毒粒子至关重要，对于M蛋白发生突变的NDV毒株，可能由于不能将F蛋白有效地组装入病毒粒子而失去其感染能力；2).具有抑制宿主细胞RNA转录和蛋白质合成的作用而与病毒的致病性相关。NDV感染早期细胞核内就有M蛋白存在，并在核内和细胞核物质结合，影响正常的基因复制和表达。M蛋白在细胞核中的定位不需要NDV其他蛋白质的参与。目前普遍认为M蛋白与病毒囊膜和核衣壳都有互相作用，但是没有发现它有广泛的疏水区域,最长的中性或疏水序列只有12个氨基酸之多，该序列开始于第55位残基。另有研究显示，M蛋白的序列与其他副粘病毒的M蛋白同源性较小，与Sendai病毒M蛋白只有17％同源性，与VSVM蛋白同源性也较小，只是在N端的111～127位残基处有17个残基同源性较高(64％)。

HN蛋白，NDV的HN基因长度为2031bp,约占基因组的13.5％，基因序列中含有一个长的开放阅读框架，因终止密码位置的差异,其翻译的多肽链长短不一。第一类HN的多肽链长616个Aa，为无活性的前体(HN0)，代表株有D26/76等，主要是弱毒株；第二类HN的多肽链长577个Aa，为有生物活性的蛋白，代表株有B1/47等；第三类HN也具有生物学活性，多肽链长571个Aa，代表株有AUS/32等。HN蛋白，即血凝素—神经氨酸酶，是NDV除F蛋白之外，另一种较大的糖蛋白。成熟的HN是一种四聚体寡聚蛋白，亚单位之间通过二硫键相联形成二聚体，两个二聚体非共价结合形成四聚体，HN蛋白具有血球凝集(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性。血凝素成分负责病毒吸附到易感细胞含唾液酸的受体，这是病毒感染细胞的关键第一步。NDV的感染可被HN单抗和单特异性HN糖蛋白抗血清所中和。神经氨酸酶则有分解膜结合或糖结合的唾液酸的能力,在病毒生命周期中起增加病毒粒子迁移性的作用,包括破坏细胞受体和从感染细胞表面释放病毒粒子。在HN蛋白中，与神经氨酸结合的区段为Asp-Arg-Lys-Ser-Cys-Ser，位于HN蛋白靠近中间的第234-329位氨基酸间，而血球凝集位点靠近C端。另有研究表明，所有NDV毒株NP、P、L蛋白分子结构基本一致，而F和HN蛋白氨基酸却存在较大差异，并且毒力差异越大，F和HN蛋白氨基酸差异也越明显。HN蛋白氨基酸序列中有六个潜在的糖基化位点，主要疏水区靠近N端，表明HN是以N端与病毒外膜相连的。多肽N端一侧的极性氨基酸亲水性分析表明缺乏裂解信号。糖基化作用对HN向膜转运无作用。但对神经氨酸酶的作用是必需的。

反义核酸(antisense nucleic acid)是一段与靶基因(mRNA或DNA)的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反义核酸通过碱基配对方式特异性的与病毒靶基因结合形成杂交分子，从而在复制、转录和翻译水平调节靶基因的表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA，进而使其功能丧失。

反义核酸包括反义RNA(antisense RNA)和反义DNA(antisense DNA)，具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力强等特点。反义核酸作为一种新的抗病毒、抗肿瘤药物，掀起了一场药理学领域的革命，即新的药物受体mRNA通过新受体结合方式(Watson-Crick杂交)、引发新的药物受体结合后反应：(1)RNase H介导的靶RNA的降解；(2)抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等。可以说反义寡核苷酸(ODNs)疗法比传统的药物治疗手段有更高的特异性。从二十世纪70年代末到现在，在这三十年的时间中，反义核酸药物已走出实验室，进入了实际临床应用。特别是第一个反义核酸药物Fomivirsen通过FDA批准上市后，人们对反义疗法尤为关注。

