CN106434350B - 厌氧氨氧化菌种的保藏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例提供了一种厌氧氨氧化菌种的保藏方法，包括如下步骤：培养厌氧氨氧化菌种至运行稳定；配置模拟废水；配置保藏菌液，并转移至保藏器；用氮气吹脱保藏器中的保藏菌液，使菌液中溶解氧(DO)低于0.1mg/l，调节菌液pH在7.5～7.6，接着向保藏器的顶部充入保护气体，密封保藏器；中温保藏。本方法基于厌氧氨氧化菌脱氮机理，通过在保藏过程中的气相换成一定浓度的NO气体作为保护气体，有效的抑制了保藏过程中其他脱氮菌对基质的利用，并可为厌氧氨氧化菌持续提供基质，菌种存活率高，活性损失小，生物性能保存更完整，方法简单，易于实现。

Description

厌氧氨氧化菌种的保藏方法
技术领域
本发明涉及菌种保藏技术领域，尤其涉及一种厌氧氨氧化菌种的保藏方法。
背景技术
厌氧氨氧化是一种新型生物脱氮模式，其能够在厌氧条件下以亚硝酸盐为电子受体，以氨氮为电子供体将两者转化为氮气，实现两种氮素污染物的同时脱除。由于能同时去除氨氮和亚硝氮，无须外加有机碳源，且能够改善硝化反应产酸、反硝化反应产碱均需中和的情况，其运行费用比传统生物脱氮工艺节省近40％，因此，相对与其他的生物脱氮模式，厌氧氨氧化具有明显的优势。然而，厌氧氨氧化菌生长缓慢，对氧气、pH、温度、生长基质等环境条件异常敏感，导致厌氧氨氧化工艺不易启动、容易失稳、失稳后难以恢复。
有关研究表明，部分或全部接种厌氧氨氧化污泥能够快速启动厌氧氨氧化工艺，同时，采取厌氧氨氧化污泥流加方式能够显著减小低温、有机物和有毒物质等对厌氧氨氧化工艺运行的干扰。但是，厌氧氨氧化菌倍增时间长达11～19d，细胞产率仅有0.11gVSS/gNH4+-N，培养过程中污泥易流失，因而短期内很难获得大量菌种，此外，在实际运行中，某些工业废水来源的季节性可能导致厌氧氨氧化工艺暂停运作，因此，如何高效保藏现有的厌氧氨氧化菌种是厌氧氨氧化工艺推广中技术问题。
菌种在保藏过程中活性降低的主要原因是内部细胞水解，蛋白质水解和內源呼吸，现有的保藏方法主要通过降低温度和改变与菌体直接接触的液相条件来避免或降低水解和內源呼吸对菌体造成的危害，研究发现厌氧氨氧化菌的生长温度为30～40℃，37℃时活性最高，温度降到11℃时，厌氧氨氧化活性只有37℃时活性的24％，在保藏厌氧氨氧化菌混培物时，以(NH4)2SO4作为基质对厌氧氨氧化菌活性产生的影响小，在相同温度和保藏时间的情况下，添加甘油时微生物群落反硝化活性是不加甘油时的1.5倍左右。
厌氧氨氧化菌作为浮霉菌门的一类厌氧菌，是一种新型的生物脱氮菌，其通过将NO2 --N还原为NO，进一步利用水中的NH4 +-N将NO还原成氮气，其具体的脱氮原理如下：
Figure BDA0001134435290000021
Figure BDA0001134435290000022
Figure BDA0001134435290000023
Figure BDA0001134435290000024
可以看出，NO是厌氧氨氧化(ANAMMOX)过程的中间产物，厌氧氨氧化菌通过以NH4+-N为电子供气将NO还原为联氨(N2H4)，再通过联氨脱氢酶将联氨转化为氮气排放，整个过程无需外加碳源，无二次污染物产生，脱氮彻底。
厌氧氨氧化菌是化能自养型缺氧菌，对气相条件很敏感，通常以CO2为唯一碳源，通过乙酰-CoA途径还原CO2的过程需要一定的H2分压才能顺利合成细胞物质，当氧浓度达到0.5％～2.0％空气饱和度时，厌氧氨氧化活性即被完全抑制，充氩气除氧后活性可恢复，但当氧浓度超过18％时，抑制作用则不可恢复。
现有的保藏方法主要在集中保藏温度及保藏过程中基质和保护剂等液相保藏条件的选择上，尽管气相条件对厌氧氨氧菌的生命活动有重要意义，但目前的方法未涉及到保藏过程中气相条件的优选。
发明内容
本发明的实施例提供了一种厌氧氨氧化菌种的保藏方法，以实现对厌氧氨氧化菌种进行有效的保藏。
为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案。
