CN102256611A - 使用含缺损基因组片段的病毒的抗病毒保护 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒学和病毒感染和动物疾病的预防和/或治疗，所述的动物包括鸟类和人。本发明涉及抗病毒治疗的领域。本发明进一步涉及在人类或者动物中以及在包括细胞和组织的人或者动物的组成部分中激发产生先天免疫和天然的干扰素的方法。本发明还涉及缺损干扰(DI)病毒的领域，所述的缺损干扰病毒包括克隆的D1病毒。

Description

使用含缺损基因组片段的病毒的抗病毒保护
发明领域
本发明涉及病毒学和动物的病毒感染和疾病的预防和/或治疗，所述的动物包括鸟类和人。本发明涉及抗病毒治疗的领域。本发明进一步涉及在人类或者动物中以及在包括细胞和组织在内的人类或者动物的组成部分中激发产生先天免疫和天然的干扰素的方法。本发明还涉及缺损干扰(DI)病毒的领域，所述的缺损干扰病毒包括克隆的DI病毒。
发明背景
正黏病毒科(Orthomyxoviridae)是感染脊椎动物的RNA病毒的科。该科包括引起流感的病毒。
流感是呼吸系统的病毒感染，其特征在于发热、咳嗽和严重的肌肉疼痛。有三个属的流感病毒，通过其核蛋白和基质蛋白的抗原差异识别：甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。
甲型和乙型流感病毒各个含有八个单链RNA(ssRNA)的片段。所述的病毒包括主要的外部病毒颗粒蛋白，血凝素(HA)和唾液酸苷酶(NA)。甲型流感病毒属包括16种HA的亚型以及9种NA的亚型，这很可能形成全部144种可能的组合。然而，乙型流感是单个的亚型，并与甲型流感具有显著性差异。
丙型流感病毒含有七个ssRNA片段，由于该病毒缺少独立的唾液酸苷酶基因(参见Lamb，R.和Krug，R.M.(1996)第45章；Orthomyxoviridae：Theviruses and their replication-Fields Virology，第3版，Raven Publishers，Philadelphia)。
副粘病毒科(Paramyxoviridae)的成员是在自然界中具有窄的特异性宿主范围的病毒，但是在培养的细胞中其显示出广的宿主范围。体内感染的特征包括内含体和合胞体的形成。副粘病毒感染一般地在呼吸道中开始并可以在该部位保持(例如人呼吸道合胞病毒，HRSV)或者可以传播到第二个部位(例如对于麻疹病毒(Mev)而言，淋巴和内皮组织)。一般来说，副粘病毒的感染被宿主免疫限制并消除。然而，病毒有时候可以在数周或数月的时间内在正常的，尤其地在免疫低下的个体中散发。
肺炎病毒科(Paramyxoviridae)包括副粘病毒属(Pneumovirus)。该属包括牛呼吸道合胞病毒(BRSV)以及人呼吸道合胞病毒(HRSV)，其中有命名为A和B的两种亚型，以及几个病毒株如HRSV株A2、HSRV株RS-S2和BRSV株Snook。也有鼠肺炎病毒(也称作小鼠肺炎病毒：PVM)。
抗病毒药物是一类专门用于治疗病毒感染的药物。经常将特异性抗病毒剂用于特异性病毒。多数可用的抗病毒剂设计用于处理HIV、疱疹病毒(熟知其引起唇疱疹和生殖器疱疹，但实际上其导致大范围的疾病)，乙型和丙型肝炎病毒(其可以引起肝癌)，以及甲型和乙型流感病毒。研究者当前试图将抗病毒剂的范围扩展到其他家族的病原体中。
例如金刚烷胺和金刚烷乙胺对所有的甲型流感病毒有效，而对乙型流感病毒无效。经常发现对于这些化合物有抗性的病毒。其他抗甲型和乙型流感病毒的抗病毒药物包括扎那米韦
Figure BDA0000067732130000021
和奥塞米韦
Figure BDA0000067732130000022
然而，这些治疗的有效性在一定程度上受到限制。必须在感染之后不久开始治疗并且需要每天给予两次。抗病毒的治疗仅能将症状的持续时间减短1到3天。在患有流感的患者中，发现了越来越多的对达菲有抗性的病毒。
疫苗用于产生免疫应答以攻击病毒。传统上疫苗由经削弱的或杀死的病原体组成。最近发明出了“亚单位”疫苗，其严格地由来自病原体的蛋白靶构成。疫苗激发免疫系统，而对宿主不产生严重的危害，并且当真正的病原体攻击受试者时，免疫系统迅速对其响应并阻碍其进入体内。
疫苗在与稳定的病毒导致的感染的斗争中可以是有效的，但是在治疗已经感染或者持续受感染的患者时作用有限。针对快速变异的病毒如流感的疫苗是有问题的。流感疫苗必须每年进行更新。例如针对HIV的疫苗仍然是难以捉摸的。
缺损干扰(DI)病毒历史悠久。其作为甲型流感病毒制备中的自体干扰原件，由研究它们的von Magnus在二十世纪四十年代晚期和二十世纪五十年代早期(例如冯·马格努斯(von Magnus)，P(1947)Ark.Kemi.Mineral.Geol，24b：1)发现。多年来这些干扰元件以他命名。随后，当意识到这些元件几乎在病毒中普遍都发现时，其被称作DI病毒(参见例如Huang和Baltimore(1970)Nature 226：325-327)。在二十世纪七十年代，对DI病毒的兴趣达到了顶点，但是由于对其在体内的抗病毒活性过高的期待，随后对其兴趣减弱。
全部的甲型流感病毒具有复制结构，该复制结构允许双重感染的细胞中的基因组片段进行交换(重新组合)，从而赋予这些病毒巨大的遗传可塑性。该现象导致了1957和1968年的流感病毒大流行。除了正常的复制过程外，在复制中发生的错误引起400-500个核苷酸(nt)的小RNA缺失80％左右的模板的核心序列，其看起来产生自聚合酶复制模板的起始部分，从模板上脱离并随后再次结合并拷贝其他的末端。这些小RNA保留了末端的复制和包装信号。它们的小的尺寸意味着与全长的RNA片段相比，可以在单位时间内制备更多的拷贝。基因组RNA的包装表现为有组织的过程，从而毒粒正好含有8个片段中每一个的一个拷贝。毒粒在缺损的和全长的RNA之间表现出没有区别，所以当缺损的RNA过量时，它们比被它们取代的完整的基因组片段更频繁地被包装。含有缺失的基因组片段的颗粒不能正常地合成该RNA所编码的病毒蛋白质，并且是非感染性的，尽管当细胞由甲型流感病毒感染时其可以反式复制。将缺损的RNA掺入到毒粒中导致所产生的有感染性的病毒的量减少。因此携带了缺失的基因组的毒粒已知是干扰或者缺损干扰(DI)病毒。
正黏病毒科的病毒由于在一个或者多个基因组片段中的内部缺失(75～80％的核苷酸)，自发地产生缺损的RNA片段。因此DI病毒的基因组是产生它的感染性病毒的基因组缺失的形式；并且与其他类型的缺损病毒核苷酸分子相比其具有一些独特的特征(参见Dimmock.N.J.(1996)“Antiviralactivity of defective interfering influenza virus in vivo”-Viral and other infectionsof the human respiratory tract；S.Myint and D.Taylor-Robinson(Eds.)，Chapman& Hall)。
与有活性的，即活的或者感染性的病毒相比，DI病毒尽管能够感染细胞，但仅当其基因组存在于已经被完整基因组的病毒(有时候称作“辅助病毒”)感染的细胞中时才进行复制和增殖。DI流感病毒壳体化为在尺寸和蛋白质组成上通常与感染性的辅助病毒颗粒不可区分的病毒颗粒。
在重新出现之后，DI基因组迅速扩增，其浓度与感染性病毒的基因组的浓度相关，从而在几个感染的周期中(或几代中)，种群中的DI病毒比感染性的辅助病毒更多。
DI病毒具有在细胞内干扰感染性的辅助病毒的能力，从而其能够特异性地抑制感染性的辅助病毒的增殖。
体内的动物实验显示了自发产生的DI甲型流感病毒(A/equine/Newmarket/7339/79(H3N8))能够以足够的量保护小时免受致命的甲型流感病毒的攻击，所述的甲型流感病毒具有同源病毒(EQV)或者异源的亚型A/WSN(H1N1)或者A/PR/8/34(H1N1)。在这些研究中DI病毒制剂经UV处理，从而使存在的任意活的辅助病毒失去感染性。UV辐射的剂量不使DI病毒的干扰或者保护活性失活。一次的给予显示出提供长达约5天的预防。然而，这些DI甲型流感病毒制剂是异源的，并包括来自不同基因组片段的多个不明确的缺损RNA序列(参见Noble和Dimmock(1994)Journalof General Virology 75：3485-3491)。
在鸡胚蛋中生长的DI甲型流感病毒A/WSN(H1N1)保护小鼠免受A/WSN(H1N1)的致命的攻击。鸡蛋中生长的DI病毒RNA物种和从存活的小鼠肺中提取的DI病毒RNA的比较显示，存在至少5种推断的DI RNA序列。DI病毒的这五种RNA物种中的每一种都具有内部缺失(参见Noble &Dimmock(1995)Virology 210：9-19)。这些RNA分子中的四个的3’和5’末端看上去是完整的。
Duhaut & Dimmock(2000，Virology 275：278-285)通过将EQV的缺损的片段1的RNA置于质粒中人类RNA聚合酶I启动子(PolI)的控制下，对其进行了修饰。这些质粒中的每一个编码约400个核苷酸的RNA，但是由于内部缺失的精确位置，保留了不同长度的5’和3’末端序列。使用每个质粒与编码流感病毒PB1、PB2、PA和NP蛋白质的质粒转染Vero细胞，并将所述的细胞随后使用三种不同的辅助病毒亚型中的一种进行感染，所述的三种不同的辅助病毒亚型包括亲代的(H3N8)或者H2N2或者H1N1亚型。在细胞培养中进行系列的传代。发现在DI病毒RNA的5’末端至少150个核苷酸对于在体外进行可靠的传代而言是必要的，所述的传代在与特定的辅助病毒一起使用的各种细胞系中进行。
还不能从实验上阐明非克隆的DI甲型流感病毒减少感染性病毒的产率，抑制由病毒诱导的细胞病理学，以及保护动物不遭受临床上的疾病的过程，由于DI甲型流感病毒的大多数种群均含有多种不同的缺损RNA序列，所述的多种不同的缺损RNA序列产生自不同的基因组片段以及具有多种中央缺失。因此，该缺损病毒的该非克隆种群的RNA含量不能有效地进行复制，同时还无法分析RNA序列和抗病毒活性之间的关系。
Duhaut & Dimmock(2002，J.Gen.Virol.83：403-411)证明了得自质粒系统的DI甲型流感病毒RNA显示出在细胞培养中真实地呈现。一种质粒(POLI-317)产生了DI病毒RNA，所述的DI病毒RNA在体外在辅助病毒的存在下稳定复制，并强烈地抑制在该系统中辅助病毒的产生。
Duhaut & Dimmock(2003，Journal of Virological Methods 108：75-82)描述了给定的(例如分子克隆的)DI甲型流感病毒的制备，所述的病毒完全地产生自用于在培养中感染宿主细胞的质粒。所使用的质粒编码所述的DI RNA(H3N8或者H7N7)以及感染性的流感病毒(A/WSN，H1N1)。以这种方式产生的DI甲型流感病毒在鸡胚蛋中传代一次，并随后在辅助病毒(H1N1)的存在下接种小鼠。克隆的DI病毒在小鼠的肺中完整地繁殖。也测试了克隆的DI病毒(在没有感染性的辅助病毒时)，在小鼠中针对致命的(H1N1)的攻击的任意保护效果。观察到了一些非常弱的并且短暂存在的预防效果，但是这只是推迟了小鼠的临床症状和死亡的发生。
Noble等人(2004，Vaccine 22：3018-3025)报道了使用自然存在的(也即异源的和不明确的)DI甲型流感病毒制剂(EQV H3N8)对小鼠的体内研究。发现向小鼠给予此DI病毒制剂产生一段时间的预防性保护，并且同时将其他致命的感染转化为无毒力的和免疫的感染。
Dimmock & Marriott(2006，Journal of General Virology 87：1259-1265)描述了不正常的现象，其中异源及未确定的DI甲型流感病毒制剂牢固地保护小鼠免于发生由A/PR/8/34(H1N1)和A/WSN/40(H1N1)病毒引起的致命疾病，并且仅最低限度保护小鼠免于发生A/Japan/305/57(A/Jap H2H2)引起的疾病。发现与A/PR8相比，A/Jap需要300倍以上的感染单位才导致小鼠临床疾病。改变并测试了DI病毒和攻击病毒的比例。得到的结论是，DI病毒的效力取决于攻击病毒的感染剂量，而不是其导致疾病的剂量。