反义核酸作用原理基于碱基配对原则，可通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与对相关基因表达的调控。其作用方式可能有：①反义RNA与病毒mRNA结合形成互补双链阻断核糖体与病毒mRNA的结合，从而抑制了病毒mRNA翻译成蛋白质的过程。②反义DNA能与靶基因形成一种三链核酸(triple helix nucleic acid)，它通过作用于控制基因转录的转录子、增强子和启动子区，对基因的转录进行调控。③反义核酸与病毒mRNA的结合可阻挡mRNA向细胞质的运输。④反义核酸与病毒mRNA结合后使得mRNA更加易被核酸酶识别降解，从而大大缩短mRNA的半衰期。上述四种作用途径都可表现为对病毒基因表达的抑制或调控，且这种调控是高度特异性的。

反义核酸是通过碱基互补配对的原理来识别所打靶的基因，从理论来分析，研究人员以动物细胞为例，其染色体大约有几十亿对碱基，如果4个碱基(A、G、C和T)的数目大致相同，并在整个基因中随机分布，那么按照统计学原理，大于17个碱基的反义核酸与非靶基因杂交的可能性不大，所以长度超过17个碱基的反义核酸分子与靶基因的结合可以说是唯一的，从而使反义核酸具有高度的特异性。

研究表明，在细胞内部一个拷贝的基因会产生200-300条mRNA，翻译出10万个具有生物活性的蛋白质分子。传统药物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某结构域上的几个作用位点，事实上蛋白的结构是非常复杂的，且在生物体内，活性蛋白的空间结构又是千变万化的，以传统药物有限的几种作用位点来控制靶分子的动态的和整体的功能很难达到理想的效果，因而不难看出传统药物的局限性。由mRNA可翻译出几十到几百个蛋白，反义核酸在mRNA水平对靶基因直接进行调控，这个步骤相当于将传统药物作用放大了数十到数百倍，可见反义核酸的调控是极其经济合理的。

毒理学研究表明，反义核酸在体内具有很低的毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。与传统药物相比，反义核酸药物具有特异性强，效率高和毒副作用低等优点，在抑制肿瘤生长和抗病毒复制等方面显现出了良好的应用价值。目前已有多个药物进入美国和欧洲市场，另还有30多种反义核酸药物正在进行临床前期的研究或开发后进入了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期实验。

由于动物体内存在大量的核酸外切酶，反义核酸若不经过化学修饰，很快就被降解，失去活性。目前对反义核酸的化学修饰有很多方法，常见的有硫代修饰反义核酸及2’-甲氧基修饰反义核酸等。且目前硫代修饰药物的研究最为全面，它可有效抵抗核酸酶的降解，同时可促进核酸酶Rase H的活性，目前这种修饰方法已成功用于临床的反义核酸药物。但这些还只是第一代反义核酸的修饰方法，随着技术的发展与进步，新的修饰途径与方法被开发出来，使得反义核酸的研究进入了第二、三代，其中肽核酸的修饰最为引人关注。

肽核酸(peptidenucleic acids，PNAs)，是一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA类似物，其骨架的结构单元为N(2-氨基乙基)-甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架的氨基N上。尽管PNA在结构上相对寡核苷酸有了显著的改变，但PNA与互补核酸之间的结合仍遵循碱基互补配对原则，甚至比天然核苷酸具有更高的亲和性。PNA可序列特异性地靶向作用于DNA或RNA，为反义核酸的第二、三代产品。PNA与对应的DNA或RNA形成稳定的PNA-DNA或PNA-RNA结构，这种结构非常稳定，几乎不受环境因素变化的影响，如离子，pH值等。近年来，科研人员对最初开发出的PNA进一步优化，在结构方面作了很大改进(如骨架结构、在N-(2-氨基乙基)甘氨酸上连接手性和非手性的基团、碱基的类型等)，提高其生物学稳定性和利用度、靶结合特性以及药代动力学特性,并将PNA应用于诊断和治疗等方面。

壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖,具有来源丰富、无毒、易化学修饰性、生物相容性和可再生性等优越的功能性质和独特分子结构。壳聚糖作为可生物降解材料用于新型给药系统,通过改变给药途径可大大提高药物疗效,具有控制释放、增加靶向性、减少刺激和降低毒副作用以及提高疏水性药物通过细胞膜、增加药物稳定性等作用特点。

尽管有新城疫疫苗的广泛使用，但目前形势仍不乐观，临床上多呈非典型新城疫，其造成的经济损失巨大，同时疫苗的使用也极不规范，因而在家禽养殖业上加强防控NDV显得极为重要。同时NDV的毒力千差万别，毒力变化机制极为复杂，可以由强变弱，也能够由弱变强，变异趋势引起禽病专家高度关注。