一种厌氧氨氧化菌种的保藏方法，包括：
在反应器中培养厌氧氨氧化菌种；
将所述厌氧氨氧化菌种和模拟废水混合配置菌种保藏液，将所述菌种保藏液放置于保藏器中存储；
用氮气吹脱所述保藏器中的菌种保藏液，使所述菌种保藏液中的溶解氧DO的浓度和pH值在设定数值范围内，再向所述保藏器的顶部充入保护气体，密封所述保藏器；
将所述保藏器在设定温度范围内保藏。
进一步地，所述的在反应器中培养厌氧氨氧化菌种包括：
将厌氧氨氧化菌种在续批式反应器SBR中运行，SBR中的温度为32±1℃，pH为7.5～8.0，溶解氧DO的浓度<0.5mg/l，SBR中添加的模拟废水包括：0.01g/L的KH2PO4、0.0056g/L的CaCl2·2H2O、1.25g/L的KHCO3、0.3g/L的MgSO4·7H2O、微量元素Ⅰ和Ⅱ各1.25mL/L，进水NO2 --N浓度为100～120mg/L，进水NH4 +-N浓度为80～100mg/L，排水比为50％，运行2设定数量个周期后所述SBR达到稳定运行期，对所述SBR通过沉淀排水后获取厌氧氨氧化菌种。
进一步地，所述微量元素Ⅰ组成为：EDTA，5g/L和FeSO4，5g/L；所述述微量元素Ⅱ组成为：EDTA，15g/L；ZnSO4·7H2O，0.43g/l；CoC12·6H2O，0.24g/l；MnCl2·4H2O，0.99g/l；CuSO4·5H2O，0.25g/l；NaMoO4·2H2O，0.22g/l；NiC12·6H2O,0.19g/l；NaSeO4 10H2O,0.21g/l；H3BO4，0.014g/l。
进一步地，所述SBR反应器的有效体积为8L，容积负荷为0.97kg/(m3·d),VSS/SS为90％。
进一步地，所述的将所述厌氧氨氧化菌种和模拟废水混合配置菌种保藏液，将所述菌种保藏液放置于保藏器中存储，包括：
将厌氧氨氧化菌种用模拟废水洗设定次数，将所述厌氧氨氧化菌种和模拟废水混合配置菌种保藏液，通过控制所述模拟废水的量使所属菌种保藏液的污泥浓度为5000～20000mg/L，将所述菌种保藏液放置于保藏器中存储，所述保藏器为玻璃或者聚乙烯材料的可密封的容器，所述模拟废水中包含满足微生物生长需求的微量元素及60mg/lNH4 +-N和80mg/L的NO2—N。
进一步地，所述的用氮气吹脱所述保藏器中的菌种保藏液，使所述菌种保藏液中的溶解氧DO的浓度和pH值在设定数值范围内，再向所述保藏器的顶部充入保护气体，密封所述保藏器，包括：
用99.99％的氮气吹脱所述保藏器中的菌种保藏液，使所述菌种保藏液中的溶解氧低于0.1mg/l，调节菌液pH在7.5～7.6；向所述保藏器的顶部充入保护气体，所述保护气体为浓度500～3000ppm的NO气体，该NO气体的平衡气为氮气或者氩气，待所述保藏器的顶部空间充满保护气体后密封保藏器，保藏器中保护气体和保藏菌的体积比不小于1。
进一步地，所述的将所述保藏器在设定温度范围内保藏，包括：
将保藏器放置在14±0.5℃条件保存，保藏过程中避免晃动。
由上述本发明的实施例提供的技术方案可以看出，本发明实施的方法基于厌氧氨氧化菌脱氮机理，通过在保藏过程中的气相换成一定浓度的NO气体作为保护气体，有效的抑制了保藏过程中其他脱氮菌对基质的利用，并可为厌氧氨氧化菌持续提供基质，可以更好地保存厌氧氨氧化菌的脱氮性能和生物性能，菌种存活率高，活性损失小，生物性能保存更完整，方法简单，易于实现。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的一种厌氧氨氧化菌保藏方法的处理流程图；
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的任一单元和全部组合。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以几个具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个实施例并不构成对本发明实施例的限定。