Mann等人(2006，Vaccine 24，4290-4296)测试了异源的和不明确的DIA/EQV RNA，其是在雪雕中由A/PR8再活化的。DI甲型流感病毒施用两剂量，随后使用感染性的A/Sydney 5/97(H3N2)进行攻击。经DI病毒处理的雪雕仅显示出偶尔的和轻度的临床症状，与此相比对照的动物发生严重疾病。
US2006/0057116A1(Kawaoka和Neumann)描述了质粒和在任何辅助病毒都不存在下转染和培养细胞以在体外产生重组的甲型流感病毒的方法。具体地，可以在受感染的细胞系中，完全通过甲型流感病毒的克隆的cDNA制备甲型流感病毒。可以将突变掺入到任意的基因片段中。
WO2006/051069(Solvay Pharmaceuticals和Erasmus University)中公开了有条件地缺损的流感病毒颗粒及制备其的方法。从转染的细胞的起始点无法产生用作疫苗的大量的缺损流感病毒，本说明书中教导了替代的方法。该方法涉及由质粒转染的细胞，所述的质粒编码流感病毒的七个RNA片段但是缺少表达聚合酶蛋白质的第八个片段。该细胞包括第二个表达质粒，所述的质粒携带缺失聚合酶基因的序列。当表达时，该经转染的细胞产生了“有条件地”缺损的病毒颗粒，所述的缺损病毒颗粒仅能够在表达缺损的基因组中不存在的聚合酶蛋白质基因的细胞系中复制。所述的缺损流感病毒颗粒仅能够在适合的，即使不是补全性的宿主动物或者细胞中复制一次。预期将有条件地缺损的病毒颗粒用作疫苗或者用作基因递送的目的，并且因此有利的是，病毒颗粒制剂在正常细胞中不能复制并且不含野生型或者辅助病毒。
尽管描述了用于制备经克隆的甲型流感病毒(其结果是在小鼠中仅有一次微弱的保护)的原型系统(参见Duhaut & Dimmock，2003 supra)，但该原型系统并未提供用于制备对于进行进一步实验室研究而言必要量的克隆的DI病毒的实际途径，更不用说提供在常规的情况下，为了进行动物和人类的临床试验或者在常规的、流行性的或者大流行的情况下用于预防和/或治疗所需的克隆的DI病毒的量。
Huang，A.S.& Baltimore，D.(1970)″Defective viral particles and viraldisease processes″Nature(Lond)226，325-327.本综述文章在第325页描述了对于裂谷热病毒(Rift Valley fever virus)、水疱性口炎病毒、鸡瘟病毒、猿猴病毒40、多瘤病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、仙台病毒、猿猴病毒5和脊髓灰质炎病毒，如何通过使用高的多样性(或者未稀释的传代病毒)感染细胞或者动物组织来实现DI颗粒的合成。
Holland，J.J.(1990)″Defective viral genomes″Virology，第二版.第151-165页.由B.N.Fields & D.M.Knipe编辑.New York：Raven Press.在这篇综述文章中，第155页描述了细胞培养物(或者鸡蛋或者动物)中，一系列的未稀释病毒的传代对于任意病毒的DI颗粒的产生而言如何仍然是选择的方法。
Nayak，D.P.，Chambers，T.M.& Akkina，R.K.(1985)″Defective-interfering(DI)RNAs of influenza viruses：origin，structure，expression and interference″Current Topics in Microbiology and Immunologyl14，103-151是证实了通过按顺序的独立非稀释的病毒传代，生产DI病毒的综述文章。
WO2007/135420(University of Warwick)描述了用于生产前文中不可得到的，足量的经克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述的病毒预防或者治疗人类和动物，包括鸟类的甲型流感病毒感染中用于实验或者临床使用。还描述了经克隆的甲型流感病毒作为甲型流感病毒感染的预防性或者治疗性处理的医学用途。经鉴定所述的DI甲型流感病毒对相同的或者不同株的感染性甲型流感病毒具有抗病毒效果。
针对人类和动物中的病毒感染的范围治疗，尤其是针对没有可用的现有的抗病毒治疗的病毒，针对显示出快速的变异的病毒，或者针对可能对现有的抗病毒药物有抗性的病毒，以及针对新发现的或者欠缺表征的病毒，仍然需要提供抗病毒。
本发明人做出了意想不到的发现，即经克隆的人类DI甲型流感病毒保护免受不同的(异源的)病毒的感染。更具体地，本发明人发现了人类的DI甲型流感病毒保护小鼠免受鼠肺炎病毒(PVM)的致命攻击。本发明人还出人意料地发现了经克隆的DI甲型流感病毒能够保护小鼠免受感染性乙型流感病毒的致命攻击。这是未预料到的发现，由于尽管甲型和乙型流感病毒属于同一病毒科的不同的属，但其在遗传学上不相互作用。
本发明人做出了进一步的，预料不到的发现，也就是施用给小鼠的经克隆的DI甲型流感病毒导致天然干扰素产生的激发。不希望受到任意具体理论的约束，本发明人相信经克隆的DI病毒可以针对异型病毒发挥其抗病毒效果的机制是通过在经克隆的DI病毒的施用部位激发局部天然干扰素的产生。
相应地，在一个方面本发明提供经克隆的缺损干扰(DI)病毒，所述的病毒用于预防或者治疗个体中的病毒感染或者疾病，其中所述的感染或者疾病由与所述DI病毒来源的病毒不同的病毒引起。
经克隆的DI病毒包括具有单链RNA的那些病毒，以及为双链RNA、单链DNA或者双链DNA的那些病毒。
在另一个方面，本发明提供经克隆的缺损干扰(DI)病毒，所述的病毒用于预防或者治疗由甲型流感之外的病毒引起的感染或疾病。
与所述DI病毒来源的病毒不同的病毒优选地是其他病毒的野生型株。例如如果DI病毒是DI甲型流感病毒，那么所述的不同病毒是人类呼吸道合胞体病毒(HRSV)。
用于本发明中的经克隆的DI病毒材料优选地为从DNA或者RNA核酸序列的意义上来说基本上单一的。通过序列％一致性测定，可以提供单一性可以大于95-99.9％和100％遗传单一性的百分比。
预防的(预防性的)和治疗的处理(即当临床上的症状明显时感染之后)在本发明的范围内是可能的。当有疑似病毒感染仍然是轻度症状时，可以给予治疗处理。
根据本发明，所预防或者治疗的感染或者疾病可以是由呼吸道或者全身性病毒引起的疾病。
该感染或者疾病可以由副粘病毒科的病毒引起，例如肺炎病毒属，例如人类呼吸道合胞病毒(HRSV)。
所述的感染或者疾病可以由偏肺炎病毒属(Metapneumovirus)引起，例如人类偏肺炎病毒(HMPV)。
在本发明的其他方面，所述的感染或者疾病可以由正粘病毒科的病毒引起，例如乙型流感病毒或者丙型流感病毒。
在本发明的又一个方面，所述的感染或者疾病可以由肝炎病毒或者肝病毒科的病毒引起，例如乙型肝炎病毒(HBV)。
所述的感染或者疾病可以由黄病毒科的病毒引起，例如丙型肝炎病毒属。该病毒可以为丙型肝炎病毒(HCV)。
在本发明的再个方面，所述的感染或者疾病可以由乳头瘤病毒科，如乳头瘤病毒属引起。
导致所述感染或者疾病的病毒可以是针对人类或者其他的动物(包括鸟类、爬行类或者两栖类)有感染性的病毒。
根据本发明，经克隆的DI病毒可以通过单个的人或者动物的鼻子和/或通过肺给予。可选地，所述的经克隆的DI病毒可以经肠道外给予，例如经皮下、肌内、静脉或者腹腔注射给予。
本发明还提供了激发先天免疫和细胞、组织、器官或者人类或者动物中产生天然干扰素的方法，所述的方法包括将干扰素诱导剂量的缺损干扰(DI)病毒给予细胞、组织、器官、人类或者动物，前提是当DI给予细胞培养物中的细胞时，所述的DI病毒不是具有“返折(copyback)”或者“快速复性(snapback)”的RNA结构的RNA病毒。
在本发明的该种方法中，当将DI病毒给予细胞培养物中的细胞时，DI干扰病毒优选地不是DI水泡性口炎病毒或者DI仙台病毒。
本领域的技术人员使用已知的分析，容易地测量天然干扰素产生的激发。所产生的干扰素可以是任意的天然可诱导I型干扰素：也就是I型干扰素(IFN)，并主要地为IFN-αt和IFN-β(Theofilopoulos，A.N.，Baccala，R.，Beutler，B.and Kono，D.H.2005 Type I interferons(α/β)in immunity andautoimmunity.Annual Review of Immunology 23，307-336)。
根据本发明在激发先天免疫和天然干扰素产生中，所述的DI病毒优选地为经克隆的DI病毒。更具体地天然干扰素的激发可以采取宿主具有复制能力的的辅助病毒。在进一步的这样的实施方案中，经克隆的DI病毒与辅助病毒的关系上，可以是不同的毒株或者可以是异型的。
当激发干扰素产生时，则需要在期待的抗病毒效果之前给予DI病毒。这是由于在给予和身体产生反应从而使细胞产生干扰素之间有延迟。通常地观察到24小时的延迟，以及因此优选地在期待水平的干扰素生产之前的约24小时，或者更长时间之前给予。
本发明因此也包括在个人或者动物中，预防或者处理病毒性感染的方法，所述的方法包括将诱导干扰素的量的缺损干扰(DI)病毒给予个体。
在本发明的这个方面，DI病毒优选地可以通过个体的鼻子和/或通过肺给予，尽管由肠道外给予，例如经皮下、肌内、静脉或者腹腔注射给予是可能的。
根据本发明前述的方法，DI病毒可以不直接地给予个体，但是另外地或者可选地，可以从人类或者动物体中分离出细胞、组织或者器官，即离体和/或在体外，使用DI病毒处理，从而诱导干扰素的产生，并随后将其重新引入或者移植到同一个或者其他的受体个体，或者相同的或类似的血型或组织类型的个体内。
根据本发明前文所限定的所有方面，所述的DI病毒可以是DI流感病毒，优选地是DI甲型流感病毒，或者DI塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)。
本发明人因此提供基于缺损干扰病毒的抗病毒药以及抗病毒治疗，所述的缺损干扰病毒具有针对异形(即不同的)病毒在任意宿主中的感染提供保护的能力。例如，在治疗肺的病毒感染时，抗病毒药物优选地通过鼻内给药递送到呼吸道的细胞。其他的给药途径包括经粘膜、肺和口腔。其他的途径包括通过口服的肠胃道给药。
经克隆的DI病毒的优点在于，可以治疗已知或者怀疑由任意病毒感染的个体的感染，甚至当感染的症状还未观察到或者尚未诊断的感染。当怀疑有感染时，可以立刻向所述的个体给予经克隆的DI病毒药物。也可以在与已知或者怀疑由所述的病毒感染的同种或者不同种的个体接触之后，立即处理个体。有利地，据信保护不涉及适应性免疫应答，并且其由单独给予经克隆的DI病毒而不需要给予感染性的辅助病毒来实现。因此不需要传统的疫苗(其依靠B细胞和T细胞导向的免疫应答从而产生保护性的效果)一样在感染之前像单独给予经克隆的DI病毒，尽管24小时前用DI病毒进行预处理是有利的。
依照本发明的药物能以预防的形式给予个体。
所述的药物所给予的个体可以是动物或者人类，优选地其中动物选自猪、马、狗、猫或者鸟(野生的或者驯养的)。在鸟类的情况下，无论是野生的或者驯养的，所述的药物可以方便地通过口服给药，例如将药物掺入到饮用水或者食物中。在鸟类物种的情况下，优选的经驯养的物种包括例如鸭、鹅、火鸡或者母鸡，例如肉鸡。
与本发明一致的剂量方案可以由药物的单次给药组成。药物中的经克隆的DI病毒的量可以用定量RT-PCR进行测定。采用了对于缺失的RNA或者DNA片段有特异性的探针和/或引物。
在药物中，经克隆的DI病毒的量可以为(每剂)1ng-10μg病毒的量级(按照总病毒蛋白质进行测定)。DI病毒的量可以在0.05μg-10μg的范围内。优选的实施方案包括0.01-0.1μg、0.01-1μg或者0.01-10μg的病毒蛋白，更优选地10ng、100ng、1μg或者10μg的病毒蛋白。
