CN109207368A - 硝化菌剂的保存方法 - Google Patents

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骆守鹏
陶文达
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract

本发明公开了一种硝化菌的保藏方法。包括(1)收集培养得到的硝化菌菌体；(2)配置pH范围5.5‑7的保藏液，在保藏液添加硝化菌代谢抑制剂；(3)将所述的硝化菌菌体与保藏液在保藏容器中混合，并排除溶液中的溶解氧；(4)将步骤(3)装有混合液的容器置于室温环境保藏或低温冷藏。与现有技术相比，本发明方法适宜大量的硝化菌的长期保藏，具有保存效果好、存活率高、不含有毒有害物质、配方简单，易于推广等优点。

Description

硝化菌剂的保存方法
技术领域
本发明涉及一种菌剂保藏方法，具体涉及一种简单有效的硝化菌剂的保存方法。
背景技术
氨氮浓度过高不仅会引起水体富营养化，导致藻类过量繁殖，危害生态，而且氨氮具有一定的生物毒性，破坏水源，威胁人类健康。生物硝化是在有氧条件下，通过微生物作用，将水体中的氨氮不断氧化成亚硝酸盐，继而氧化为硝酸盐，从而降低水中氨氮浓度。
微生物菌种是重要的生物资源之一，具有特殊功能的微生物被分离培育后，需要保持其优良性状不变或尽可能少变化，才能长期应用于环境治理中。微生物保藏的基本原理主要是根据其生化代谢特征，人为创造条件，使微生物代谢处于减缓或休眠状态。好的菌剂保存方法不仅能够保持菌种的优良性状不退化，同时方法本身简便经济，可以在工业上推广使用。
为了能够有效地保藏微生物菌剂，需要针对菌种特性研究适宜的保藏方法。菌种保存有很多方法，低温冷藏甚至冷冻便是一种有效方法，通过降低微生物代谢速度来实现菌剂保藏，虽然使用较为广泛，但是冷藏冷冻需要专门的制冷设备，其电耗成本也较高，对于大量的菌剂保藏仍受一定限制。专利CN105543093A通过将氨氮降解菌置于0～4℃进行保存；专利CN103103143B是将硝化菌置于-20～-70℃进行冷藏保存；专利CN106967634A将序批式反应器中的活性污泥菌群置于2～5℃进行低温保存。除了冷藏冷冻的方法，冷冻或真空干燥也可以进行菌剂的保存。专利CN103880168B就是通过冷冻干燥机进行好氧硝化颗粒污泥的保存。虽然干燥保存效果较好，但是需要特定干燥设备，且效率偏低，难以满足大规模的使用需求。
除了理化方法，还可以通过微生物代谢抑制来延长菌剂的保存时间，但某些抑制剂和防腐剂具有一定的毒性。专利CN105543093A是通过添加亚硝酸盐作为抑制剂用来保存氨氮降解菌，但亚硝酸盐具有一定的致癌性，危害人类健康；专利CN102260630B和CN104357326B是分别通过添加硫酸铜或苯甲酸钠和山梨酸钾用来菌剂保存。这两种化学品属于防腐剂，其本身就会抑制微生物活性，且作用具有广谱性，防腐剂的使用也会影响菌剂的活性。
微生物制剂和化学制剂最大的区别在于其本身为微生物菌体，具有一定的生物活性。对于水处理来讲，微生物制剂的保质期时间以及质保期内的菌体的活性对污染治理效果具有很强的关联性。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种操作方便，无需冷藏，且不含有毒有害物质，适合较大量菌剂保存，菌剂活性保持高，成本低廉的硝化菌剂的保存方法。
为达到上述目的，本发明硝化菌剂的保存方法，包括以下步骤：
(1)收集培养得到的硝化菌菌体；
(2)配置pH范围5.5-7的保藏液，在保藏液添加硝化菌代谢抑制剂；
(3)将所述的硝化菌菌体与保藏液在保藏容器中混合，并排除溶液中的溶解氧；
(4)将步骤(3)装有混合液的容器置于室温环境保藏或低温冷藏。
优选的，所述的保藏液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸-NaOH-盐酸缓冲液或KH2PO4-NaOH缓冲液。
优选的，步骤(2)所述的硝化菌抑制剂为可溶性硝酸盐。
优选的，所述的可溶性硝酸盐为NH4NO3，KNO3，NaNO3，Ca(NO3)2中的一种或几种混合，添加量为0.01-2g/L。
优选的，所述的步骤3)中排除溶液中的溶解氧的步骤为：在混合液中通过混合气体曝气。
优选的，所述的混合气体由CO2、N2组成。
优选的，所述的混合气体由CO2、和惰性气体混合组成，其中惰性气体可以为He、Ne、Ar中的一种或几种。
本发明的有益效果：
1、利用硝化反应偏好弱碱性环境，利用弱酸性的环境降低硝化菌的代谢速率，延长保藏时间；
2、硝化作用会将氨氮氧化成亚硝酸盐，继而氧化成硝酸盐，添加硝酸盐可以通过底物反馈抑制作用降低硝化菌的代谢速率。相比具有致癌性的亚硝酸盐，使用硝酸盐更加安全，对人体没有危害。
3、硝化菌是好氧微生物，通过混合气体曝气排除保存液中的溶解氧，减弱其代谢速率，增加保存时间。二氧化碳不仅可以排除溶解氧，溶于水生成的碳酸也可以保持弱酸性的环境。
4、方法中采用的气体及化学品均没有生物毒性，不会对环境及菌剂本身产生危害，且均为条件性抑制。不含防腐剂，不会影响菌剂的活性。将菌剂投入正常的使用环境后，由于抑制作用物浓度的降低，硝化菌的活性便会恢复正常。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式对本发明作进一步的描述。
实施例1
取实验室自主分离培养的硝化菌菌液100mL(菌量：2.3×109cfu/ml，采用平板计数法，下同)，加入5L的方形小口塑料桶内进行保存，添加4.9L磷酸盐缓冲液，并添加0.5g的NH4NO3。磷酸盐缓冲液配方为：0.2mol/L的Na2HPO4添加1.4L，0.3mol/L的NaH2PO4添加3.5L。向混合液中通入CO2和Ar的混合气体(体积比为97:3)，曝气30分钟后，置于室温环境静置保存。在保存2周，1月后，分别取所保存的菌液进行平板涂布统计存活率分别为95.4％，91.7％。
实施例2
取实验室自主分离培养的硝化菌菌液100mL(菌量：2.3×109cfu/ml)，加入5L的方形小口塑料桶内进行保存，添加4.9L磷酸盐缓冲液，并添加0.3g的KNO3。磷酸盐缓冲液配方为：0.2mol/L的Na2HPO4添加0.5L，0.3mol/L的NaH2PO4添加4.4L。向混合液中通入CO2和N2的混合气体(体积比为9:1)，曝气20分钟后，置于室温阴凉处静置保存。在保存2周，1月后，分别取所保存的菌液进行平板涂布统计存活率分别为97.3％，90.5％。
实施例3
取实验室自主分离培养的硝化菌菌液100mL(菌量：2×109cfu/ml)，加入5L的方形小口塑料桶内进行保存，添加4.9L磷酸盐缓冲液，并添加0.2g的NH4NO3。磷酸盐缓冲液配方为：0.06mol/L的Na2HPO4添加1L，0.06mol/L的KH2PO4添加3.9L。向混合液中通入CO2气体，曝气30分钟后，置于室温阴凉处静置保存。在保存2周，1月后，分别取所保存的菌液进行平板涂布统计存活率分别为93.2％，85.5％。
实施例4
取实验室自主分离培养的硝化菌菌液100mL(菌量：2×109cfu/ml)，加入5L的方形小口塑料桶内进行保存，添加4.9L磷酸盐缓冲液，并添加0.3g的Ca(NO3)2。磷酸盐缓冲液配方为：0.06mol/L的Na2HPO4添加1.9L，0.06mol/L的KH2PO4添加3L。向混合液中通入CO2/N2/Ar的混合气体(体积比90:9：1)，曝气30分钟后，置于室温阴凉处静置保存。在保存2周，1月后，分别取所保存的菌液进行平板涂布统计存活率分别为91.2％，83.7％。
实施例5
取实验室自主分离培养的硝化菌菌液100mL(菌量：2×109cfu/ml)，加入5L的方形小口塑料桶内进行保存，添加4.9L KH2PO4-NaOH缓冲液，并添加0.5g的NH4NO3。KH2PO4-NaOH缓冲液配方为：0.03mol/L的K2HPO4添加4.4L，0.03mol/L的NaOH添加0.5L。向混合液中通入CO2/N2/He的混合气体(体积比94:5:1)，曝气30分钟后，置于室温阴凉处静置保存。在保存2周，1月后，分别取所保存的菌液进行平板涂布统计存活率分别为92.0％，85.1％。