本发明实施例提供了一种厌氧氨氧化菌保藏方法，该方法基于厌氧氨氧化菌脱氮机理，通过将保藏过程中的气相条件替换为一定浓度的NO气体，将NO气体作为保护气体，有效的抑制了保藏过程中其他脱氮菌对基质的利用，并可为厌氧氨氧化菌持续提供基质，菌种存活率高，活性损失小，生物系能保存更完整，方法简单，易于实现。
本发明实施例提供的厌氧氨氧化菌保藏方法的处理流程如图1所示，包括如下的处理步骤：
步骤S110、培养厌氧氨氧化菌种至运行稳定
在SBR(sequencing batch reactor，续批式反应器)中培养氧氨氧化菌种，SBR中的温度为32±1℃，pH为7.5～8.0，溶解氧(DO)<0.5mg/l，SBR中添加的模拟废水包括：0.01g/L的KH2PO4、0.0056g/L的CaCl2·2H2O、1.25g/L的KHCO3、0.3g/L的MgSO4·7H2O、微量元素Ⅰ和Ⅱ各1.25mL/L，进水NO2 --N浓度为100～120mg/L，进水NH4 +-N浓度为80～100mg/L，排水比为50％，每个周期连续运行6小时，连续8个周期的出水NH4 +-N和NO2 --N的去除率都达到90％以上，反应器达到稳定运行期，此时，通过沉淀排水后获取厌氧氨氧化菌种；
上述微量元素Ⅰ组成为：EDTA，5g/L和FeSO4，5g/L；上述微量元素Ⅱ组成为：EDTA，15g/L；ZnSO4·7H2O，0.43g/l；CoC12·6H2O，0.24g/l；MnCl2·4H2O，0.99g/l；CuSO4·5H2O，0.25g/l；NaMoO4·2H2O，0.22g/l；NiC12·6H2O,0.19g/l；NaSeO4 10H2O,0.21g/l；H3BO4，0.014g/l；
步骤S120、将上述厌氧氨氧化菌种和模拟废水混合配置菌种保藏液，并转移至保藏器。
将上述厌氧氨氧化菌种和模拟废水混合配置菌种保藏液。配置之前先将厌氧氨氧化菌种用模拟废水洗3～5次，然后添加适量的模拟废水使菌种保藏液的污泥浓度(MLSS)在5000～20000mg/L，将菌种保藏液移至保藏器，保藏器为玻璃或者聚乙烯材料的可密封的容器。
步骤S130、用氮气吹脱保藏器中的保藏菌液。
用99.99％的氮气吹脱菌种保藏液，使菌种保藏液中的溶解氧(DO)低于0.1mg/l，调节菌液pH在7.5～7.6；
步骤S140、向保藏器的顶部充入保护气体。
向保藏器的顶部充入保护气体，保护气体为浓度500～3000ppm的NO气体，该类气体的平衡气为氮气或者氩气，待保藏器顶部空间充满保护气体后密封保藏器，保藏器中保护气体和保藏菌的体积比不小于1；
步骤S150、将保藏器中温保藏。
将保藏器放置在14±0.5℃条件保存，保藏过程中应尽量避免剧烈晃动。
本发明实施例中所用厌氧氨氧化菌种取自实验室SBR反应器(有效体积8L)，该反应器采用模拟废水运行，容积负荷达0.97kg/(m3·d),进水NH4+-N和NO2--N浓度分别为80mg/L和100mg/L，水力停留时间(HRT)为4h，排水比为50％,VSS(Volatile SuspendedSolids，可挥发性悬浮物)/SS(Suspended Solids，悬浮物)在90％左右，使用恒温装置控制系统温度为(32±1)℃，pH控制在7.5～8.0。
菌种保藏:8L的SBR反应器(母反应器)用32℃的不加基质的模拟废水洗涤3次后，加入基质(NH4HCO3和NO2Na)使SBR反应器内的NH4+-N浓度为60mg/l，NO2--N浓度为80mg/L，先在11个600mL的具塞玻璃瓶(1,2,3,R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8)内分别加入混匀后的母反应器泥水混合物200mL，接着再分别向11个具塞玻璃瓶中加入NO2--N和NH4+-N分别为80mg/l和60mg/l的模拟废水至充满，用99.99％的氮气吹15min，调节pH为7.7～7.8，等待沉降后向R1-R8中充入相应的气体(见表1)，利用排水法(不排污泥)使各瓶内剩余泥水体积为200mL，密封后将R1-R4在常温(14±0.5℃)下保藏,R5-R8在低温(4±0.5℃)下保藏,具体保藏方式如表1所示。对具塞玻璃瓶1,2,3中的厌氧氨氧化菌种立刻做活性测定。