因而开发预防和治疗NDV感染的新技术与手段显得尤为迫切，本发明率先将肽核酸技术与反义核酸技术结合起来，并应用于预防和治疗NDV病毒感染引发的相关疾病。本发明针对NDV(HN和M)两种主要蛋白基因的保守区域设计的病毒特异性的反义寡核苷酸序列，采用特定工艺合成、肽修饰及壳聚糖包装反义寡核苷酸，使其具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的疗效。

发明内容

本发明目的是，提出新城疫由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)感染引起的一种以呼吸道、消化道粘膜出血为典型病变的高度接触性、急性败血性禽类传染病。

本发明技术方案是，一种抗鸡新城疫病毒的肽核酸，其特征是针对鸡新城疫病毒NDV的HN和M蛋白的基因高度保守区域设计特异性强的两组反义核酸序列，能特异地与NDV的两个关键基因HN和M结合，且分布于NDV基因组的不同区域，以下为本发明所涉及的一系列序列或其组合：

第一组反义核酸序列HN：

HN-1：5’-CAUUACUAUUAAAAGUAAGACUG-3’

HN-2：5’-CAUGGUAUUGACCGUCAAAUCCU-3’

HN-3：5’-GGAUAUUUCUGCAAUACUAAGAC-3’

第二组反义核酸序列M：

M，M-1：5’-UCAAAGUACAGCCCGAUUGUCCU-3’

M-2：5’-ACAUCAAUAGUGACAUUGAGCGC-3’

M-3：5’-GGACAUAAGCCCGAUAUGCAGAA-3’。

在所述反义核酸序列中筛选出HN-1，HN-3，M-2和M-3为优选序列。

分别按质量比例1:(0.4～3):(0.4～3):(0.4～3)，对HN-1，HN-3、M-2和M-3进行配比，从而形成优选序列组。

所述的反义核酸制备成肽核酸；还可将将肽核酸溶液与咪唑丙烯酸壳聚糖(UAC)溶液等体积置于55℃水浴恒温30min,将两者在混合器上混合,偶联制备出UAC-PNA纳米分子微囊，并将其用于制备抗NDV新药的研究。

所述反义核酸制备成肽核酸，采用药用载体或赋形剂组合的药物。

有益效果，本发明采用特定工艺人工制成肽核酸片段，提高反义核酸的稳定性和透膜性。该序列与上述靶基因反向互补，根据碱基互补原理，反义核酸序列特异性地与NDV(HN和M)的对应的靶基因相结合，诱导核酶等分子对靶基因进行降解，阻断靶基因的转录与表达，抑制NDV在宿主体内复制与装配，以达到防控鸡新城疫病毒的目的。本发明还涉及含有该反义核酸序列的药物组合物，及其在动物药物上的用途。本发明无毒副作用，无耐药性，能特异性直接抑制NDV复制，抗病毒效果好，无药残等食品安全问题。定量PCR检测结果显示，HN特异肽核酸，HN-1和HN-3抑制率分别为:78％和83％。M特异反义肽核酸，M-2和M-3的抑制率分别为:73％和77％。但实际使用时混合序列的肽核酸更好。

具体实施方式

发明所设计的反义核酸序列

主要材料与试剂

病毒毒株

NDV毒株：NS-ND9株，由楠森兽医诊断技术研究中心实验室提供。

细胞株

CEF细胞：常规方法制备的10日龄的SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)。

反义核酸的合成

采用合成工艺进行反义核酸的人工合成。

反义核酸的合成为了获得良好的实际应用效果，采用肽骨架构建并引入反义核酸碱基以形成稳定理化性能和特定空间结构的肽核酸(PNA)

