CN106434405A - 玉米乳杆菌lz3及其在水产养殖中的应用 - Google Patents

玉米乳杆菌lz3及其在水产养殖中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米乳杆菌LZ3，该菌株保藏名称为Lactobacillus zeae LZ3，其保藏编号为CCTCC NO:M2015652，其具有抑制嗜水气单胞菌生长或繁殖的能力。该菌作为嗜水气单胞菌拮抗菌可以制成抑菌制剂在水产养殖中进行应用，预防嗜水气单胞菌对水产养殖对象的危害；可作为益生菌制剂，用于降解水产养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐等有害物质，改善养殖水质。

Description

玉米乳杆菌LZ3及其在水产养殖中的应用
技术领域
本发明涉及一株玉米乳杆菌、其制剂及其在抑制水产嗜水气单胞菌中的应用，属于渔业生态安全领域，用于抑制水产养殖水体中的嗜水气单胞菌，降解其水体中氨氮和亚硝酸盐等有害物质，改善水质。
背景技术
由嗜水气单胞菌感染所致的淡水鱼类细菌性败血症，又称出血病、细菌性出血病、出血性腹水病、腹水病、暴发性流行病等，1990年开始在我国广泛流行。其有四大之最：危害种类多，包括白鲢、花鲢、鲫鱼、鲤鱼、鳊鱼、罗非鱼、黄尾鲴、鲮鱼、草鱼、鲈鱼、鳜鱼等几乎所有的淡水养殖鱼类，以及蛙类和爬行类等淡水养殖对象；流行季节长，从3月到11月均有发生；流行区域广，我国各省均有流行；感染死亡率高，发病死亡率可达90％以上，甚至100％。因此，该病迄今为我国对淡水养殖对象危害最为严重的重大水生动物疫病。
目前，我国对鱼类细菌性败血症的防治主要采用口服抗生素与全池泼洒消毒剂相结合的方法。但是，使用抗生素会使养殖对象产生抗药性，并在体内形成药物积累，影响水产品质量；使用消毒剂会抑杀水中的益生菌和浮游生物，破坏水体生态平衡，影响水生植物的光合作用，造成水体缺氧，影响养殖对象生长。本研究从太湖底泥中分离到对嗜水气单胞菌抑制作用较强的菌株，并测试其了在水产养殖水体中的应用效果，为探索生物防控鱼类细菌性败血症的应用技术提供了理论依据。
发明内容
本发明目的在于提供一种益生菌——玉米乳杆菌LZ3(Lactobacillus zeaeLZ3)，该菌株可以以拮抗菌的作用有效抑制水产养殖水体中的嗜水气单胞菌，预防淡水鱼类细菌性败血症的发生。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：
一种玉米乳杆菌，其分类命名为玉米乳杆菌LZ3(Lactobacillus zeae LZ3)，其保藏编号为CCTCC NO:M2015652，其具有抑制嗜水气单胞菌生长或繁殖的能力。
本发明的另一目的在于提供一种嗜水气单胞菌拮抗菌制剂，其特征在于所述制剂包括药学上有效量的所述的玉米乳杆菌LZ3(Lactobacillus zeae LZ3)。
优选的技术方案中，所述制剂的pH为4.0-5.0，菌胞含量为1×108cfu/ml。
优选的技术方案中，所述制剂采用发酵法进行配制，其发酵条件是：以玉米乳杆菌LZ3为发酵菌株，在发酵培养基中进行发酵，发酵温度控制在28-30℃；发酵周期控制在64-70小时，且发酵液加入吐温-20和甘油作为稳定剂。
优选的技术方案中，所述发酵培养基为液体形式存在，以其组分的重量体积浓度计，包括：
蛋白胨10-80g/L；
蔗糖20-100g/L；
酵母粉1-10g/L；
其余为水。
优选的技术方案中，所述稳定剂吐温-20在发酵培养基的重量体积浓度为5-10g/L；甘油在发酵培养基的重量体积浓度为10-20g/L。
本发明的另一目的在于提供一种所述的嗜水气单胞菌抑菌制剂的制备方法，其特征在于，所述方法为发酵法，其发酵条件是：以玉米乳杆菌LZ3为发酵菌株，在发酵培养基中进行发酵，发酵温度控制在28-30℃；发酵周期控制在64-70小时，且发酵液加入吐温-20和甘油作为稳定剂。
优选的技术方案中，所述方法中发酵培养基为液体形式存在，以其组分的重量体积浓度计，包括：
蛋白胨10-80g/L；
蔗糖20-100g/L；
酵母粉1-10g/L；