当DI甲型流感病毒用作与本发明一致的药物的基础时，药物中所述的经克隆的DI病毒的量可以在每剂0.05-5000HAU的范围内，优选地在选自0.1-100、0.5-50或者1-10HAU的范围内。其他可能的范围包括0.05-10HAU、0.1-50HAU、1-100HAU和1-5000HAU。
经克隆的DI病毒的量，无论是以每剂中HAU还是μg病毒蛋白进行测量，都可以根据受试者进行变化。例如，马可以需要4X人类的剂量，而鸟可以需要1/10的人类的剂量。
在经克隆的DI病毒中的缺损核酸与其来源的基因组片段相比，可以具有至少一处缺失，尽管片段1中可以发生多个部分的缺失。所述的缺失可以由多个连续的核苷酸隔开。与其来源的基因组片段相比，所述的缺损核苷酸的序列可以包括一处或者多处的核苷酸的改变。这些可以包括不同的置换核苷酸，缺失的核苷酸或者插入的额外的核苷酸。
包括缺失的基因组片段的5’或者3’末端优选地是完整的。在更优选的实施方案中，所述的片段是片段1。缺失的效果是，毒粒RNA片段的5’端具有至少150、200或者220个核苷酸。优选地，所述片段的5’末端具有150-500个，更优选地150-250，或者150-220范围内的多个核苷酸。
就3’末端而言，剩余的(未缺失的)部分包括至少20、50、100、200、300、400或者500个核苷酸。片段1的3’末端可以具有20-600、30-550、40-500、50-450、60-400或者75-250的范围内的多个(未缺失的)核苷酸。
所述的片段缺失可以为至少50％的核苷酸，优选地至少75％的核苷酸，更优选地至少80％的核苷酸。为了在RNA片段中进行有效的缺失，可以缺失至少一个核苷酸。在更优选的实施方案中，所述的缺失可以由至少3、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、3000或者5000个的核苷酸组成，优选地为连续的核苷酸。在同一RNA片段中，多个缺失是可能的。
本发明因此提供药物组合物，所述的药物组合物包括前文所述的经克隆的DI病毒。
本发明的适用于给予的药物组合物包括无菌的水或者非水溶液、悬浮液和乳液中的DI病毒。所述的组合物可以进一步地包括如现有技术中已知的助剂或者赋形剂，参见例如Berkow等人，The Merck Manual，16th editionMerck & Co.，Rahman，NJ(1992)，Avery′s Drug Treatment：Principles andPractice of Clinical Pharmacology and Therapeutics，第三版，ADIS Press，Ltd.，Williams and Wilkins，Baltimore，MD(1987)& Osol(ed.)，Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1324-1341(1980)。本发明的组合物优选地以单个剂量(单位剂量)的形式存在。
用于口服给药的液体剂型通常可以包括含有所述液体剂型的脂质体的溶液。适合悬浮脂质体的形式包括乳剂、悬浮液、溶液、糖浆和含有惰性稀释剂的酏剂，所述的惰性稀释剂是本领域中通常使用的，如经纯化的水。与惰性稀释剂一样，典型的组合物还可以包括佐剂、润湿剂、乳化和悬浮剂或者甜味、调味或者芳香剂。
当本发明的组合物或者药物用于给予个体时，其可以进一步地包括盐、缓冲液或者其他的物质，所述的物质旨在改进组合物的效力。
优选的组合物或者药物用于黏膜递送。在可采取的不同的黏膜递送选择中，鼻内的途径是最富操作性的，由于其以相对简单的已经大量生产的设备容易实现。本发明的组合物因此优选地改造为和/或包装用于鼻内给药，例如通过鼻喷雾剂，滴鼻剂，凝胶或者粉末(参见Almeida & Alpar(1996)J.DrugTargeting 3：455-467和Agarwal & Mishra(1999)Indian J.Exp.Biol.37：6-16)。
其他可能用于黏膜递送的途径包括口腔、胃内、肺和肠途径。本发明的组合物可以改造为和/或包装用于黏膜给药(例如，参见Walker(1994)Vaccine12：387-400，Clements(1997)Nature Biotech.15：622-623 & McGhee等人.(1992)Vaccine 10：75-88)对于口腔给药，可以提供片剂或者胶囊(可选地为肠溶包被的)。
可选地，液体、转基因移植材料、滴剂、吸入剂、气雾剂、肠溶衣、栓剂、阴道栓剂等(参见Michetti(1998)J.Gastroenterol.[Suppl X]：66-68以及Vaccine design：the subunit and adjuvant approach的第17章，eds.Powell &Newman，Plenum Press 1995)。
本发明的组合物可以通过肠胃外的途径给药。所述的肠胃外的途径包括静脉、肌内、皮下、真皮内、上皮(epicutantous)/透皮(transdermal)或者腹腔给药。可以使用不同类型的肠胃外剂型，包括溶液、胶束分散剂、乳剂、包合复合物(环糊精)、脂质体和悬浮液。
无论使用何种递送途径，本发明的组合物或者药物优选地为单位剂型。可以按常规确立有效的剂量。例如，用于注射或者鼻内使用的组合物的典型人类剂量为0.1-0.5ml体积之间，例如两剂100μl喷雾剂，每鼻孔一剂。
本发明的组合物优选地是无菌的，并且优选地不是致热的。在更高的浓度下，DI甲型流感病毒组合物可以是致热的或者显示出残留的致热活性。所述的组合物优选地是经缓冲的，例如缓冲到pH6.5到pH8之间，一般地在pH7左右。
WO2006/041819(Medimmune)中描述了经鼻给药的有利的形式。
本发明还包括将感染受试者的强毒病毒转化为无毒病毒感染的方法，其包括向受试者给予有效量的经克隆的DI病毒。
克隆的DI病毒颗粒可以在感染之前、与感染同时或者在感染之后施用。
本发明还包括将感染受试者的强毒病毒转化为无毒病毒感染的方法，所述的无毒病毒感染针对感染病毒接种受试者，所述方法包括向受试者施用克隆的DI甲型流感病毒。
所述的受试者可以，或者可以被怀疑由给定的病毒感染。在实际上的，或者甚至怀疑的感染的情况下，可以在个体被感染，或者怀疑被感染之后尽快地，在48小时之内，优选地在24小时之内给予经克隆的DI病毒。类似地，如果个体短暂地暴露于感染性的病毒中，不管是从受感染的人类、动物还是鸟类，可以向所述的个体给予经克隆的DI病毒作为预防性措施。必须处理已知或者怀疑受到致病性病毒感染的动物或鸟类尸体或者处理人类尸体的人，尤其是在流行或者大流行的情况下，可以给予本发明的所述经克隆的DI病毒。这样的人可以在暴露于病毒的风险之前即刻给予本发明的药物作为预防基础。与疫苗的使用不同，没有必要知道感染性的病毒的特性。
在前文中描述的本发明的各个方法中，所述的经克隆的DI病毒足量地给予。辅助病毒可以是该病毒相对应的任意毒株，无论是来自人或者其他的动物，包括鸟类。
在感染后长达24小时以及此后，经克隆的DI病毒也提供保护。因此可以对抗实际的感染。因此可以将其用作被感染的个体的家庭或其他直接接触的处理使用。
经克隆的DI病毒容易给予。可以简单地将含有所述的DI病毒的一滴盐水喷入鼻中。已经用于一些疫苗的气雾剂给药提供了另一种简单的给药途径。所述的经克隆的DI病毒为驯养的动物提供了有用的治疗，例如通过饮用水。
本发明在此参考实施例及附图进行详述，其中：
图1是凝胶的照片，其显示了鸡蛋的尿囊液中含有的224 RNA的RT-PCR，所述的鸡蛋接种了表1和2中所描述的甲型流感病毒DI 244/PR8和感染性乙型流感病毒的混合物。M＝DNA分子量标准；A＝1/10DI+B/Lee；B＝1/100DI+B/Lee；C＝1/1000DI+B/Lee；D＝1/10,000DI+B/Lee；E＝B/Lee；F＝1/10DI；G＝盐水。
图2A是数据的绘图，其显示了不同剂量的PVM对于C3H/He-mg小鼠的作用(每组4只小鼠)。
图2B是数据的绘图，其显示了不同剂量的PVM对于BALB/c小鼠的作用(每组4只小鼠)。
图3是数据的绘图，其显示了未经稀释的DI甲型流感病毒针对PVM对C3H/He-mg小鼠攻击的保护作用。
图4是数据的绘图，其显示了经稀释的DI甲型流感病毒针对PVM对C3H/He-mg小鼠攻击的保护作用。
图5是数据的绘图，其显示了DI甲型流感病毒介导的针对PVM对C3H/He-mg小鼠的攻击的保护作用的持续时间。在使用DI甲型流感病毒处理之后6天，攻击小鼠。
图6是数据的绘图，其显示了针对PVM对C3H/He-mg小鼠的攻击，提供保护的DI甲型流感病毒的水平。
图7是来自另一个试验的进一步数据的绘图，其显示了针对PVM对C3H/He-mg小鼠的攻击，提供保护的DI甲型流感病毒的水平。
图8是来自另一个试验的进一步的数据的绘图，其显示了所提供的保护的持续时间。如图所示，在使用DI甲型流感病毒处理小鼠之后第1或者3天，用PVM攻击小鼠。
图9是数据的绘图，其显示了在PVM攻击之前或者之后使用DI甲型流感病毒进行处理而引起的小鼠的组体重随时间如何变化。
图10显示了在使用纯的DI甲型流感病毒进行小鼠鼻内接种后的第1天，基于肺(L)和血清(S)样品进行的干扰素的检测结果。在感染之后第6天读出中性红染色的细胞的OD。“病毒”指在检测中塞姆利基森林病毒的存在。
图11显示了在图10和表10使用的同一个微滴定板上，对照的β干扰素的滴定曲线。
图12显示了在产生表15中的数值的同样的滴定板上，对照的β干扰素的测量值的标准曲线。
本发明人进行了试验，并出乎意料地发现了一些甲型流感的DI病毒为小鼠提供一定程度的免受乙型流感病毒感染的保护。发现针对乙型流感病毒测试的DI病毒的效力的量级是：
244/PR8＝220/Vic＞220/PR8
即244/PR8和220/Vic比220/PR8更有效。
然而，针对甲型流感病毒(参见下表1和2)测试的DI病毒的效力的量级是：
244/PR8＞220/Vic＝317/Vic＞220/PR8
即244/PR8和220/Vic针对甲型和乙型流感病毒是最有效的，并且220/PR8是效果最差的。使用317/Vic的测试未完成。
然而，如果在感染乙型流感病毒之前24小时给予DI甲型流感病毒，则发现针对乙型流感病毒的DI病毒的效力的量级是：
244/PR8＞220/PR8
即，在这些情况下，244/PR8再一次地是最有效的并且220/PR8是效果最差的。
Figure BDA0000067732130000161
表2.220/Vic、220/PR8和317/Vic DI甲型流感病毒针对A/WSN的保护的总结：标出了最低的有效剂量。
Figure BDA0000067732130000171
Nd未进行。
发现针对乙型流感的保护与针对甲型流感感染的保护相比，需要100倍以上的DI甲型流感病毒(参见表6)。乙型流感病毒与所使用的甲型流感病毒相比，具有类似的ID50∶LD50，并且因此DI甲型流感病毒的低效力看起来不是由于受到过高剂量的乙型流感病毒的攻击。
甲型流感DI RNA不太可能通过小的DI RNA的更快速复制来阻止(swamp)乙型流感感染，由于不知道流感和乙型病毒在遗传学上相互作用。例如全部的制备甲型流感X乙型流感的杂交病毒(再造病毒)的尝试都失败了。除此之外本发明人发现乙型流感不支持甲型流感DI RNA 244的复制。
还发现了有活性的DI病毒通过在呼吸道中激发α/β干扰素，保护小鼠免受B/Lee攻击，并且本发明人发现了：
(a)在小鼠中DI甲型流感病毒保护小鼠免受异源的小鼠肺炎病毒(PVM)的感染。
(b)按照在体外的抗病毒生物分析所证实的，经鼻内给予的DI甲型流感(没有感染性的辅助病毒以及没有攻击的病毒)在小鼠的肺中激发干扰素。
1/100剂量的DI甲型流感保护小鼠免受B/Lee的攻击也保护小鼠免受甲型流感攻击。这说明干扰素α/β对于针对甲型流感的保护是非必要的——这一点通过DI甲型病毒保护缺乏干扰素α/β活性的突变小鼠(由于其缺少干扰素α/β受体)免受甲型流感攻击这一发现所证实。
在保护小鼠免受PVM攻击中，在病毒攻击之前24小时，使用DI甲型流感病毒接种小鼠。如果在病毒攻击之前24小时接种，DI甲型流感病毒针对乙型流感感染也同样地有效。然而，如果将DI甲型流感病毒和乙型流感病毒同时接种，需要10倍以上浓度的DI甲型流感病毒来产生同等程度的保护。
