CN109321465A - 反硝化菌的保存方法 - Google Patents

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高卫民
骆守鹏
陶文达
崔倩倩
陈志刚
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

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Abstract

本发明公开了一种反硝化菌的保存方法。所述的方法包括下述步骤：(1)收集培养得到的反硝化菌菌体；(2)配置保藏液，其pH范围在5.5‑7之间，并维持溶解氧在4mg/L至饱和溶解氧范围；(3)步骤(1)菌体与步骤(2)保藏液于保藏容器中混合并置于室温环境保藏。与现有技术相比，本发明方法适宜于大量的反硝化菌的长期保藏，具有常温保存效果好、存活率高、不含有毒有害物质、配方简单，易于推广等优点。

Description

反硝化菌的保存方法
技术领域
本发明涉及一种菌剂保藏方法，具体涉及一种简单有效，适合大批使用的保藏反硝化菌的方法。
背景技术
总氮浓度过高会引起水体富营养化，导致藻类过量繁殖，危害生态。2018年开始，国家对污水厂排放物中总氮实施控制，对于总氮去除有了更高的要求。环境中总氮的去除主要通过微生物作用，氨氮在硝化作用下氧化生成硝酸盐，继而被反硝化菌在厌氧条件下还原生成氮气排出，从而降低水体中总氮浓度。
微生物菌种是重要的生物资源之一，具有特殊功能的微生物被分离培育后，需要保持其优良性状不变或尽可能少变化，才能长期应用于环境治理中。微生物保藏的基本原理主要是根据其生化代谢特征，人为创造条件，使微生物代谢处于减缓或休眠状态。好的菌剂保存方法不仅能够保持菌种的优良性状不退化，同时方法本身简便经济，可以在工业上推广使用。
为了能够有效地保藏微生物菌剂，需要针对菌种特性研究适宜的保藏方法。微生物的保藏可以通过不断的供给其所需的碳氮源来延长细胞寿命，也可以设置抑制因素来减缓其代谢速率，延长保藏期。专利CN108117992A的反硝化菌剂保藏方法严格限定了采用对数期菌体进行保藏，并且添加大量的碳氮源来维持微生物菌体的代谢。这种方法虽然可以效果较好，但对于后期菌剂投加，会额外地向使用体系内带进大量的有机物。对比本专利，则是采用尽可能简单、无害的抑制因素来延长反硝化菌的代谢，增加保藏时间，使用起来更加简单方便。
菌种保存有很多方法，可以通过微生物代谢抑制来延长菌剂的保存时间，但某些抑制剂具有一定的毒性。专利CN105543093A是通过添加亚硝酸盐作为抑制剂用来保存氨氮降解菌，但亚硝酸盐具有一定的致癌性，危害人类健康；专利CN102260630B和CN104357326B是分别通过添加硫酸铜或苯甲酸钠以及山梨酸钾用来菌剂保存，苯甲酸钠和山梨酸钾作为防腐剂，其本身就对微生物具有抑制作用，且作用具有光谱性，对菌剂发挥效果产生影响。低温冷藏则是通过降低微生物代谢速度来实现菌剂保藏。专利CN105543093A通过将氨氮降解菌置于0～4℃进行保存；专利CN103103143B是将硝化菌置于-20～-70℃进行冷藏保存；专利CN106967634A将序批式活性污泥菌群置于2～5℃进行低温保存。除了低温，降低水分，通过干燥也可以进行菌剂的保存。专利CN103880168B就是通过冷冻干燥机进行好氧硝化颗粒污泥的保存。虽然干燥保存效果较好，但是需要特定干燥设备，且效率偏低，难以满足大规模的生产需求。
微生物制剂和化学制剂最大的区别在于其本身为微生物菌体，具有一定的生物活性，所以其保质期长短，保藏前后菌剂的代谢活性的变化对污染治理效果具有很强的关联性。
发明内容
针对上述缺陷，本发明的目的在于提供一种操作方便，无需低温冷藏，不含有毒有害物质，适合较大量反硝化菌剂保存，菌体活性保持高，成本低廉的保存方法。
为实现上述目标，本发明反硝化菌的保存方法，包括以下步骤：
(1)收集培养得到的反硝化菌菌体；
(2)配置保藏液，其pH范围在5.5-7之间，并维持溶解氧在4mg/L至饱和溶解氧范围；
(3)步骤(1)菌体与步骤(2)保藏液于保藏容器中混合并置于室温环境保藏。
优选的，所述的保藏液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸-NaOH-盐酸缓冲液或KH2PO4-NaOH缓冲液。
优选的，所述维持溶解氧在4mg/L至饱和溶解氧范围的方法是：在所述的保蔵液中添加缓释氧药剂。
优选的，所述的缓释氧药剂为CaO2和/或MgO2，添加量为1-50g/L。
优选的，所述维持溶解氧在4mg/L至饱和溶解氧范围的方法是：通过曝气控制保藏液中溶解氧浓度。
优选的，所述的保藏液中添加有可溶性微量元素无机盐，稳定微生物菌体的酶活及细胞稳定。
优选的，所述的可溶性微量元素无机盐是Fe2+、Mg2+、Mn2+的可溶性盐,每种组分的添加量为0.01-0.1g/L。
本发明的有益效果：
1、反硝化代谢需要厌氧及兼氧环境，通过缓释氧剂或曝气，使保藏液维持一个较高溶氧状态，减弱反硝化菌的代谢速率，实现延长保质期的目的。
2、反硝化菌的代谢适宜弱碱性的环境，通过弱酸性的pH缓冲剂，将保藏液pH调控至弱酸性，以降低反硝化菌代谢速率，延长保藏时间。弱酸性pH缓冲剂以及缓释氧物质没有生物毒性，不会对菌剂以及使用目标产生危害。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式对本发明作进一步的描述。
实施例1
取实验室自主分离培养的反硝化菌菌液100mL(菌量：2.6×109cfu/ml，采用平板计数法，下同)，加入5L的方形小口塑料桶内进行保存，添加磷酸盐缓冲液4.9L，加入FeSO4，MgCl2，MnCl2各0.02g并进行不间断的曝气，维持其溶解氧在5mg/L以上。磷酸盐缓冲液的配方为：0.06mol/L的Na2HPO4添加1.9L，0.06mol/L的KH2PO4添加3L。混合液置于室温环境保存。在保存2周，1月后，分别取所保存的菌液进行平板涂布统计存活率分别为97.5％，94.7％。
实施例2
取实验室自主分离培养的反硝化菌菌液5L(菌量：2.6×109cfu/ml)，加入5L的方形小口塑料桶内进行保存，添加磷酸盐缓冲液4.9L，并加入FeCl2，MgSO4，MnCl2各0.02g，并进行不间断的曝气，维持其溶解氧在4mg/L以上。磷酸盐缓冲液的配方为：0.06mol/L的Na2HPO4添加1L，0.06mol/L的KH2PO4添加3.9L。混合液置于室温环境保存。在保存2周，1月后，分别取所保存的菌液进行平板涂布统计存活率分别为94.1％，89.0％。
实施例3
取实验室自主分离培养的反硝化菌菌液5L(菌量：2.6×109cfu/ml)，加入5L的方形小口塑料桶内进行保存，添加4.9L KH2PO4-NaOH缓冲液，加入FeSO4，MgSO4，MnCl2各0.05g并进行不间断的曝气，维持其溶解氧在8mg/L以上。KH2PO4-NaOH缓冲液配方为：0.03mol/L的K2HPO4添加4.4L，0.03mol/L的NaOH添加0.5L。混合液置于室温环境保存。在保存2周，1月后，分别取所保存的菌液进行平板涂布统计存活率分别为82.6％，78.5％。
实施例4
取实验室自主分离培养的反硝化菌菌液5L(菌量：2.6×109cfu/ml)，加入5L的方形小口塑料桶内进行保存，添加磷酸盐缓冲液4.9L，CaO2 100g，以及FeSO4，MnCl2，MgCl2各0.07g。磷酸盐缓冲液配方为：0.2mol/L的Na2HPO4添加1.4L，0.3mol/L的NaH2PO4添加3.5L。混合液置于低温环境冷藏保存。在保存2周，1月后，分别取所保存的菌液进行平板涂布统计存活率分别为91.5％，86.7％。
实施例5
取实验室自主分离培养的反硝化菌菌液5L(菌量：2.6×109cfu/ml)，加入5L的方形小口塑料桶内进行保存，添加磷酸盐缓冲液4.9L，MgO2 100g，以及FeSO4，MnCl2，MgCl2各0.04g。。磷酸盐缓冲液的配方为：0.06mol/L的Na2HPO4添加1.9L，0.06mol/L的KH2PO4添加3L。混合液搅置于室温环境保存。在保存2周，1月后，分别取所保存的菌液进行平板涂布统计存活率分别为93.6％，87.3％。