肽核酸的修饰

以壳聚糖为修饰物对肽核酸进行修饰。

肽核酸的剂型

1、采用控释制药工艺将经修饰过的肽核酸制备成结肠溶控释微囊制剂；

2、采用冷冻干燥制药工艺将经修饰过的肽核酸制备成注射用冻干粉针；

3、采用冻干后再制粒工艺将经修饰过的肽核酸制备成口服用水溶性颗粒。

药剂稳定性分析

高温：流通蒸汽高温105℃，20分钟灭菌不影响其生物活性。

极端温度：50℃存放6个月不影响其生物活性。

室温：存放24个月不影响其生物活性。

低温：-20℃存放48个月不影响其生物活性。

实施方案针对抗NDV的肽核酸体外抗病毒效果分析

从GenBank数据库检索出NDV的基因组，特别是近年来我国所报道的NDV毒株的序列，用生物学软件进行序列分析，综合考虑序列的保守性，G+C％含量，碱基分布特点，然后从中挑选出合适的区域设计反义核酸，最后所确定的针对病毒的HN和M基因的反义核酸序列如下。

HN

HN-1：5’-CAUUACUAUUAAAAGUAAGACUG-3’

HN-2：5’-CAUGGUAUUGACCGUCAAAUCCU-3’

HN-3：5’-GGAUAUUUCUGCAAUACUAAGAC-3’

M

M-1：5’-UCAAAGUACAGCCCGAUUGUCCU-3’

M-2：5’-ACAUCAAUAGUGACAUUGAGCGC-3’

M-3：5’-GGACAUAAGCCCGAUAUGCAGAA-3’

采用NDV病毒特异性定量RT-PCR检测肽核酸对病毒靶基因的抑制程度，同时运用病毒毒价测定实验检测抗病毒的滴度。

Day 1:

铺板：消化前期准备的CEF细胞，离心收集，细胞计数，用完全培养基(E-MEM+5％胎牛血清+青链霉素+glutamine)将细胞浓度调到2～5×10⁵个/ml，铺24孔板，于37℃二氧化碳培养箱中进行培养18-24小时。

Day 2:

显微镜观察细胞的密度，待细胞长满孔板面积的70～80％时，且细胞状态良好。吸去培养液，每孔加入300μl待筛选药物，每个药物10个孔。温育1小时后，加入100μl NDV(感染比为100TCID₅₀，NS-ND9半数组织培养感染量TCID₅₀为10^-4.5)，吸附2小时后，用营养液洗去未吸附的病毒后，再加入含3％FBS的E-MEM培养基，在37℃和5％CO₂环境中继续培养，感染后定时观察细胞病变。感染后48h，将感染细胞进行反复冻融以释放病毒，以此为样本进行病毒检测。实验过程中还设不加病毒和肽核酸的正常细胞对照组，加病毒、不加肽核酸阳性对照组和加肽核酸药物、不加病毒的阴性对照组。观察药物对细胞的保护效应，并对结果进行评判。

Real-time PCR定量检测

收集上述各处理组中的上清液，用病毒总RNA提取试剂盒提取病毒RNA。对获得的病毒RNA首先进行反转录成cDNA，然后运用针对的引物分别检测NDV处理组中的病毒含量。定量扩增后的结果，运用统计学软件计算出各处理组中病毒滴度，抑制效果以PNA组与空白对照组差异的倍数。

本发明参考Ge SH(2012年)等提供的引物，采用real-time PCR定量检测NDV。

NDV特异性检测引物

引物1:5'-AGTGATGTGCTCGGACCTTC-3'

引物2:5’-CCTGAGGAGAGGCATTTGCTA-3’

β-actin为内参

Actin-F：5’-TCCCTGTATGCCTCTGGTC-3’

Actin-R：5’-TCTCTCTCGGCTGTGGTGG-3’

反应体系(25μl)

反应条件：

反转录，42℃5min，95℃10sec；

PCR扩增，Cycle：40，95℃5sec，58℃60sec，72℃30sec。

反应结束后确认Real Time One Step RT-PCR的扩增曲线和融解曲线，以确保结果的特异性与可靠性。

针对NDV的肽核酸体外抗病毒结果

定量PCR检测结果显示，HN特异肽核酸，除HN-2效果不明显外，HN-1和HN-3抑制率分别为:78％和83％(附表1)。M特异反义肽核酸，除M-1效果不明显外，M-2和M-3的抑制率分别为:73％和77％(附表1)