已知一些其他DI病毒(水泡性口炎病毒、棒状病毒以及仙台病毒，副粘病毒)在体外激发干扰素α/β。然而，这些都是“快速复性(snapback)”的RNA——即单链的RNA，其3’和5’两部分是互补的(参见Marcus，P.I.&Sekellick，M.J.(1977)Nature(Lond)266，815-819；Sekellick，M.J.& Marcus，P.I.(1982)Virol 117，280-285；Marcus，P.I.& Gaccione，C.(1989)Virol 171，630-633；Strahle，L.，Garcin，D.& Kolakofsky，D.(2006)Virol 351，101-111)。
甲型流感DI病毒之外的一系列其他DI病毒可以用于在动物和细胞中诱导干扰素。优选地，所述的DI病毒是经克隆的并且不是“快速复性”的或者“折返”的。例如，有一些经克隆的DI病毒属于披膜病毒科(Togaviridae family)的甲病毒属(Alphavirus genus)，并且具体地为辛德比斯病毒(Sindbis virus)和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)(SFV)。其在结构上都类似，但是在序列上不同。已经测试了所述的SFV DI病毒保护动物的能力。已经克隆了SFV DI病毒DI-6和DI-19[参见Thomson，M.和N.J.Dimmock，Commonsequence elements in structurally unrelated genomes of defective interferingSemliki Forest virus.Virology，1994.199：第354-365页；Thomson，M.，CL.White，和N.J.Dimmock，The genomic sequence of defective interferingSemliki Forest virus(SFV)determines its ability to be replicated in mouse brainand to protect against a lethal SFV infection in vivo.Virology，1998.241：第215-223页]。SFV具有单链的、正义RNA的单个分子，其包括11422nt。所述的甲病毒属是昆虫传播的脊椎动物病毒。其在非脊椎和脊椎动物宿主中都复制。甲病毒属DI病毒已经被综述[参见Kaariainen，L.和H.Soderlund，Structure and replication of alphaviruses.Current Topics in Microbiology andImmunology，1978.82：第15-69页；Stollar，V.，Defective interferingalphaviruses，in The Togaviruses，R.W.Schlesinger，Editor.1980，AcademicPress：New York.第427-457页；Schlesinger，S.和B.G.Weiss，DefectiveRNAs of alphaviruses，in The Togaviridae and Flaviviridae，S.Schlesinger andM.J.Schlesinger，Editors.1986，Plenum Press：New York and London，第149-169页；Barrett，A.D.T.和N.J.Dimmock，Defective interfering viruses andinfections of animals.Current Topics in Microbiology and Immunology，1986.128：第55-84页；Dimmock，N.J.，The biological significance of defectiveinterfering viruses.Reviews in Medical Virology，1991.1：第165-176.3-7页]。
SFV DI-19有1244nt长，并且具有10.9％的病毒粒子基因组。SFV DI-19没有主要的双链区域。在生物活性方面，所述的DI-19病毒在细胞培养物中，干扰SFV的增殖和RNA的复制，并且保护小鼠免于SFV-介导的疾病。SFV是嗜神经组织的，并且当小鼠经鼻内进行接种时，所述的病毒可能通过进入并上行到嗅神经进入大脑，并且导致脑炎以及通常导致致命的疾病。SFVDI-19与SFV共同给予针对该疾病进行保护。许多病毒产生缺损的基因组，并且多种该缺损的病毒是干扰性病毒。以下给出了可以发现缺损基因组的病毒的非限制性实例的列表：
疱疹病毒科(Family Herpesviridae)：
·单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)
·马疱疹病毒(Equine herpesvirus)
·伪狂犬病(Pseudorabies)
·巨细胞病毒(Cytomegalovirus)
·疱疹病毒(Herpesvirus)
·EB病毒(Epstein-Barr virus)
乳多空病毒科
·SV40
·乳头多瘤空泡病毒(Papovaviruses)
·多瘤病毒(Polyoma virus)
杆状病毒(Family Baculoviridae)
·杆状病毒(Baculovirus)
肝脱氧核糖核酸病毒科(Family Hepadnaviridae)
·乙肝病毒(Hepatitis B virus)
·鸭乙肝病毒(Duck hepatitis B virus)
腺病毒科(Family Adenoviridae)
·12型腺病毒(Adenovirus type 12)
·小鼠腺病毒(Mouse adenovirus)
细小病毒科(Family Parvoviridae)
·细小病毒(Parvoviruses)
在下文的实施例中，小鼠的使用遵守Home Office Project Licences PPL40/2561和PPL 40/2129以及Personal Licences 30/1253和PIL 40/03497。
实施例1-DI甲型流感病毒(244/PR8)介导的针对感染性甲型流感病毒对小鼠的保护不依赖于I型干扰素的诱导的证明
设计了试验用于测定DI甲型流感病毒介导的针对甲型流感病毒保护小鼠是否需要功能性的I型干扰素系统。尝试了保护缺少I型干扰素受体的突变小鼠。通过全部的I型α和β干扰素蛋白(13种α干扰素和1种β干扰素)使用所述的受体。
小鼠(野生型(129 Sv/Ev)或者无受体的(129 Sv/Ev IFNα/βR-/-)；Banting and Kingman Ltd，约五周龄)在浅麻醉下使用混合了DI甲型流感病毒244/PR8(400HAU，1.2μg；#813)的甲型流感/WSN(10 LD50)的混合物(40μl)经鼻感染。在每个感染组中使用五只小鼠，并且对于单独DI病毒及稀释的接种组使用两只小鼠。
下文的表2和3显示了多数给予病毒和未活化的DI甲型流感病毒的野生型小鼠生病，体重降低并死亡，然而给予了病毒和有活性的DI甲型流感病毒的那些仍然在临床上表现良好，尽管在第5-8天，它们的体重增加低于对照DI或者稀释接种的小鼠。
表2.在经鼻接种了DI甲型流感病毒和感染性的甲型流感病毒的野生型小鼠的体重变化百分比。
  天  iDI+V  DI+V   DI   模拟
  0  0  0   0   0
  1  0  0   0   2.7
  2  3.4  4   6.1   5.4
  3  6.7  6.1   9.1   8.1
  4  9  12.1   12.1   16.2
  5  0  10.1   12.1   10.8
  6  -5.6  10.1   18.2   13.5
  7  -22.5  8.1   18.2   16.2
  8  -25.8  10.1   21.2   18.9
  9  13.1   24.2   16.2
  10  16.2   24.2   21.6
  11  20.2   27.2   27
  存活者  20％  100％   100％   100％
表3经鼻接种了DI甲型流感病毒和感染性的甲型流感病毒的野生型小鼠的临床评分
  天   iDI+V   DI+V   DI   模拟
  0   1*   1   1   1
  1   1   1   1   1
  2   1   1   1   1
3   1   1   1   1
  4   1.6   1   1   1
  5   1.8   1   1   1
  6   2.7   1   1   1
  7   3   1   1   1
  8   3.4   1   1   1
  9   4.2   1   1   1
  10   4.2   1   1   1
  11   4.2   1   1   1
  存活者   20％   100％   100％   100％
*1＝良好，5＝死亡
表4和表5显示了全部给予病毒和经灭活的DI甲型流感病毒的小鼠生病、体重降低并死亡。在给予了病毒和有活性的DI甲型流感病毒的那些当中，仅有少数的(2/5)显示出任意的临床疾病，并且这非常地轻微并短暂。
表4.经鼻接种了DI甲型流感病毒和感染性甲型流感病毒的无干扰素受体小鼠的体重变化百分比
  天   iDI+V   DI+V   DI   模拟
  0   0   0   0   0
  1   0   -2   2.8   2.6
  2 3 1 5.6   5.1
  3   -4   4.1   8.3   7.7
  4   -11.1   8.2   13.9   15.4
  5   -18.2   -1   11.1   12.8
  6   -22.2   -4.1   11.1   15.4
  7   -26.3   -6.1   13.8   12.8
  8   -3.1   16.7   15.4
  9   2   16.7   15.4
  10   6.1   19.4   18
  11   9.2   19.4   18
  存活者   0％   100％   100％   100％
表5经鼻接种了DI甲型流感病毒和感染性甲型流感病毒的无干扰素受体的小鼠的临床评分
  天   iDI+V   DI+V   DI   模拟
  0   1   1   1   1
  1   1   1   1   1
  2   1   1   1   1
3   1.8   1   1   1
  4   2.6   1   1   1
  5   3.8   1.2   1   1
  6   4   1.4   1   1
  7   4.2   1.4   1   1
  8   5   1.2   1   1
  9   1   1   1
  10   1   1   1
  11   1   1   1
  存活者   0％   100％   100％   100％
*1＝良好，5＝死亡
大部分小鼠在第5-7天出现短暂地体重降低，并随后从第8天开始重新开始体重增加。对照在此期间体重增加。在突变的小鼠中的体重降低大于在平行组的野生型小鼠(DI+V)中所观察到的。
该数据显示了，DI甲型流感病毒基本上保护缺少功能性I型干扰素系统的小鼠免受甲型流感病毒攻击。然而，在一些动物中，短暂的体重降低以及非常轻微的短暂疾病暗示I型干扰素可以对由DI甲型流感病毒所介导的保护有小的贡献。
在另一个试验中，发现了同样的结果(数据未显示)。
实施例2-一些DI甲型流感病毒保护小鼠免受乙型流感病毒/Lee的感染-同时接种的证明
