CN106420618A - 一种由Anti‑CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种由Anti‑CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，步骤如下：将去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE‑PEG2000‑MAL超声溶解后，在蒸馏水中透析得到聚合物胶束溶液；接着离心取上清液，即得去甲斑蝥素纳米胶束；将DTT、EDTA、Anti‑CA Ⅸ分别溶于PBS缓冲溶液中制成溶液；将EDTA溶液和DTT溶液加入anti‑CA Ⅸ溶液中，静置后加入乙酸乙酯萃取得到经还原的Anti‑CA Ⅸ溶液；将去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成溶液，取溶液和经还原的Anti‑CA Ⅸ溶液置于试管中，孵化即得胶束纳米粒。本发明的胶束纳米粒可为新的抗癌药物及应用于临床提供实验依据。

Description

一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法
技术领域
本发明属于药物制剂领域，尤其涉及一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法。
背景技术
Carbonic Antibody Ⅸ是碳酸酐酶-9(carbonic anhydrase IX)的抗体。碳酸酐酶-9是一个内生性乏氧标志，在很多乏氧肿瘤中有过表达，近年来对它的研究发现，碳酸酐酶-9的表达与非小细胞肺癌(NSCLC)患者的生存期、肿瘤侵袭性等因素相关,其高表达可以作为预后不良的预测因素。碳酸酐酶-9可以作为治疗的靶点，其抗体Carbonic AntibodyⅨ已经被发现具有抗肿瘤作用，当与其它纳米制剂接合时，还可以将纳米粒靶向至碳酸酐酶-9表达的肿瘤区域，提高靶向药物的主动靶向性。
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺（1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine- Polyethylene Glycol- Maleimide ,DSPE-PEG2000-MAL）三嵌段共聚物是一类优异的生物医药材料，具有良好的生物相容性、可降解性、温敏性和易控等特性，可形成PEG在外、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺在内的核-壳结构。亲水性的PEG壳层，可改善其作为载体的生物相容性，抑制单核巨噬细胞的吸收和清除行为，从而延长药物的循环时间，影响药物的药代动力学和生物分布。二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺形成的酯链端基处于核心，可溶解脂溶性物质，将其包裹于核内，增加其水溶性。因而DSPE-PEG-MAL共聚物已用作多种药物或抗体的载体。
去甲斑蝥素（Norcantharidin,NCTD）是由鞘翅目芫菁科昆虫，即南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黄黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus 的抗癌有效成分斑蝥素去除1，2位甲基而得得小分子化合物，分子式为C8H8O4。研究表明，去甲斑蝥素通过抑制肿瘤细胞的增值，诱导细胞凋亡以及阻止细胞迁移运动等机制，发挥较强的抗肿瘤活性，且抑瘤谱广，对肺癌、肝癌、直肠癌等均有效，另外，NCTD具有刺激骨髓升高白细胞的作用，保护肝细胞，调节免疫等功能，这与多数抗癌药物骨髓抑制的不良反应相比，具有一定的优势。
发明内容
解决的技术问题：针对传统去甲斑蝥素制剂在临床应用上的缺陷，本发明提供一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，该制备方法得到的去甲斑蝥素胶束纳米粒，能够充分发挥去甲斑蝥素的抗肿瘤活性，进一步促进和推广去甲基斑蝥素在人肺腺癌治疗中的应用。
技术方案：一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，制备步骤如下：
第一步：将去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000-MAL用乙醇超声溶解后，逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中，挥发30min，倒入透析袋中，封口，在蒸馏水中透析后得到聚合物胶束溶液，所述聚合物胶束溶液中去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000-MAL的重量比为1:190～240:20～21；
第二步：将聚合物胶束溶液在4000 r·min-1条件下离心30min，取上清液，即得去甲斑蝥素纳米胶束；
第三步：将DTT溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为800 mmol/L的DTT溶液，将EDTA溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为500 mmol/L的EDTA溶液；将Anti-CA Ⅸ溶于PBS缓冲溶液中制成浓度为0.5mg/mL的Anti-CA Ⅸ溶液；
第四步：将EDTA溶液和DTT溶液加入anti-CA Ⅸ溶液中，在室温下静置2h，接着加入乙酸乙酯萃取得到经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液，其中EDTA溶液、DTT溶液和Anti-CA Ⅸ溶液的体积比为1:5:50，每次加入的乙酸乙酯的体积与anti-CA Ⅸ溶液的体积比为4:1；