Claims (8)

1.一种硝化菌剂的保存方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)收集培养得到的硝化菌菌体；
(2)配置pH范围5.5-7的保藏液，在保藏液添加硝化菌代谢抑制剂；
(3)将所述的硝化菌菌体与保藏液在保藏容器中混合，并排除溶液中的溶解氧；
(4)将步骤(3)装有混合液的容器置于室温环境保藏或低温冷藏。
2.根据权利要求1所述的硝化菌剂的保存方法，其特征在于：所述的保藏液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸-NaOH-盐酸缓冲液或KH2PO4-NaOH缓冲液。
3.根据权利要求1所述的硝化菌剂的保存方法，其特征在于：步骤(2)所述的硝化菌抑制剂为可溶性硝酸盐。
4.根据权利要求3所述的硝化菌剂的保存方法，其特征在于：所述的可溶性硝酸盐为NH4NO3，KNO3，NaNO3，Ca(NO3)2中的一种或几种混合，添加量为0.01-2g/L。
5.根据权利要求1所述的硝化菌剂的保存方法，其特征在于：所述的步骤3)中排除溶液中的溶解氧的步骤为：在混合液中通过混合气体曝气。
6.根据权利要求5所述的硝化菌剂的保存方法，其特征在于：所述的混合气体由CO2、N2组成。
7.根据权利要求5所述的硝化菌剂的保存方法，其特征在于：所述的混合气体由CO2、和惰性气体混合组成，其中惰性气体可以为He、Ne、Ar中的一种或几种。
8.根据权利要求5所述的硝化菌剂的保存方法，其特征在于：所述的混合气体中CO2占气体总体积的90％-99％。
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CN105543093A (zh) * 2015-12-22 2016-05-04 天津凯英科技发展有限公司 一种氨氮降解菌剂保存剂及保存方法

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汪彩华: "高效脱氮菌种保藏技术的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

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