一系列的试验最初的目的是使用乙型流感病毒作为阴性对照，来显示不同的缺损干扰(DI)甲型流感病毒在小鼠中的保护性活性与其他的病毒不同，其对甲型流感病毒的保护具有特异性。出人意料地，发现DI甲型流感244/PR8具有针对乙型流感的活性，并且DI甲型流感是所测试的DI病毒中每单位总病毒HA最高活性之一。排除了乙型流感的感染剂量被甲型流感病毒污染的可能性，由于蛋白质印迹法显示，乙型流感的NP抗原和已知的甲型流感病毒是不相关的。
主要的攻击病毒是乙型流感/Lee/40 #795。通过其与乙型流感NP蛋白的标准抗体的阳性反应，检查该病毒的特性并将其确认为乙型流感。该抗体不和甲型流感病毒反应。也使用了甲型流感病毒/WSN(H1N1)#640来证实DI制剂是有活性的。两者都以10 LDso/小鼠使用。在-70℃下储存用含0.1％BSA(Sigma)的PBS稀释的病毒。将病毒在37℃下解冻，并保持在冰上，直到使用，通常在1-2小时之内。
对于DI病毒，按照Warwick(参见Duhaut，S.D.& Dimmock，N.J.(1998).Virol 248，241-253；Duhaut，S.& Dimmock，N.J.(2000)Virol 275，278-285；Duhaut，S.D.& Dimmock，N.J.(2002)J Gen Virol 83，403-411；Duhaut，S.D.& Dimmock，N.J.(2003)J Virol Meth 108，75-82.)进行RNA 1DI RNA 220的克隆。通过使用产生感染性的甲型流感/PR/8/34(H1N1)或者甲型流感Victoria/3/75(H3N2)的质粒转染细胞，将所述的RNA以DI病毒(220/PR8，220/Vic)和DI甲型流感(244/PR8)的形式引入。全名为：
·220/PR8＝RNAl_220/445_A/equine/Newmarket 7339/79(H3N8)xA/PR/8/34(H1N1)
■220/Vic＝RNA1_220/445_A/equine/Newmarket/7339/79(H3N8)xA/Victoria/3/75(H3N2)
■244/PR8＝RNA1_244/395_A/PR/8/34(H1N1)x A/PR/8/34(H1N1)
通过鸡胚蛋中的尿囊途径，将组织培养液进行传代，从而制备种子病毒。DI甲型流感病毒的工作储备通过以同样的方式用恒定量的种子病毒(10μl)接种鸡蛋来生长。将鸡蛋在33℃下孵育2天。收集尿囊液，并将DI病毒通过蔗糖经差速离心进行纯化。所得到的病毒颗粒以2×105HAU/ml再悬浮于含有0.1％BSA(Sigma)的PBS中，并且保存于液氮中。DI RNA的存在和完整性通过使用特异性的引物通过RT-PCR和测序来确认。
使用了多批的DI。将DI病毒在37℃下解冻，直到刚刚融化，并置于冰上直到使用，通常在1-2小时之内。将DI病毒在室温下，于254nm下UV照射40秒，从而除去辅助病毒的感染性(DI)。将等份的同样材料以同样的方式UV照射8分钟，从而消除保护活性(iDI)。后者保留全部的血凝素和神经氨酸苷酶活性。在选择的微量滴定架中进行UV照射，所选择的微量滴定架使得不管所照射的体积，都有恒定的约1-2mm的深度。
对于约1000μl使用6孔板
对于约350μl使用12孔板
对于约200μl使用24孔板
病毒感染性的照射使用距离样品约10厘米的紫外条状灯(UV strip light)进行，并且灯在使用之前预热几分钟。灯下方是将孔和灯对齐的交叉使用。手动连续震荡平板40秒并间歇震荡8分钟。通过在模仿照射DI病毒的条件下照射感染性的病毒，并测定残留的感染性按经验确定照射的持续时间。流感感染性的UV灭活在单击动力学测试之后进行，因此可以对任意滴度的病毒进行预测。对紫外灯的使用进行记录，从而确保在其效力降低之前更换所述的灯。常规地单独地使用DI病毒(40秒UV之后)接种小鼠，从而检查该灭活是否成功。
Inbred C3H/He-mg小鼠由位于University of Warwick的Small AnimalUnit提供，并于约4-6周龄，16-20g使用。所使用的两种性别显示同样地易受甲型流感病毒的感染。在19-23℃和45-65％相对湿度下，将小鼠放置到单一性别的笼子中，通常地每组4-6只动物。食物和水是连续可获得的。不将小鼠分别地识别。
将小鼠在乙醚浅麻醉之后，使用病毒经鼻感染，通常在两个鼻孔中分开使用40μl。动物在接种的数秒内恢复知觉并开始活动。在感染之后，每天对小鼠进行评估，在临床评分并测定组体重——每日两次。使用了标准形式(下文)。使用的临床条件如下。当需要时，其可以在1-5的量度中进行定量的评分：
■对于各个健康的小鼠，计1分
■对于显示出不适体征的各个小鼠计2分，所述的不适包括轻微立毛，轻微改变步态，行走加快(在临床评估表(clinical assessment proforma)中简写为“病的”)
■各个显示出强的立毛、收缩腹部、改变步态、不活动时间、增加呼吸频率和有时候罗音的体征的小鼠计3分(在临床评估表中简写为“更重病的”)
■各个具有前述组中增强的特征但显示出很少的活动性，并濒临死亡的小鼠计4分；该小鼠在确定其不能存活时杀死(在临床评估表中简写为“最重病的”)
■对于死亡的小鼠计5分。
在此前的研究中，已经使用DI病毒治疗的受感染的小鼠没有显示出疾病或者体重降低的体征，但是此前确定了这样的动物经历不活动的、亚阴性感染，该感染激发适应性免疫应答，该免疫应答保护它们免受非常大剂量的相同病毒的第二次攻击。为了确定使用DI病毒治疗后动物的免疫状态，将动物使用感染性的病毒进行第二次攻击。该病毒在第一次感染之后三周，是已经描述过的B/Lee。病毒的剂量约为10,000 LD50。
将小鼠经鼻接种DI甲型流感病毒和10 LD50的攻击B/Lee或者A/WSN的混合物或者混合了10 LD50的攻击B/Lee或者A/WSN的灭活的DI甲型流感病毒。
经灭活的DI甲型流感病毒包含与活的DI病毒具有同样量/活性的血凝素和神经氨酸苷酶。在第一次B/Lee攻击之后三周，使用高剂量的B/Lee再次攻击小鼠从而确定其免疫状态。
下表6总结了采用不同的DI甲型流感病毒所观察到的保护。可以看到的是，12μg或者4000HAU/小鼠下，DI甲型流感病毒和220/Vic有强的和可重复的保护，但是220/PR8没有显著的保护。每只鼠使用1.2μg DI时，220/Vic具有保护性。针对B/Lee的DI甲型流感病毒的保护的水平比其在A/WSN中提供的低约100倍。DI甲型流感病针对甲型流感病毒提供的保护在120ng时具有显著性。
DI制剂在不同的程度上(参见上文的表1和表2)针对甲型流感进行保护。这可以总结为：
244/PR8＞220/Vic＞220/PR8
所有的DI甲型流感病毒制剂使用HAU进行标准化，并且针对乙型流感的活性的范围是引人注目的。该活性不与DI RNA相关，由于220/PR8是有活性的而220/Vic没有。活性也不与辅助病毒相关，由于244/PR8是有活性的而220/PR8没有。
表6使用不同的经克隆的DI甲型流感病毒针对乙型流感/Lee对小鼠的保护。将B/Lee与DI病毒混合并经皮下同时给予小鼠。
Figure BDA0000067732130000251
在全部的实验中的对照是混合了B/Lee的灭活的DI病毒(数据未显示)。这不提供保护。
a在此实验中没有使用保护的WSN的阳性对照。
b这是比通常更强的攻击：尽管如此DI甲型流感在全部生病的(5/5)小鼠中将疾病推迟了5天，并且仅有1/5死亡(与经灭活的DI甲型流感相比其中在第6天5/5死亡)。1/100DI的阳性对照针对WSN提供好的保护。
cDI甲型流感推迟了疾病但是4/5死亡。
d在此实验中没有单独的病毒作为对照，所以使用了没有明显的提供保护的1/100DI+B/Lee。
e病毒库存簿索引号(Virus stock book reference number)。
++++表明针对疾病和体重下降的完全保护；-，与单独的病毒，或者病毒+灭活的DI对照相比没有保护；+++，++，+，±分别是从高到低的保护的中间梯度。
每HAU的B/Lee的感染性。
为了检查乙型流感病毒对DI甲型流感的相对不灵敏性是否由于高的鼠感染性(MID50)：LD50比例引起，在小鼠中进行了B/Lee的滴定。该滴定确定了小鼠在第一次感染之后的三周使用高剂量的同源病毒攻击是否受到感染(并且因此具有后天的免疫力)。以通常的方式确定LD50。仅有20MID50/LD50(参见#3846)。这意味着该感染剂量仅比致命剂量高20倍，并且位于通常用于攻击小鼠的甲型流感病毒的范围内。因此乙型流感的剂量不是过量的。
受保护的小鼠产生后天免疫力
通过给予DI病毒，从第一次B/Lee攻击中存活的小鼠在第二次非常高的B/Lee攻击中受到保护，这显示了其产生了针对B/Lee的后天免疫力(数据未显示)。
实施例3-阐明DI甲型流感病毒介导的针对乙型流感病毒的感染保护小鼠的本质：乙型流感病毒不复制甲型流感DI RNA 244
甲型和乙型流感病毒在遗传学上相互作用未知。尽管两者均具有8个片段所组成的基因组。不同的甲型流感病毒的RNA片段经历遗传重组，而类似地不同的乙型流感病毒的RNA片段经历遗传重组。任何相互作用仅有的暗示来自体外实验，其中甲型流感复制了连接到CAT报告基因的乙型流感HA基因[Jackson，D.，A.Cadman，T.Zurcher，和W.Barclay，A reversegenetics approach for recovery of recombinant influenza B viruses entirely fromcDNA.Journal of Virology，2002.76：第11744-11747.1页]。然而，本发明人未了解到感染性的乙型流感病毒在体内复制甲型流感缺损干扰(DI)RNA的能力，反之亦然。
为了确定感染性的乙型流感病毒是否在鸡胚蛋中复制存在于甲型流感244/PR8中的DI RNA 244，使用了RT-PCR来寻找RNA 244的量的上升。所检测224/PR8的各批次此前显示出针对乙型流感/Lee病毒引起的疾病保护小鼠。
DI 244/PR8甲型流感病毒(#813)经UV照射40秒以除去全部的感染性。244/PR8是浓缩纯化的病毒制剂，其具有2×10HAU/ml以及约2×1012物理颗粒/ml。乙型流感/Lee/40(#795)是尿囊液并且以任意高剂量的1/0稀释度使用，从而确保全部细胞的感染，并且在每个随后的机会中对DI甲型流感RNA进行复制。将244/PR8按顺序进行稀释(参见下表7)到1/10B/Lee中，所述的1/10B/Lee含有青霉素和链霉素作为抗鸡蛋中的细菌污染的预防措施。将10日龄的鸡胚蛋(3个鸡蛋/样品)注射100μl的混合物和不同的对照(表7)。
表7.使用甲型流感DI 244/PR8和感染性的乙型流感的混合物接种鸡胚蛋的方案
  244/PR8   B/Lee*
 A   1/10   +
 B   1/100   +
 C   1/1000   +
 D   1/10000   +
 E   无   +
 F   1/10   无
 G   无   无
*a#795的1/10稀释度
将蛋在33℃下孵育24小时，冷却并收集尿囊液。从三个蛋的各个中收集约2ml，并在-70℃下储存。在尿囊液中，病毒的血凝素(HA)的量通过终点滴定以及所添加的鸡红血细胞的凝集而测定。使用224RNA所来源的PR8片段1 RNA的末端引物进行RT-PCR。
表8(第E行)显示了具有103.5HAU/ml的滴度的B/Lee自身生长良好。
244/PR8自身没有HA滴度，这显示了其完全是非感染性的。B/Lee和244/PR8(表8的第A-D列)全部的混合物得到大约相同的HA滴度，这显示了244/PR8不干扰B/Lee的增殖。
表8.接种了甲型流感DI 244/PR8和感染性的乙型流感*混合物的蛋的血凝素的产生
  244/PR8   B/Lee**   HAU/ml(log10)
  A   1/10   +   3.1
  B   1/100   +   3.7
  C   1/1000   +   3.3
  D   1/10000   +   3.25
  E   无   +   3.5
  F   1/10   无   ≤1.6
  G   无   无   ≤1.6
*在33℃下孵育24小时之后