第五步：将制得的去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成浓度为（5～20） mg·mL-1的去甲斑蝥素纳米胶束溶液，取去甲斑蝥素纳米胶束溶液和经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液置于一个试管中，室温条件下孵化12h，即得由Anti-CA Ⅸ修饰去甲斑蝥素胶束纳米粒，其中去甲斑蝥素纳米胶束溶液和经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液的体积比为1:1。
上述所述的第一步中逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中的速度为每隔10s加入1滴。
上述所述的第一步中在蒸馏水中透析的具体步骤为在1000mL的蒸馏水中透析24h，每4h换一次水。
上述所述的第一步中去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000-MAL的重量比为1:200:20。
上述所述的第四步中萃取的具体步骤是加入乙酸乙酯萃取5次，每次放置10min后用移液枪去除上层乙酸乙酯，同时除去游离DTT。
有益效果：本发明提供的一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，该制备方法将去甲斑蝥素制成由Carbonic Antibody Ⅸ（Anti-CA Ⅸ）修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺（DSPE-PEG-MAL）聚合物胶束纳米粒，改善了水溶性，增加了体内外稳定性，增强了主动靶向性，降低了毒副作用，可用来开发NCTD新剂型，为新的抗癌药物及应用于临床提供实验依据。
附图说明
图1为本发明的外抗肿瘤活性研究实验中的细胞生存率-药物浓度柱状图；
图2为本发明的体内抑瘤实验中的各组移植瘤生长曲线图。
具体实施方式
以下实施例中所使用的去甲斑蝥素原料药购自南京泽朗医药科技有限公司，其纯度大于98%，批号为20141206；大豆卵磷脂购自美国Avanti Polar Lipids公司；DSPE-PEG2000-MAL购自美国Avanti公司；DTT购自美国sigma公司；EDTA购自美国sigma公司；Anti-CA Ⅸ购自美国abcam公司；透析袋的截留相对分子质量为3500，Φ16mm。
实施例1
一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备步骤如下：
将5mg去甲斑蝥素、1000mg大豆卵磷脂和100mg DSPE-PEG2000-MAL用乙醇超声溶解后，以每隔10秒加入1滴的速度逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中，挥发30min，倒入透析袋中，封口，在1000mL的蒸馏水透析24h，每4h换一次水，最后将制得的聚合物胶束溶液在4000 r·min-1条件下离心30min，取上清液，即得去甲斑蝥素纳米胶束；
将DTT溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为800 mmol/L的DTT溶液，将EDTA溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为500 mmol/L的EDTA溶液；将Anti-CA Ⅸ溶于PBS缓冲溶液中制成浓度为0.5mg/mL的Anti-CA Ⅸ溶液，将4μL EDTA溶液和20μL DTT溶液加入200μL anti-CA Ⅸ溶液中，在室温下静置2h，接着加入乙酸乙酯萃取5次，每次加入800μL，每次放置10min后用移液枪去除上层乙酸乙酯，同时除去游离DTT，得到经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液；
将制得的去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成浓度为10 mg·mL-1的去甲斑蝥素纳米胶束溶液，取200μL去甲斑蝥素纳米胶束溶液和200μL经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液置于一个试管中，室温条件下孵化12h，即得由Anti-CA Ⅸ修饰去甲斑蝥素胶束纳米粒。
实施例2
一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备步骤如下：
将10mg去甲斑蝥素、1900mg大豆卵磷脂和210mg DSPE-PEG2000-MAL用乙醇超声溶解后，以每隔10秒加入1滴的速度逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中，挥发30min，倒入透析袋中，封口，在1000mL的蒸馏水透析24h，每4h换一次水，最后将制得的聚合物胶束溶液在4000r·min-1条件下离心30min，取上清液，即得去甲斑蝥素纳米胶束；
将DTT溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为800 mmol/L的DTT溶液，将EDTA溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为500 mmol/L的EDTA溶液；将Anti-CA Ⅸ溶于PBS缓冲溶液中制成浓度为0.5mg/mL的Anti-CA Ⅸ溶液，将8μL EDTA溶液和40μL DTT溶液加入400μL anti-CA Ⅸ溶液中，在室温下静置2h，接着加入乙酸乙酯萃取5次，每次加入800μL，每次放置10min后用移液枪去除上层乙酸乙酯，同时除去游离DTT，得到经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液；
将制得的去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成浓度为20 mg·mL-1的去甲斑蝥素纳米胶束溶液，取200μL去甲斑蝥素纳米胶束溶液和200μL经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液置于一个试管中，室温条件下孵化12h，即得由Anti-CA Ⅸ修饰去甲斑蝥素胶束纳米粒。