附表1.反义核酸对体外CEF细胞抗NDV效果

药物组合处理

方法同上，针对前一步所筛选出的HN-1/3，M-2/3为优选序列。然后，在前面的这些实验基础上，对筛选出的有效抗病毒作用的药物进行组合使用，比较组合后的抗病毒效果与单药抗病毒效果之间的差异。CEF细胞感染NDV NS-ND9株后，分别加入针对HN或M的基因药物组合，同时设阳性对照和阴性对照及空白对照，用Real-time PCR方法进行检测，统计分析各用药组之间病毒抑制率，确定药物的组合，如附表2。

附表2.不同浓度的反义肽核酸对体外CEF细胞抗NDV效果

细胞毒性实验

1)以CEF细胞作检测对象，96孔板，每孔加100微升5000个细胞。药物浓度(0.02，0.1，0.5，1，5，10μm)，每个梯度设置3个重复孔，另设未处理细胞对照、无细胞培养基对照。

2)处理结束后，每孔每100μl培养基加入10μl MTT Stock，37℃培养箱内继续孵育4小时。也可更换100μl新鲜无血清培养基后再加MTT Stock。

3)吸去培养基，每孔加入100μl MTT溶解剂，保持各孔内液体体积一致。

4)在570nm测定OD吸光度并进行比较计算。注意：为准确考虑可在699nm处测定未还原的MTT本身的吸光度OD值，然后用OD₅₇₀减去OD₆₉₉。

5)结果判断：细胞增殖或毒性＝100％x(OD_实验－OD_本底)/(OD_对照－OD_本底)。

OD实验是接受处理细胞的OD值，OD对照是未处理细胞对照管OD值，OD本底是无细胞培养基对照OD值。处理后细胞增殖或毒性变化表示为未处理对照的百分数。

检测结果表明，针对NDV肽核酸无毒性。

实验动物感染及饲养

健康7日龄SPF雏鸡共200只(楠森兽医诊断中心实验动物养殖场司提供，经检测NDV阴性)随机分为5组。其中NDV感染组(试验组)40只，采用滴鼻攻毒方式，100μL/只；空白对照组(对照组)共40只，不作任何处理。三个药物剂量组(25ppm，50ppm，100ppm)，采用饮水给药方式，严格按组隔离饲养，各组的饲料与饮水均单独准备，不交叉。

NDV感染后，逐日详细观察至攻毒后7d，统计发病数和死亡数，计算免疫保护率。同时采集样品，提取总RNA，进行RT-PCR检测，分析各组中NDV的检出率，如附表3。

表3.抗NDV的肽核酸药物临床实验

最终优选的给药剂量为50～100ppm。

<110>张则斌

<120>一种抗鸡新城疫病毒的肽核酸及应用

<140>2016105671675

<141>2016-07-18

<210>HN-1：5’-CAUUACUAUUAAAAGUAAGACUG-3’

HN-3：5’-GGAUAUUUCUGCAAUACUAAGAC-3’

M-2：5’-ACAUCAAUAGUGACAUUGAGCGC-3’

M-3：5’-GGACAUAAGCCCGAUAUGCAGAA-3’。

<213>人工

Claims (3)

1.一种抗鸡新城疫病毒的肽核酸，其特征是针对鸡新城疫病毒NDV的HN和M蛋白的基因高度保守区域设计特异性强的两组反义核酸序列，能特异地与NDV的两个关键基因HN和M结合，且分布于NDV基因组的不同区域，以下反义核酸序列组合为抗鸡新城疫病毒的肽核酸：

第一组反义核酸序列HN：

HN -1：5’- CAUUACUAUUAAAAGUAAGACUG -3’

HN -3：5’- GGAUAUUUCUGCAAUACUAAGAC -3’

第二组反义核酸序列M：

M-2：5’- ACAUCAAUAGUGACAUUGAGCGC -3’

M-3：5’- GGACAUAAGCCCGAUAUGCAGAA -3’

分别按质量比例1: 0.4~3: 0.4~3: 0.4~3对HN-1、HN-3、 M-2和M-3进行配比，从而形成反义核酸序列组合。

2.如权利要求1所述的抗鸡新城疫病毒肽核酸的制备方法，其特征是将肽核酸溶液与咪唑丙烯酸壳聚糖UAC溶液等体积置于55℃水浴恒温30 min, 将两者在混合器上混合, 偶联制备出UAC- PNA纳米分子微囊，并将其用于制备抗鸡新城疫病毒NDV药物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是采用药用载体或赋形剂组合成药物。