**#795的1/10稀释度
HAU血凝单位
RNA提取自尿囊液并使其进行RT-PCR，所述的RT-PCR使用PR8 RNA片段1的末端引物。图1显示了使用1/10244/PR8不使用B/Lee接种(泳道F)的蛋产生224 RNA的预期大小的扩增子，并且推测其得自剩余的接种RNA。这不是出人意料的，由于已知224 RNA在经鼻接种的小鼠的肺中持续存在数周时间(未公布的数据)。来自与B/Lee混合的1/10 244/PR8的扩增子(泳道A)不比得自244/PR8自身的大，这显示了B/Lee未复制244/RNA。泳道B具有与从1/100稀释度中预期相一致的痕量244 RNA。注意泳道E中单独使用B/Lee接种，并含有扩增子，据推测是非特异性引发的结果；所有其他使用B/Lee接种的蛋具有扩增子，从而确认了该病毒的存在。
尝试使用甲型流感/mallard/England/7277/06代替B/Lee来复制非感染性的244 RNA的平行试验(数据未显示)，与244 RNA自身的稀释度相比，在以1/10到1/10000的稀释度中，使得全部244 RNA的量增加。对于这个RT-PCR，我们使用了对于244 RNA具有特异性的连接特异性的引物，从而避免任意其他的内源片段1 DI RNA的融合，该融合可能已经存在或者可能已经重新出现。该试验用作阳性的对照。
总之，在设计为其提供便利的条件下，乙型流感/Lee不复制存在于DI甲型流感病毒244/PR8中的244 RNA。
没有乙型流感/Lee与DI甲型流感病毒的遗传相互作用的证据。
实施例4-BALB/c和C3H/He-mg小鼠中PVM诱导的临床疾病的比较，从而确认C3H/He-mg小鼠在PVM试验中的适用性
在这个和随后的实施例中，基于小鼠肺炎病毒(PVM)引起的小鼠感染，进行了试验以评价效果使用含有流感病毒干扰RNA的DI甲型流感病毒的效果。由于所有此前的甲型流感的工作使用C3H/He-mg小鼠进行，这是使用的优选小鼠株。然而首先必须确定如在BALB/c小鼠中所见的那样，PVM在C3H/He-mg小鼠中引起其典型的疾病样式。
DI甲型流感病毒的制备
活的DI病毒通过将DI流感病毒的储备使用UV照射40秒制备。无活性的DI病毒通过将同一流感病毒储备用UV照射8分钟制备。适当时稀释储备。
使用DI甲型流感病毒进行处理
将小鼠使用乙醚进行轻微麻醉。通过双侧鼻内接种40μl接种物来引入DI病毒。小鼠很快恢复并观察到确保其未显示出任何的不良体征。
使用小鼠肺炎病毒(PVM)感染
全部的试验使用PVM株J3666的相同储备。其已经显示出具有高度致病性。首先，将小鼠通过腹腔注射PBS中的9mg/ml的氯胺酮和2mg/ml的甲苯噻嗪的混合物进行麻醉。随后使用总体积为50μl的病毒(一般地约500p.f.u.的病毒，除非另外指出)通过鼻内接种来接种动物。全部的感染在I级微生物柜中进行。将小鼠在隔离器中恢复和放置。
感染的步骤之后
每天监测小鼠。将全部组的小鼠称重并将单个的小鼠针对临床上感染的体征的存在进行评分。根据Home Office许可的要求，将任何显示出最严重的临床体征的小鼠杀死，本工作按照所述的许可进行管理。PVM感染的临床体征的描述示于下表9中。该表确定了在感染了小鼠肺炎病毒的致病性毒株的小鼠的疾病症状。在一些毒株中，疾病的进展更迅速而一些症状可能不容易看到，例如在小鼠的白化的毒株中容易看到耳朵和尾巴的黄萎病，但是在深色毒株中看不到。在第2和第4级之间的时间可以是短的并且第2和第3级不能完全分开地进行区分。
表9.小鼠中PVM感染的临床体征的描述。
Figure BDA0000067732130000301
进行实施例4中的实验，从而建立PVM感染对C3H/He-mg小鼠的影响。
尽管描述PVM的分离的开始的实验使用远亲杂交系，但在过去的20年内公开的全部的工作都使用近亲杂交的小鼠。疾病的模式最早使用BALB/c小鼠公布，随后确认了该症状与C57/BL6小鼠中的相同。尚未有在C3H/He-mg小鼠中的PVM感染的描述。为了与使用C3H/He-mg小鼠进行的流感病毒保护工作进行比较，测试了其对于PVM感染的响应。使用BALB/c小鼠作为比较的标准。
使用了五个组，其各个包括4只小鼠，BALB/c或者C3H/He-mg小鼠。使用四种稀释度下的PVM株J3666的储备物，四个稀释度分别为纯的(50μl中约5000p.f.u.)，1/3(50μl中约1700p.f.u.)，1/10(50μl中约500p.f.u.)，1/30(50μl中约170p.f.u.)。各个四只小鼠的组使用50μl的合适地稀释的病毒进行接种，以及对照组使用50μl的无菌PBS接种作为对照。各组的小鼠每天称重，并且观察其感染的临床体征。
结果示于图2A和图2B中。在这一个以及随后的全部PVM实验中，将动物的组的体重按照初始体重作为100％进行做图。随后得到的每一个体重按照与初始值的相对值进行表示。死亡的小鼠的体重记为0g。因此如果一个组开始的时候有5只小鼠，总体重为100g(全部的都是20g)并且一只小鼠死亡但是其他的小鼠保持相同的体重，那么该组的体重是80g并且因此是原始的80％。当全部的小鼠都死亡时，总体重是0g并且因此是原始的0％。在C3H/He-mg小鼠中PVM感染的效力与在BALB/c小鼠中一样。所有随后的DI甲型流感病毒的实验使用C3H/He-mg小鼠。
实施例5DI甲型流感病毒244/PR8针对PVM攻击的保护作用的测定-1
本实验寻求调查DI甲型流感病毒244/PR8针对PVM攻击对C3H/He-mg小鼠的潜在的保护能力。
实施例4确认了在C3H/He-mg小鼠中，PVM感染遵从此前在BALB/c小鼠中建立起来的同一种疾病进展模式。在此实验中，使用了可能的DI甲型流感病毒的最高剂量，从而得到观察效果的最高可能性。在这些高水平下，无活性的DI甲型流感病毒针对感染性的甲型流感病毒显示出了一些效力。
按照前文所述制备DI甲型流感病毒储备物(stock)244/PR8 #812(244/PR8)。这是未经稀释的材料，即12μg/小鼠并且比使用甲型流感病毒攻击的“标准”测试高十倍。使用前文所述的标准步骤，向小鼠给予有活性的DI甲型流感病毒或者无活性的DI甲型流感病毒。随后24小时后用PVM攻击小鼠。使用1/3稀释度的PVM株J3666(在50μl中约700p.f.u.)。
处理是：
1.有活性的DI甲型流感病毒+PVM-5只小鼠
2.无活性的DI甲型流感病毒+PVM-5只小鼠
3.模拟的接种+PVM(即在最初的接种中无DI甲型流感病毒)-4只小鼠
4.有活性的DI甲型流感病毒以及无攻击(即DI甲型流感病毒+模拟)-2只小鼠
5.模拟的接种，没有攻击(即在最初的接种中无DI甲型流感病毒)-3只小鼠
各组动物的体重进行做图，将PVM感染后一天的体重作为100％，如图3所示。
对照(模拟+PVM)显示PVM完全是感染性的。使用有活性的DI甲型流感病毒的处理消除了PVM感染的体征，尽管在此组中在第7-10天体重有小的下降。使用无活性的DI甲型流感病毒处理并在随后用PVM攻击的小鼠在第8和第9天显示出中度的临床体征，并且从第8天开始显示出显著的体重下降，尽管在此实验结束时体重增加。剩下的两个对照组表现和预期的一致。
对针对PVM攻击的保护的观察是出人意料的。无活性的DI甲型流感病毒的更低效力的保护说明了，由于在接种物中使用的病毒颗粒的“负载”而有非特异性的作用，或者所使用的高浓度的DI甲型流感病毒通过非特异性的途径提供了保护。
实施例6-DI甲型流感病毒244/PR8针对PVM攻击的保护效力的测定-II
实施例5表明DI甲型流感病毒可以能针对PVM的攻击提供保护，但是这可能是非特异性的。使用比用于流感病毒攻击试验中高10倍的DI甲型流感病毒接种物获得来自该实验的数据。为了进行更恰当的比较，使用标准水平的DI甲型流感病毒接种物(1.2μg/小鼠)重复了本实验。本实验因此重复实施例5，但是使用低10倍剂量的DI甲型流感病毒。
将小鼠使用DI甲型流感病毒244/PR8进行接种，所述的甲型流感病毒244/PR8使用前文所描述的标准技术进行制备和递送。在24小时之后，将小鼠使用PVM株J3666进行攻击，所述的PVM株J3666在1/5的稀释度下使用(50μl中约1000p.f.u.)
实验组是：
1.有活性的DI甲型流感病毒+PVM-5只小鼠
2.无活性的DI甲型流感病毒+PVM-5只小鼠
3.模拟的接种+PVM(即在最初的接种中无DI甲型流感病毒)-4只小鼠
4.有活性的DI甲型流感病毒以及无攻击(即DI甲型流感病毒+模拟)-2只小鼠
5.模拟的接种，没有攻击(即在最初的接种中无DI甲型流感病毒)-2只小鼠
图4显示了各组动物体重以PVM感染之后一天的体重作为100％进行作图。在全部的动物中PVM感染之后，有活性的DI甲型流感病毒针对临床体征的显示提供完全的保护。在此组中在第8和第9天体重有小的降低。无活性的DI甲型流感病毒对于所有死于感染的小鼠不显示出保护，尽管在此组中，与未接受DI甲型流感病毒接种的对照相比在疾病的进展中有很小的推迟。
这些数据显示出与接种DI甲型流感病毒相关的非常清楚的保护，以及接种无活性的DI甲型流感病毒则无保护。当使用10倍剂量的DI甲型流感病毒时，同时考虑来自实施例5中的数据，这暗示着DI甲型流感病毒可能具有通过另一个系统起作用的能力。这暗示着在高浓度下，流感病毒颗粒可以诱导另一个抗病毒防御的系统，但是在低浓度下有活性的DI甲型流感病毒制剂的能力高于无活性的制剂。
实施例7DI甲型流感病毒244/PR8针对PVM感染提供的保护的持续时间的调查
DI甲型流感病毒赋予的针对PVM感染的保护可以由于一个或者多个的因素。进行该实验的目的是研究DI甲型流感病毒赋予的针对PVM感染的保护的持续时间。
将动物使用DI甲型流感病毒244/PR8(有活性的或者没有活性的)根据前文实施例6中描述的标准步骤进行处理。将全部的动物观察6天并随后用PVM株J3666在1/5的稀释度(50μl中约1000p.f.u)下进行攻击。每天观察动物，并称量每个组。
实验组为：
1.有活性的DI甲型流感病毒+PVM-5只小鼠
2.无活性的DI甲型流感病毒+PVM-5只小鼠
3.有活性的DI甲型流感病毒以及没有攻击(即DI甲型流感病毒+模拟)-2只小鼠
4.模拟的接种，没有攻击(即在最初的接种中没有DI甲型流感病毒)-1只小鼠
图5显示了各组动物体重随时间过程的作图。将PVM感染之后1天的动物体重视为100％。受到PVM攻击的全部小鼠死于该感染并且在第7天按照Home Office许可的要求剔除，本工作在所述的Home Office许可下进行。
有活性的DI甲型流感病毒所提供的保护在接种之后第7天丧失。这与DI甲型流感病毒产生短暂的干扰素响应的可能性一致。
实施例8-DI甲型流感病毒244/PR8的剂量和针对PVM感染的保护之间的关系的测定
实施例5和实施例6表明在针对PVM的感染所赋予的保护中存在剂量相关的响应。该实验尝试确定针对PVM的攻击中提供保护所必须的DI甲型流感病毒的剂量。使用了三种不同水平的DI甲型流感病毒。
制备了DI甲型流感病毒(244/PR8)的储存物并将其给予小鼠。在处理24小时之后，将小鼠使用1/5稀释度的PVM株J3666进行攻击(在50μl中约1000p.f.u)。每天都观察动物并且称量各个组。
试验组为：
1.1/10稀释度的有活性的DI甲型流感病毒(1.2μg/小鼠)+PVM攻击(NB这是在之前的试验中使用的‘标准’剂量的DI甲型流感病毒)-5只小鼠。
2.1/100稀释度的有活性的DI甲型流感病毒(120ng/小鼠)+PVM攻击-5只小鼠。
3.1/1000稀释度的有活性的DI甲型流感病毒(12ng/小鼠)+PVM攻击-5只小鼠。
4.1/10稀释度的无活性的DI甲型流感病毒(1.2μg/小鼠)+PVM攻击-5只小鼠。
5.1/10稀释度的有活性的DI甲型流感病毒(1.2μg/小鼠)，无攻击-2只小鼠。
6.模拟的接种，没有攻击-2只小鼠。
图6显示了各组动物体重以PVM感染之后一天的体重作为100％与时间进行作图。该数据显示了清楚的剂量依赖性反应和清楚的在1/10稀释度时的保护(如在其他试验中所见的)，在1/100稀释度时的部分的保护以及在1/1000的稀释度下本质上无保护。值得注意的是，使用1/10的稀释度处理的小鼠的体重降低，这在此前的试验中确切地有发现，尽管不存在明显的外表上的症状。