其余为水。
优选的技术方案中，所述稳定剂吐温-20在发酵培养基的重量体积浓度 为5-10g/L；甘油在发酵培养基的重量体积浓度为10-20g/L。
本发明的又一目的在于提供一种所述的玉米乳杆菌制剂在抑制水产养殖水体中嗜水气单胞菌方面的应用。
本发明的又一目的在于提供一种所述的玉米乳杆菌LZ3(Lactobacillus zeaeLZ3)在制备抑制导致淡水鱼类细菌性败血症的嗜水气单胞菌的药物方面的应用。其中嗜水气单胞菌作为淡水鱼类细菌性败血症的病原菌。
本文中使用的术语“药学上有效的量”或“治疗上有效的量”或“有效量”是指具有治疗效果的量或在对象中产生治疗效果所需要的量。例如，抗生素或药物组合物的治疗上或药学上有效量是产生需要的治疗效果所需要的抗生素或药物组合物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物感染研究和/或体外研究(如在琼脂或发酵培养基中)。药学上有效量取决于几个因素，包括但不限于涉及的微生物(如细菌)、对象的特征(如身高、体重、性别、年龄和用药史)、感染的严重程度和使用的药学活性成分的特定类型。对于预防性治疗，治疗上或药学上有效量是在预防微生物(如细菌)感染中起到效果的量。
使用的微生物：
使用的玉米乳杆菌菌株，采集自太湖水域底泥，经分离培养和抑菌筛选得到，菌株代号为LZ3。此菌经鉴定，其属于玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)的成员，分类命名为玉米乳杆菌LZ3(Lactobacillus zeae LZ3)，简称LZ3，于2015年10月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015652，为嗜水气单胞菌拮抗菌菌株。
玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)是一种益生菌菌种，已应用于发酵制泡菜、果蔬制品、饲料等。
LZ3的生物学特性：
细胞杆状、单个或链状，(1.0-2.9)×(0.5-0.8)μm；G+，不运动，无芽孢，有机化能，兼性厌氧；不水解酪素和明胶，不还原硝酸盐，不产吲哚和H2S；接触酶阴性，无细胞色素；营养要求复杂，需要氨基酸、肽、盐类、脂肪酸或脂肪酸脂类和可发酵的碳水化合物；最适宜温度30～37℃，最适宜pH为5.5～6.2。发酵主要产乳酸。
微生物的培养筛选方法:
通过在琼脂培养基上打孔抑菌试验，从分离菌株中筛选出对嗜水气单胞菌抑制作用较强的拮抗菌。
相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：
本发明的目的在于提供一种嗜水气单胞菌拮抗菌制剂及其在水产养殖中的应用技术。该菌作为嗜水气单胞菌拮抗菌可以制成抑菌制剂在水产养殖中进行应用，预防嗜水气单胞菌对水产养殖对象的危害；可作为替代化学消毒剂的有益微生物制剂，用于消除养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐等有害物质，改善水质。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用属于“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件或者模块、组件和/或它们的组合。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施方式例如能够以除了在这里描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考实施例来详细说明本发明。
实施例1嗜水气单胞菌拮抗菌寻找、筛选、鉴定
(1)嗜水气单胞菌拮抗菌寻找、筛选
A)材料
嗜水气单胞菌菌株：从患细菌性败血症的鲫鱼血液分离获得菌株，经健康鲫鱼回感试验，确定其致病性；经过BBL Crystl微生物自动分析系统鉴定，确定其为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。
底泥：采自太湖网围养殖区的底泥。