Claims (7)

1.一种反硝化菌的保存方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)收集培养得到的反硝化菌菌体；
(2)配置保藏液，其pH范围在5.5-7之间，并维持溶解氧在4mg/L至饱和溶解氧范围；
(3)步骤(1)菌体与步骤(2)保藏液于保藏容器中混合并置于室温环境保藏。
2.根据权利要求1所述的反硝化菌的保存方法，其特征在于：所述的保藏液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸-NaOH-盐酸缓冲液或KH2PO4-NaOH缓冲液。
3.根据权利要求1所述的反硝化菌的保存方法，其特征在于：所述维持溶解氧在4mg/L至饱和溶解氧范围的方法是：在所述的保蔵液中添加缓释氧药剂。
4.根据权利要求3所述的反硝化菌的保存方法，其特征在于：所述的缓释氧药剂为CaO2和/或MgO2，添加量为1-50g/L。
5.根据权利要求1所述的反硝化菌的保存方法，其特征在于：所述维持溶解氧在4mg/L至饱和溶解氧范围的方法是：通过曝气控制保藏液中溶解氧浓度。
6.根据权利要求1所述的反硝化菌的保存方法，其特征在于：所述的保藏液中添加有可溶性微量元素无机盐。
7.根据权利要求6所述的反硝化菌的保存方法，其特征在于：所述的可溶性微量元素无机盐是Fe2+、Mg2+、Mn2+的可溶性盐,每种组分的添加量为0.01-0.1g/L。
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