实施例9-DI甲型流感病毒244/PR8针对PVM感染表现出的保护的再现性的评估
本实验尝试重复实施例8并证明再现性。
图7显示了各组动物体重以PVM感染之后一天的体重作为100％与时间进行作图。剂量响应是清楚的。在此试验中，1/10的稀释度不如前文完全地进行保护，并且有一些较小的感染的临床体征，所述的临床体征和体重的减少有关。所述的临床体征限制在在第8、10和12天的每天的一只小鼠中。在此1/100稀释度的DI甲型流感病毒显示出良好的保护程度但是1/1000的稀释度是没有效力的。
实施例10-DI甲型流感病毒244/PR8所提供的针对PVM的感染的保护的持续时间的测定
本实验尝试进一步地明确DI甲型流感病毒244/PR8所提供的针对PVM的感染的保护的持续时间(参见实施例7)
使用了DI甲型流感病毒244/PR8储存物#813并稀释到1/10(1.2μg/小鼠)
实验组由以下组成：
1.有活力的DI甲型流感病毒+PVM，处理之后一天-5只小鼠
2.无活力的DI甲型流感病毒+PVM，处理之后一天-5只小鼠
3.有活力的DI甲型流感病毒+PVM，处理之后三天-5只小鼠
4.无活力的DI甲型流感病毒+PVM，处理之后三天-5只小鼠
5.有活力的DI甲型流感病毒以及无攻击(即DI甲型流感病毒+模拟)-2只小鼠
6.模拟的接种，无攻击(即在开始的接种中没有DI甲型流感病毒)-2只小鼠
图8显示了该组动物的体重按照时间的做图，其中将使用DI甲型流感病毒处理当天的体重当作100％。在处理之后1天攻击时，有活力的DI甲型流感病毒的保护不像此前观察到的那样明显。这很可能是由于剂量水平是次优化的。
尽管如此，可以明显地看到在处理之后第3天保护作用丧失。
实施例11DI甲型流感病毒244/PR8针对PVM感染的治疗活性的测定
DI甲型流感病毒已经显示在甲型流感病毒感染中具有预防和治疗活性。在PVN感染中对治疗能力的评估可以对DI甲型流感病毒的作用机理以及其对进行中的肺炎病毒感染的治疗的潜在的价值提供一些启示。
DI甲型流感病毒244/PR8储备液(1.2μg/鼠)按照前文所述进行制备。对于接受DI甲型流感病毒处理的那些小鼠作为第一个步骤实施。此后进行随后的接种。小鼠使用PVM株J3666在1/5稀释度下(50μl中约1000p.f.u)进行接种。观察动物并将各组每天称重。
实验组为：
1.PVM感染，随后在感染后一天有活性的DI甲型流感病毒-5只小鼠
2.PVM感染，随后在感染后一天无活性的DI甲型流感病毒-5只小鼠
3.有活性的DI甲型流感病毒+PVM，在处理后一天PVM-5只小鼠
4.无活性的DI甲型流感病毒+PVM，在处理后一天PVM-5只小鼠
5.有活性的DI甲型流感病毒以及无攻击(即DI甲型流感病毒+模拟)-2只小鼠
6.模拟接种，无攻击-2只小鼠
图9显示了该组动物的体重按照时间的作图，其中将使用DI甲型流感病毒处理当天(使用DI甲型流感病毒接种或者使用PVM感染)的体重当作100％。该数据确认了当在PVM感染之前24小时使用有活性的DI甲型流感病毒时针对感染的保护。与此前的一样，在该组中体重有小的降低，在此情形下相关的表现为在一只鼠中最轻度的症状，在其他小鼠中无症状。
与前面的一样，使用无活性的DI甲型流感病毒处理不提供保护。在PVM感染后24小时使用有活性的DI甲型流感病毒处理不给予完全的保护，但是当与对照相比的时候确实减轻疾病。出人意料地，使用无活性的DI甲型流感病毒处理显示出微少的效果(一只此前显示出疾病症状的存活的鼠)。该数据是在所使用的条件下治疗效果的程度的证据。
实施例12-在经鼻接种了DI甲型流感病毒244/PR8的小鼠的肺中而非血清中发现I型干扰素的证明
C3H/He-mg小鼠(16-20g并且约五周龄)在浅麻醉下经鼻接种DI甲型流感病毒244/PR8(#812)或者UV-灭活的(i)DI甲型流感病毒，或者稀释接种——使用前文所述用于保护试验的步骤。在分开的实验中，每只小鼠使用12或者1.2μg的DI病毒接种小鼠。每组中使用两只小鼠。所述的DI病毒是无感染性的并且不使用其他感染性的病毒。在接种之后1天，将小鼠杀死并且将肺摘除并冷冻储存在-70℃。还从心脏中取血，并加工成血清，所述的血清以同样的方式储存。将来自各个小鼠的肺分开储存，收集来自两只小鼠的血清。
96孔塑料板中的生物测试使用了其复制对于干扰素敏感的小鼠的L细胞和塞姆利基森林病毒(SFV)。干扰素抑制由SFV引起的细胞病理。按照经验确定了能够在5-6天内可靠地杀死细胞的SFV最低剂量。
将来自一只小鼠的肺解冻并在含有0.1％的牛血清白蛋白的1ml PBS中使用研棒和研钵与沙子一起研磨。在低速离心除去沙子和碎片之后，将上清液等分并重新冷冻备用于干扰素分析。由于肺提取物对于细胞是有毒的，该检测以1/5的稀释度进行，但是在此稀释度下仍然观察到了若干毒性。来自毒性的样品的结果忽略不计。血清的毒性较低，但是由于可用的材料较少，稀释通常以1/5开始。
对于该检测，干扰素(肺的上清液或者血清)一系列地稀释，并且在细胞被感染之前1天加入到细胞中，并提供诱导到抗病毒状态的时间。将培养基于次日除去并以SFV替换并孵育5-6天。将剩下的细胞随后使用活体染料中性红进行染色。所述的染料随后在碱性的条件下进行提取，该条件下颜色加深，并使用ELISA读数器定量。
除此之外，各个平板含有病毒的对照，细胞的对照和阳性干扰素的对照——商业来源的重组小鼠β干扰素(PBL Biomedical Laboratories)。
图10和表10显示了使用纯的DI甲型流感病毒244/PR8接种的小鼠的肺在高达1/40的稀释度时，对于干扰素是阳性的。在最浓(1/5)的肺样品中观察到了一些毒性，但是1/10的稀释度保护84.4％的细胞，比没有干扰素加入的病毒对照中存活的细胞多6倍。与此相比，来自同一小鼠的血清未显示出干扰素活性的迹象。在使用1/10的DI甲型流感病毒接种的小鼠中，在1/10稀释度的肺提取物或者1/5的血清中，均未检测到干扰素(表11)。从用于图10/表10的平板中，β干扰素标准的滴定示于图11中。
表10在使用纯DI甲型流感病毒接种小鼠后1天肺和血清中干扰素的检测
Figure BDA0000067732130000371
DI，DI甲型流感病毒
*c.p.e的相对抑制，对于加入了推定存在的干扰素的孔的具有病毒的OD：没有病毒的OD(％)/第3列中对于没有加入干扰素的孔的具有病毒的OD：没有病毒的OD
Na，不适用.
有毒的，此肺样品18.5％的毒性
表11.用1/10的DI甲型流感病毒接种小鼠后，肺和血清中干扰素的检测
Figure BDA0000067732130000381
DI，DI甲型流感病毒
*c.p.e的相对抑制，对于加入了推定存在的干扰素的孔的具有病毒的OD：没有病毒的OD(％)/第3列中对于没有加入干扰素的孔的具有病毒的OD：没有病毒的OD
Na，不适用.
有毒的，此肺样品46％的毒性
经灭活的DI甲型流感病毒在1/10的肺稀释度或者1/5的血清稀释下，不激发干扰素。(参见下表12&13)
表12.用纯的经灭活的DI甲型流感病毒接种小鼠后1天时肺和血清中干扰素的检测
Figure BDA0000067732130000382
iDI，经灭活的DI甲型流感病毒
*c.p.e的相对抑制，对于加入了推定存在的干扰素的孔的具有病毒的OD：没有病毒的OD(％)/第3列中对于没有加入干扰素的孔的具有病毒的OD：没有病毒的OD
Na，不适用.
有毒的，此肺样品65％的毒性
表13使用纯的经灭活的DI甲型流感病毒接种小鼠之后1天时，第二只小鼠中肺和血清中干扰素的检测
Figure BDA0000067732130000391
iDI，经灭活的DI甲型流感病毒
*c.p.e的相对抑制，对于加入了推定存在的干扰素的孔的具有病毒的OD：没有病毒的OD(％)/第3列中对于没有加入干扰素的孔的具有病毒的OD：没有病毒的OD
Na，不适用.
有毒的，1/5和1/10的肺样品中有34％的毒性
在经鼻接种了纯的DI甲型流感病毒之后在小鼠的肺中检测到推定的干扰素，而在同一小鼠的血清中没有检测到。在1/20稀释度的肺提取物观察到了约50％的抑制。在接种了1/10DI甲型流感病毒或者接种了纯的UV灭活的DI甲型流感病毒的小鼠的肺或者血清中没有鉴定出干扰素。
实施例13证明了在经鼻接种了DI甲型流感病毒224/PR8的小鼠中诱导的I型干扰素在肺中可以在2天内检测到
按照实施例12所描述地将C3H/He-mg小鼠使用纯的DI病毒甲型流感病毒(12μg/小鼠)进行接种，除了在接种之后的第1、2和4天摘除肺。
所使用的干扰素生物测试如实施例12所描述。
表14显示了在第1和第2天而不是第4天，所取肺提取物中的强抗病毒活性(＜1/10)。50％端点在第1天是＞1/40，在第2天为约1/30。在第2天取的血清(1/5)中不存在干扰素(数据未显示)。
表14，在经鼻接种纯DI甲型流感病毒之后，在第1、2和4天小鼠肺中干扰素的检测。
Figure BDA0000067732130000401
DI，DI甲型流感病毒
有毒的，一些毒性
Na，不适用
在接种后第1和第2天，干扰素存在于肺中，但是在接种的4天后未检测到，这说明在该位置中，所诱导的干扰素具有相对短的半衰期。注意到本实验未解决在肺中干扰素诱导的抗病毒状态持续时间的问题。
实施例14-在经鼻接种了DI甲型流感病毒220/Vic或者220/PR8的小鼠的肺或者血清中未诱导出I型干扰素的证明
按照实施例12所述使用C3H/He-mg小鼠，除了接种的是纯(12μg/小鼠)220/PR8(#794)或者220/Vic(#798)DI或者UV-灭活的(i)DI病毒。
所使用的干扰素生物检测如实施例12所述。
在接种了纯的DI甲型流感病毒220/PR8或者220/Vic DI或者灭活的DI甲型流感病毒的小鼠的肺或者血清中没有检测到干扰素(表15、16)。此检测中没有技术上的问题并且各个微量滴定板中含有β凝集素的标准滴定，从而确保该检测是可靠的——图12中显示了一个实例。在每组中有2只小鼠并且在任一只中均未检测到干扰素。
表15未能在经鼻接种纯的DI甲型流感病毒220/PR8后的小鼠的肺或者血清中检测到干扰素——样品在1天之后采得
Figure BDA0000067732130000411
DI，DI甲型流感病毒
有毒的，一些毒性
Na，不适用
表16.未能在经鼻接种纯的DI甲型流感病毒220/Vic后的小鼠的肺或者血清中检测到干扰素——样品在1天之后采得
Figure BDA0000067732130000412
DI，DI甲型流感病毒
有毒的，一些毒性
Na，不适用
经鼻接种的DI甲型流感病毒220/PR8或者220/Vic未在小鼠的肺或者血清中激发任意可检测的干扰素。这与在经加工在干扰素启动子的控制下表达荧光素酶的细胞中干扰素的诱导相反，在该细胞中，220/Vic在1/100的稀释度下激发干扰素，并且在1/1000的稀释度下可能激发出干扰素，但是纯的220/PR8未激发出干扰素(实施例17)。
实施例15-在经腹腔注射DI甲型流感病毒244/PR8的小鼠血清中发现I型干扰素而肺中没有发现的证明
如实施例12所述使用了C3H/He-mg小鼠，除了经腹腔注射244/PR8(#812)DI或者UV-灭活的(i)DI病毒，或者稀释剂进行感染的小鼠。各个小鼠接受20μl的高达100μl的DI/iDI，即与经鼻给予的剂量相同。每组中使用两只小鼠。
所使用的干扰素检测如实施例12中所述。
表17显示了在经腹腔注射DI甲型流感病毒的两只小鼠中，在接种之后1天，在血清中可再生地检测到了干扰素。约1/120的稀释保护细胞单层的约50％。iDI病毒中检测到很少的干扰素，除了可能地在1/10的血清稀释下——在重复的小鼠中具有14.5％和44.4％的抑制(参见表18)。肺提取物的最高浓度(1/10)在一只小鼠中抑制病毒3倍左右——其他的提取物在该浓度下是有细胞毒性的。
表17.在小鼠腹腔注射纯的DI甲型流感病毒244/PR8之后，在血清中观察到了强的干扰素响应，而在肺中没有——样品是在注射后1天采得的。
DI，DI甲型流感病毒