培养基：胰酪胨大豆琼脂(TSA)培养基、营养肉汤(NB)培养基，从试剂公司采购。
TSA培养基的制备：称取TSA 42g，溶于1000ml蒸馏水的三角瓶中，搅拌溶解后，121℃高压蒸汽灭菌15min，然后在培养皿中倾注平板，4℃保存备用。
NB培养基的制备：称取NB 18g，溶于1000ml蒸馏水的三角瓶中，搅拌溶解后，用试管分装，121℃高压蒸汽灭菌15min，4℃保存备用。
B)嗜水气单胞菌液的制备：通过无菌操作，用接种环将嗜水气单胞菌接种到营养肉汤培养基试管中，放于36℃培养箱中培养18-20h，4℃保存备用。
C)嗜水气单胞菌拮抗菌分离筛选
1)细菌分离
通过无菌操作，用无菌生理水将采集的底泥适当稀释,然后取稀释菌液0.1ml,加入到盛有TSA培养基的培养皿中，用无菌三角玻璃棒将菌液平铺于培养基表面，置于36℃培养箱中培养48h。根据培养皿中培养菌落的大小、形状、颜色、光泽等培养特征，将菌落区分为若干类。用接种环分别挑取每一类的单个菌落接种在营养肉汤培养基试管中，36℃下培养48h，制成若干种单个分离菌株的纯培养液，并通过比浊仪测试，用无菌生理盐水将各种细菌纯培养液的含菌量调整到基本相同。
2)拮抗菌的筛选
通过无菌操作，在若干培养皿TSA培养基表面均匀涂抹嗜水气单胞菌液，之后用打孔器在每个培养皿琼脂培养基上均匀打4个直径为9mm左右的圆孔，然后分别吸取若干种分离菌的纯培养液各0.1ml，各加入到一个孔中，36℃下培养24h，根据培养基打孔周围抑菌圈的大小，确定每一类分离菌对嗜水气单胞菌的抑制效果。
通过打孔抑菌试验，从多种种分离细菌中找到3株对嗜水气单胞菌有明显抑制作用的拮抗菌，取代号为LZ3、LC7和LC8，其抑菌圈直径分别为：19.8mm、15.2mm和14.4mm，其中LZ3对嗜水气单胞菌的抑制作用最强。
(2)拮抗菌鉴定
筛选出来的对嗜水气单胞菌抑制作用最强的拮抗菌株LZ3，细胞杆状、单个或链状，(1.0-2.9)×(0.5-0.8)μm；G+，不运动，无芽孢，有机化能，兼性厌氧；不水解酪素和明胶，不还原硝酸盐，不产吲哚和H2S；接触酶阴性，无细胞色素。
经过BBL Crystl微生物自动分析系统鉴定，其属于玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)中的成员，根据鉴定结果并结合菌株号，将其命名为：玉米乳杆菌LZ3(Lactobacilluszeae LZ3)。
实施例2拮抗菌制剂(发酵剂)的试制
根据玉米乳杆菌的生物学特性，筛选出合适的培养基，并采用适当的发酵条件，将玉米乳杆菌LZ3制成发酵菌液，在加入适量的稳定剂配成一定浓度的嗜水气单胞菌拮抗菌发酵剂。
具体采用的发酵条件如下：
发酵菌株：玉米乳杆菌LZ3。
发酵培养基配方：蛋白胨10-80克，蔗糖20-100克，酵母粉1-10克，纯净水1000毫升。
发酵温度：28-30℃。
发酵周期：64-70小时。
发酵摇床转速：150-200r/min。
稳定剂：每升发酵液中吐温-20 5-10克，甘油10-20克。
根据上述发酵条件，发酵研制成的玉米乳杆菌LZ3发酵剂，其pH为4.0-5.0，菌胞含量为1×108cfu/ml。
应用例玉米乳杆菌LZ3发酵剂应用试验
选择两个锦鲤养殖池，一个用作应用试验，另一个用作对照。两者的养殖条件一致：面积3.5×666.7m2(3.5亩)，水深1.5m，放养品种锦鲤，放养规格1.5kg/尾，放养密度0.5尾/m2，日投饲量2-3％，增氧机1.5千瓦，池水溶氧保持不低于4mg/l。
于玉米乳杆菌LZ3发酵剂使用前和使用后，各分别检测试验池对照池养殖水体中的氨氮(NH3-N)、亚硝酸盐氮(NO2 --N)和嗜水气单胞菌(AH)等。
(1)用法用量：玉米乳杆菌LZ3发酵剂的使用方法采用全池泼洒，用量为1.5ppm。5月初开始使用，10天一次，连用三次。
(2)水质检测：用W-D型水产养殖水质分析仪进行水质检测，检测项目包括pH、氨氮(NH3-N)和亚硝酸盐氮(NO2 --N)。