表1不同保藏条件
Figure BDA0001134435290000081
注：a为10000ppmNO b为1000ppmNO c为氮气d为空气
活性检测：活性测定所用的模拟废水成分同上，pH值为7.7～7.8，在600mL的具塞玻璃瓶中加入泥水混合物200mL，再用氮气置换其中的空气15min。密封后置于32±1℃、135r/min恒温摇床中培养，每隔1.5h取样测定NO2--N和NH4+-N浓度，每个样品检测3次。
一.不同保藏条件下厌氧氨氧化菌脱氮性能
表2为不同保藏条件下菌种脱氮性能差异示意表，由表2可以看出，相同温度不同气相条件下保藏的菌种剩余活性存在明显差异，相同气相条件不同温度下保藏的菌种剩余活性也存在一定的差异。经过28d的保存，R1-R8的厌氧氨氧化活性(SAA)分别为0.073、0.269、0.192、0.145、0.114、0.147、0.167和0.134(g/gVSS·d)，活性保留率分别为23.40％，86.22％，61.54％，46.47％，36.53％，47.12％，53.53％和42.95％。对比发现，在1000ppmNO中保藏的R2、R6和在氮气中保藏的R3、R7的SAA都高于相应温度下在空气中保藏的R4、R8的SAA，在常温条件下，R2保存效果最好，其SAA是R4的2.01倍，是R8的1.86倍，其次是R3；在低温条件下，R7的保藏效果最好，其SAA是R4的1.15倍，是R8的1.25倍，其次是R6。由此可以看出，无论在无氧条件更有利于厌氧氨氧化活性污泥脱氮活性的保存，低浓度的NO可以降低保藏过程中厌氧氨氧化菌的脱氮活性损失。
表2不同保藏条件下菌种脱氮性能差异
Figure BDA0001134435290000091
二、不同保藏条件下菌种的颜色
在不同保藏方式下，厌氧氨氧化菌混培物颜色存在明显的差异。保存前的厌氧氨氧化菌混培物因富含血红素而呈砖红色，常温条件下在氮气中保藏的厌氧氨氧化菌混培物的颜色和在1000ppmNO(以氮气平衡气体)中保藏的厌氧氨氧化菌混培物的颜色相近，均变成了暗红色，在空气保存的厌氧氨氧化菌混培物大部分变成了黑色，主要是因为在有氧气存在的条件下，好氧菌会利用一部分基质，使厌氧氨氧化菌过早的处于饥饿状态，微生物在没有营养基质的情况下利用体内储存的物质维持生命活动，最终导致细菌逐步解体,颜色变黑。由以上可以看出，在无氧状态下保藏厌氧氨氧化菌种,能更好的保持菌种原有的颜色。
三、不同保藏条件下菌种的沉降性能
经过不同保藏方式保存28d后，厌氧氨氧化菌混培沉降性能也存在明显的差异，随着NO浓度的降低，沉降性能逐渐变差，R1和R5有更好的沉降性能(高的沉降速度和低的SVI)。由表3可以看出，在10000ppm条件下保存的R1和R5，它们沉降速度分别为12.56±0.69和12.20±0.83(cm/min)，SVI(Sludge Volume Index，污泥体积指数)分别为22.14和19.05mL/g，与保存前的相差不大，在氮气中保存的R3和R7也有较好的沉降性能，相较而言，在空气中保存的R4和R8菌体沉降性能恶化程度更加严重，其SVI分别达到40.31和27.45mL/g。由此可以看出，在无氧环境中能更好的保存污泥的沉降性能，在高浓度NO保存更有利于保持污泥原有的沉降性能。
表3不同保藏条件下沉降性能
Figure BDA0001134435290000101
四、不同保藏条件下菌种的f值
保藏过程中,厌氧氨氧化菌混培物f值(VSS/SS)也存在明显的差异，随着NO浓度降低,VSS/SS的值也逐渐降低。保藏前菌种f值为89.23％，由表4可以看出，保藏28d后，常温和低温条件下，VSS/SS都随保存气体中NO浓度降低呈现出下降趋势。R1和R5的VSS/SS值分别为77.30％和82.53％，而R3和R7的VSS/SS分别降到了72.56％和67.72％，降幅比较明显，由此可以看出在有NO条件下保存，能更好的保存菌种的生物性能。
表4不同保藏条件下菌种的f值
Figure BDA0001134435290000111