有毒的，一些毒性
Na，不适用；Nd，未进行
表18.小鼠腹腔注射纯的iDI病毒244/PR8之后，在血清中或者肺中未发现干扰素——样品如上文得到
Figure BDA0000067732130000422
DI，DI甲型流感病毒
有毒的，一些毒性
Na，不适用；Nd，未进行
将244/PR8腹腔注射到小鼠中，在血清中激发了强的干扰素响应。干扰素检测在血清的1/160稀释度下给出了显著的病毒抑制，在约1/120的稀释度下具有50％的抑制。在肺中干扰素即使有，也很少——一只小鼠在1/10的稀释度下显示出了轻微的病毒抑制作用。这与经鼻接种DI病毒相反，在经鼻接种DI病毒中，干扰素在肺中激发，而在血清中没有。看其来经腹腔比经鼻接种DI病毒激发更多的干扰素——各自在第1天50％的滴度分别为1/120和1/20。在肺提取物的制剂中有约2-3倍的固有的稀释系数，但是这并不是激发的干扰素的差别的原因。
实施例16小鼠腹腔注射DI甲型流感病毒244/PR8后，血清中存在的病毒抑制活性是I型干扰素的正式鉴定
全部的I型干扰素(13种干扰素-α和1种干扰素-β蛋白)使用同样的受体，所述的受体是跨膜蛋白，其在外部域中具有干扰素结合区域。因此，其任意一个的活性可以通过针对I型干扰素受体的外部域的抗体阻止。该抗体得自R&D Systems Inc.(批号为WXBOl)是在山羊中通过使用重组小鼠I型干扰素α/β受体的细胞外区域进行免疫得到。通过使用固相的小鼠I型干扰素α/β受体和亲和层析进行IgG的纯化。干扰素的来源为实验4中通过腹腔注射DI甲型流感病毒244/PR8所诱导的血清干扰素。
前文所描述的标准干扰素生物测试使用小鼠的L细胞和塞姆利基森林病毒(SFV)，在96孔塑料板上进行。能够在5-6天中，可靠地使细胞从塑料基质上分离的SFV的最低剂量按经验确定。干扰素抑制SFV所导致的细胞病理。
小鼠的L单层使用抗体或者不使用抗体(10μg/孔)在37℃下孵育1小时，所述的抗体对于重组的小鼠I型干扰素α/β受体具有特异性。将其除去并且将含有干扰素的血清(50％的抑制终点为1/120)在1/20和1/40的稀释度下加入，并且孵育过夜，从而提供诱导抗病毒状态的时间。将培养基在次日除去并使用SFV替代。在37℃下继续孵育。将各孔每天在光学显微镜下检查由病毒所引起的细胞病变效果(c.p.e)，并在3天当所述的c.p.e为最大的时候评分。
除此之外，各个板含有病毒对照，细胞对照以及阳性的干扰素对照——商业来源的重组小鼠干扰素-β(PBL Biomedical Laboratories)。
表19(第2和第4列)显示了在1/20和1/40稀释度下的血清干扰素完全地抑制了SFV所引起的大范围内的细胞病理效应(c.p.e.)。然而，当重组小鼠I型干扰素α/β受体的抗体首先加入细胞时(第3和第5列)，最大的c.p.e明显，这标志着所述的抗体抑制了干扰素的作用，并且因此病毒的抑制剂实际上是I型的干扰素。表20证明了与我们标准的I型干扰素-β的同一块96孔板上存在的所期待的滴定。
表19.通过使用重组小鼠干扰素α/β受体预培养靶小鼠L细胞抑制小鼠血清干扰素活性
Figure BDA0000067732130000441
Na，不适用
++++c.p.e(细胞病理效应)，SFV(塞姆利基森林病毒)破坏99％的细胞单层，-c.p.e，没有细胞单层破坏；c.p.e每天进行读数并在感染之后记录3天。
表20.与表19相同的平板中干扰素-β标准的滴定
Figure BDA0000067732130000442
++++c.p.e.，破坏99％的细胞单层，-c.p.e.，没有细胞单层破坏；
在经腹腔注射了DI甲型流感病毒244/PR8的小鼠的血清中存在的SFV-抑制活性由I型干扰素受体的外部区域的抗体所抑制，因此明确地将其确定为I型干扰素。
实施例17-在细胞培养物中DI甲型流感病毒诱导I型干扰素的证明
使用了非感染性的DI和UV灭活的(iDI)病毒(参见下表22)。这些病毒全部都含有2×105血液凝集单位(HAU)/ml。将这些病毒在所标出(表22)的稀释度下接种到人类的肺细胞系(A549)中，所述的人类的肺细胞系经加工表达由干扰素的启动子活化的荧光素基因。干扰素诱导的阳性对照是新城鸡瘟病毒(NDV)(参见表21)。
表21.重复的检测中干扰素诱导的对照
Figure BDA0000067732130000451
*荧光素酶水平：NDV，新城鸡瘟病毒。
表22，由DI流感病毒诱导干扰素
Figure BDA0000067732130000452
*在第4和第6列中的荧光素酶值已经被标准化为试验2中的阳性NDV对照的值(105.9/25.25)(表1)。
**荧光素酶水平。
Nd，未进行
表22，实验1显示了DI甲型流感病毒244/PR8诱导干扰素但是无活性的DI甲型流感病毒不诱导干扰素(1.5x阴性对照)。干扰素的诱导通过滴定得到，并且干扰素由1/10DI甲型流感病毒诱导。1/100DI甲型流感病毒的数值很可能是不显著的(尽管阴性对照OD是0.17，并且DI甲型流感病毒220/PR8 #794的1/1000的数值是0.4)。
在根据NDV阳性对照诱导的干扰素进行标准化后，实验1中由DI甲型流感病毒224/PR8诱导的干扰素的量非常类似于在实验2中由DI甲型流感病毒220/Vic #792所激发的量，并且两者都高于DI甲型流感病毒220/PR8#794所产生的量，因此诱导干扰素的能力为244/PR8＝220/Vic＞220/PR8。
在实验2中，DI甲型流感病毒244/PR8 #793诱导约少2倍的干扰素(或者经规范化的值的9倍)——可能是由于储存或者冻融导致的灭活。
在干扰素刺激物(DI甲型流感病毒244/PR8，220/Vic)和非刺激物(220/PR8)之间的差别是显著的，但是难以理解，因为220/Vic和220/PR8具有同样的经克隆的DI 220 RNA。然而，244/PR8 #793和220/Vic #792的高干扰素水平与针对乙型流感病毒保护小鼠的程度具有很好的相关性。
实施例18将小鼠使用DI甲型流感病毒进行24小时的预处理与同时的处理相比，增加了针对乙型流感保护的效力的证明
在感染乙型流感/Lee/40之前24小时，或者作为与B/Lee的混合物同时地给予，将经克隆的DI甲型流感病毒244/PR8(1.2和0.12μg/小鼠)如前所述经鼻给予到浅麻醉的小鼠中。DI病毒的非特异性的效果通过将所述的DI病毒暴露于紫外线8分钟灭活来控制。将小鼠每天称重，并评定其临床疾病。在表23的数据中，第6行中的数据显示，同时给予了DI病毒和B/Lee的小鼠都生病并体重下降；尽管其受到针对更加严重的疾病(如较大的体重下降所表明的)以及死亡(第7行)的保护。通过比较，使用同样的量的有活性的DI病毒的预处理避免全部的体重下降以及几乎全部的临床疾病(第2行)。使用稀释10倍以上的有活性的DI病毒(0.1μg，第4行)预处理也针对临床疾病，其严重性提供了一些保护，并避免全部的死亡。
表23.使用DI甲型流感病毒预处理小鼠增加针对乙型流感病毒的保护效力
Figure BDA0000067732130000471
*仅有1只小鼠生病1天。
在感染3周后，向在类似的实验中存活的小鼠给予高攻击剂量的B/Lee，来测试那些未患有任意明显临床疾病的小鼠(cf表23，第2行)是否产生了常规免疫。全部均完全地受到保护，这说明确实已经由B/Lee的沉默感染对其进行了免疫(数据未显示)。

Claims (28)

1.用于预防或者治疗个体中的病毒感染或者疾病的经克隆的缺损干扰(DI)病毒，其中所述的感染或者疾病由与DI病毒来源的病毒不同的病毒引起。
2.用于预防或者治疗感染或者疾病的经克隆的缺损干扰(DI)甲型流感病毒，其中所述的感染或者疾病由甲型流感之外的病毒引起。
3.如权利要求1或者权利要求2所述的用途，其中所述的感染或者疾病由呼吸道或者全身性的病毒引起。
4.如权利要求1或者权利要求2所述的用途，其中所述的感染或者疾病由副粘病毒科的病毒引起。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述的感染或者疾病由肺炎病毒属的病毒，例如人类呼吸道合胞病毒(HRSV)引起。
6.如权利要求4所述的用途，其中所述的感染或者疾病由偏肺炎病毒属的病毒，例如人类偏肺炎病毒(HMPV)引起。
7.如权利要求1或者权利要求2中所述的用途，其中所述的病毒是正粘病毒科的病毒。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述的感染或者疾病由乙型流感病毒或者丙型流感病毒引起。
9.如权利要求1或者权利要求2所述的用途，其中所述的感染或者疾病由肝脱氧核糖核酸病毒科的病毒引起。
10.如权利要求1、2或者9中任一项所述的用途，其中所述的病毒是肝炎病毒。
11.如权利要求9或者权利要求10所述的用途，其中所述的病毒是乙型肝炎病毒(HBV)。
12.如权利要求1或者权利要求2所述的用途，其中所述的感染或者疾病由黄病毒科的病毒引起。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述的病毒是丙型肝炎病毒属的病毒。
14.如权利要求10或者权利要求12所述的用途，其中所述的病毒是丙型肝炎病毒(HCV)。
15.如权利要求1或者权利要求2所述的用途，其中所述的感染或者疾病由乳头瘤病毒科的病毒，例如乳头多瘤空泡病毒属的病毒引起。
16.如前述任一项权利要求所述的用途，其中所述的引起感染或者疾病的病毒是人类病毒。
17.如前述任一项权利要求所述的用途，其中所述的经克隆的DI病毒通过个体的鼻子和/或肺给予。
18.如权利要求1到14中任一项所述的用途，其中所述的经克隆的DI病毒经肠胃外，例如经皮下、肌内、静脉或者腹腔给予。
19.一种激发细胞、组织、器官或者人类或者动物中产生先天免疫和天然干扰素的方法，所述的方法包括将诱导干扰素的量的缺损干扰(DI)病毒给予细胞、组织、器官、人类或者动物，前提是当DI病毒给予细胞培养物中的细胞时，所述的DI病毒不是具有返折的RNA结构的RNA病毒。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述诱导干扰素的量的DI病毒在体外或者离体下给予经分离的细胞、组织或者器官。
21.如权利要求19或者权利要求20所述的方法，其中当将DI病毒给予细胞培养物中的细胞时，所述的DI病毒不是DI水泡性口咽病毒或者DI仙台病毒。
22.如权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述的DI病毒是经克隆的DI病毒。
23.一种用于在个体的人类或者动物中预防或者治疗病毒感染的方法，其包括向个体给予诱导干扰素的量的缺损干扰(DI)病毒。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述的DI病毒通过个体的鼻和/或通过肺给予。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述的DI病毒经肠胃外，例如经皮下、肌内、静脉或者腹腔给予。
26.如权利要求23所述的方法，其中在体外将所述DI病毒给予经分离的细胞、组织或者器官，并将所述的细胞、组织或者器官随后移植到所述的个体的身体中。
27.如权利要求23到26中任一项所述的方法，其中所述的病毒感染选自以下的一种或多种：
a.呼吸道或者全身性的病毒；
b.副粘病毒科的病毒；
c.肺炎病毒属的病毒，例如人类呼吸道合胞病毒(HRSV)；
d.偏肺炎病毒属的病毒，例如人类偏肺炎病毒(HMPV)；
e.正粘病毒科的病毒，例如乙型流感病毒或者丙型流感病毒；
f.肝脱氧核糖核酸病毒科的病毒，例如乙型肝炎病毒(HBV)；
g.黄病毒科的病毒，例如丙型肝炎病毒(HCV)；
h.乳头瘤病毒科的病毒，例如乳头多瘤空泡病毒属的病毒。
28.如权利要求19到27中任一项所述的方法，其中所述的DI病毒是DI流感病毒，优选地是DI甲型流感病毒，或者DI塞姆利基森林病毒。
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