(3)细菌检测：嗜水气单胞菌检测包括菌落计数和细菌鉴定。(1)菌落计数：取0.1mm水样涂布RSA平板(90mm培养皿)，37℃培养24h,右，计 数RSA平板上嗜水气单胞菌疑似菌落(黄色，圆形，稍凸起，大小2mm左)，疑似菌落经细菌鉴定确定后，最终计算出每毫升水样中嗜水气单胞菌活菌数。(2)细菌鉴定：疑似菌落通过BBL Crystl微生物鉴定系统进行鉴定。
(4)鱼病诊断：鱼类细菌性败血症的诊断采用病症观察、细菌分离和细菌鉴定相结合的方法。(1)病症观察：包括病鱼在水中的活动情况和鱼体的充血情况等。(2)细菌分离：病鱼血划线接种于RSA平板，37℃培养24h，观察RSA平板上分离菌落特征。(3)细菌鉴定：分离菌株通过BBL Crystl微生物鉴定系统进行鉴定。
玉米乳杆菌LZ3发酵剂在锦鲤养殖中的应用效果见表1。玉米乳杆菌LZ3发酵剂以1.5ppm全池泼洒，10天一次，连用三次后，测得试验池养殖水体中的NH3-N、NO2 --N和AH的含量分别比对照池下降了74.7％、83.3％、88.5％。
表1 LZ3发酵剂应用试验效果
试验期间，对照池一些锦鲤出现病情，病鱼离群，在水边缓慢游动；体表有点状或块状充血，口腔、鳍条基部充血尤为明显，初步诊断为细菌性败血症。及时采用二氧化氯和抗生素等药物进行治疗，病情逐步得到控制。从病鱼血液分离到菌株，其在RSA平板上生长的菌落呈黄色，圆形，稍凸起，大小约2mm；分离菌株通过人工注射感染于健康锦鲤，出现相似症状，并从人工感染锦鲤的肝脏和血液分离到菌株，其在RSA平板上生长的菌落也与前者相似。通过BBL Crystl微生物鉴定系统，前后分离菌株均鉴定确定为嗜水气单胞菌。结合病症观察和病原鉴定结果，该病最后确诊为鱼类细菌性败血症。试验池锦鲤没有发生细菌性疾病。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。 凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种玉米乳杆菌LZ3，该菌株保藏名称为Lactobacillus zeae LZ3，其保藏编号为CCTCC NO: M2015652，其具有抑制嗜水气单胞菌生长或繁殖的能力。
2.一种嗜水气单胞菌抑菌制剂，其特征在于，所述制剂包括药学上有效量的权利要求1所述的玉米乳杆菌LZ3 (Lactobacillus zeae LZ3)。
3.根据权利要求2所述的嗜水气单胞菌抑菌制剂，其特征在于，所述制剂的pH为4.0-5.0，菌胞含量为1×108 cfu/ml。
4.根据权利要求2所述的嗜水气单胞菌抑菌制剂，其特征在于，所述制剂采用发酵法进行配制，其发酵条件是：以玉米乳杆菌LZ3为发酵菌株，在发酵培养基中进行发酵，发酵温度控制在28-30℃；发酵周期控制在64-70小时，且发酵液加入吐温-20和甘油作为稳定剂。
5.根据权利要求2所述的嗜水气单胞菌抑菌制剂，其特征在于，所述发酵培养基为液体形式存在，以其组分的重量体积浓度计，包括：
蛋白胨 10-80 g/L;
蔗糖20-100 g/L；
酵母粉1-10 g/L；
其余为水。
6. 根据权利要求2所述的嗜水气单胞菌抑菌制剂，其特征在于，所述稳定剂吐温-20在发酵培养基的重量体积浓度为5-10 g/L；甘油在发酵培养基的重量体积浓度为10-20 g/L。
7.一种权利要求2所述的嗜水气单胞菌抑菌制剂的制备方法，其特征在于，所述方法为发酵法，其发酵条件是：以玉米乳杆菌LZ3为发酵菌株，在发酵培养基中进行发酵，发酵温度控制在28-30℃；发酵周期控制在64-70小时，且发酵液加入吐温-20和甘油作为稳定剂。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述方法中发酵培养基为液体形式存在，以其组分的重量体积浓度计，包括：
蛋白胨 10-80 g/L;
蔗糖20-100 g/L；
酵母粉1-10 g/L；
其余为水。
9.一种权利要求2所述的嗜水气单胞菌抑菌制剂在抑制水产品养殖水体中嗜水气单胞菌方面的应用。
10.一种权利要求1所述的玉米乳杆菌LZ3在制备抑制导致淡水鱼类细菌性败血症的嗜水气单胞菌的药物方面的作用。
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