综上所述，本发明实施的方法基于厌氧氨氧化菌脱氮机理，通过在保藏过程中的气相换成一定浓度的NO气体作为保护气体，有效的抑制了保藏过程中其他脱氮菌对基质的利用，并可为厌氧氨氧化菌持续提供基质，可以更好地保存厌氧氨氧化菌的脱氮性能和生物性能，菌种存活率高，活性损失小，生物性能保存更完整，方法简单，易于实现。
本领域普通技术人员可以理解：附图只是一个实施例的示意图，附图中的模块或流程并不一定是实施本发明所必须的。
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于装置或系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述得比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。以上所描述的装置及系统实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的情况下，即可以理解并实施。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种厌氧氨氧化菌种的保藏方法，其特征在于，包括：
在反应器中培养厌氧氨氧化菌种；
将所述厌氧氨氧化菌种和模拟废水混合配制菌种保藏液，将所述菌种保藏液放置于保藏器中存储；
用99.99％的氮气吹脱所述保藏器中的菌种保藏液，使所述菌种保藏液中的溶解氧低于0.1mg/l，调节菌液pH在7.5～7.6；向所述保藏器的顶部充入保护气体，所述保护气体为浓度500～3000ppm的NO气体，该NO气体的平衡气为氮气或者氩气，待所述保藏器的顶部空间充满保护气体后密封保藏器，保藏器中保护气体和保藏菌液的体积比不小于1；
将所述保藏器在设定温度范围内保藏；
所述的在反应器中培养厌氧氨氧化菌种包括：
将厌氧氨氧化菌种在序批式反应器SBR中运行，SBR中的温度为32±1℃，pH为7.5～8.0，溶解氧DO的浓度<0.5mg/l，SBR中添加的模拟废水包括：0.01g/L的KH2PO4、0.0056g/L的CaCl2·2H2O、1.25g/L的KHCO3、0.3g/L的MgSO4·7H2O、微量元素Ⅰ和Ⅱ各1.25mL/L，进水NO2 --N浓度为100～120mg/L，进水NH4 +-N浓度为80～100mg/L，排水比为50％，运行设定数量个周期后所述SBR达到稳定运行期，对所述SBR通过沉淀排水后获取厌氧氨氧化菌种；所述微量元素Ⅰ组成为：EDTA，5g/L和FeSO4，5g/L；所述微量元素Ⅱ组成为：EDTA，15g/L；ZnSO4·7H2O，0.43g/l；CoC12·6H2O，0.24g/l；MnCl2·4H2O，0.99g/l；CuSO4·5H2O，0.25g/l；Na2MoO4·2H2O，0.22g/l；NiC12·6H2O,0.19g/l；Na2SeO4 10H2O,0.21g/l；H3BO3，0.014g/l。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述序批式反应器SBR的有效体积为8L，容积负荷为0.97kg/(m3·d),VSS/SS为90％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的将所述厌氧氨氧化菌种和模拟废水混合配制菌种保藏液，将所述菌种保藏液放置于保藏器中存储，包括：
将厌氧氨氧化菌种用模拟废水洗设定次数，将所述厌氧氨氧化菌种和模拟废水混合配制菌种保藏液，通过控制所述模拟废水的量使所属菌种保藏液的污泥浓度为5000～20000mg/L，将所述菌种保藏液放置于保藏器中存储，所述保藏器为玻璃或者聚乙烯材料的可密封的容器，所述模拟废水中包含满足微生物生长需求的微量元素及60mg/lNH4 +-N和80mg/L的NO2—N。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将所述保藏器在设定温度范围内保藏，包括：
将保藏器放置在14±0.5℃条件保存，保藏过程中避免晃动。
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