实施例3
一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备步骤如下：
将2mg去甲斑蝥素、460mg大豆卵磷脂和40mg DSPE-PEG2000-MAL用乙醇超声溶解后，以每隔10秒加入1滴的速度逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中，挥发30min，倒入透析袋中，封口，在1000mL的蒸馏水透析24h，每4h换一次水，最后将制得的聚合物胶束溶液在4000 r·min-1条件下离心30min，取上清液，即得去甲斑蝥素纳米胶束；
将DTT溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为800 mmol/L的DTT溶液，将EDTA溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为500 mmol/L的EDTA溶液；将Anti-CA Ⅸ溶于PBS缓冲溶液中制成浓度为0.5mg/mL的Anti-CA Ⅸ溶液，将2μL EDTA溶液和10μL DTT溶液加入100μL anti-CA Ⅸ溶液中，在室温下静置2h，接着加入乙酸乙酯萃取5次，每次加入800μL，每次放置10min后用移液枪去除上层乙酸乙酯，同时除去游离DTT，得到经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液；
将制得的去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成浓度为5 mg·mL-1的去甲斑蝥素纳米胶束溶液，取200μL去甲斑蝥素纳米胶束溶液和200μL经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液置于一个试管中，室温条件下孵化12h，即得由Anti-CA Ⅸ修饰去甲斑蝥素胶束纳米粒。
将实施例1制备得到的由Anti-CA Ⅸ修饰去甲斑蝥素胶束纳米粒做以下实验：
1.体外抗肿瘤活性研究实验，实验过程如下。
去甲斑蝥素是一种广谱抗肿瘤药物，对原发性肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、小鼠肉瘤S180、宫颈癌、u14皮肤癌及白血病等都具有抑制作用。我们以肺癌细胞(A549)为靶细胞，考察并比较载药胶束与去甲斑蝥素对A549的抑制作用。
采用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞生长达90%融合状态时以0.25%胰蛋白酶消化，根据实验需要接种于96孔板上。
将肿瘤细胞复苏传代，待生长状态良好时，用胰酶消化，用10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞数为5×104/mL的细胞悬液，以每孔100μL细胞悬液加100μL培养液接种于96孔板，将培养板放入培养箱，在37℃，5%CO2的条件下培养24h后实行给药。我们将实验分为四组，分别为：1.阴性对照组，只加PBS液，不加药物；2.阳性对照组(去甲斑蝥素组)，去甲斑蝥素原料药溶解在DMSO中，并用PBS缓冲液稀释，最后药物的浓度分别为：5，10，20，40，80，160和320μg·mL-1；3.NCTD nano-micelle组，用PBS液稀释载药胶束组，药物的最终浓度为：5，10，20，40，80，160和320μg·mL-1；4.anti-CA Ⅸ NCTD nano-micelle组，用PBS液稀释载药胶束组，药物的最终浓度为：5，10，20，40，80，160和320μg·mL-1。每个浓度设三个复孔。给药后将培养板放入培养箱继续培养24h，48h，72h。待完成规定的培养时间，在每个孔中加入5 mg·mL-1的MTT 20μL，继续培养4h，取出，吸尽上清液，每孔加入DMSO溶液150μL，振荡15min均匀溶解，在570nm处测定吸光度值，计算细胞生存率。
细胞生存率(%)=药物组OD/阴性对照组OD×100%，以细胞生存率为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制柱状图如图1；
从图1中可以比较载药胶束组与去甲斑蝥素组的细胞生存率；比较不同孵育时间下的细胞生存率。分别对影响细胞存活率的药物和浓度作析因分析和单向方差分析，对药物和时间作重复测量的方差分析。浓度组间具有差异（P＜0.05），载药胶束（NCTD nano-micelle和anti-CA IX nano-micelle）与游离NCTD存在显著性差异（P＜0.01），载药胶束能显著性提高药物对A549的抑制作用，并且NCTD nano-micelle与anti-CA IX NCTD nano-micelle也存在显著性差异（P＜0.01）；考察药物和时间对细胞存活率的影响，不同时间点具有显著性差异（P＜0.01）。
根据析因分析和重复测量方差分析可知，去甲斑蝥素及载药胶束对肿瘤细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖性。在药物浓度5-320μg·mL-1和药物作用时间24-72h范围内，肿瘤细胞的生存率随着药物剂量的增大及药物作用时间的延长呈下降趋势。载药胶束对肿瘤细胞的抑制作用明显优于游离药物，且anti-CA IX NCTD nano-micelle对A549的抑制率优于NCTD nano-micelle。
2. 动物体内靶向实验，实验过程如下。
体外抗肿瘤活性表明，载去甲斑蝥素的胶束能够增强药物的抗肿瘤活性。为了进一步验证载药胶束对肿瘤增强的抑制作用及NCTD nano-micelle与anti-CA IX NCTDnano-micelle的靶向差异，通过体内实验来证明。以荷瘤裸鼠为研究对象，腋下接种A549肿瘤细胞，每周测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。
2.1荷瘤裸鼠模型建立
4～6周龄健康裸鼠36只，饲养于香港浸会大学中医药学院SPF级动物房内独立送风隔离笼具中，温度：22±2℃，湿度：60%-70%，饲养所需笼具、食物、水均经过高压蒸汽灭菌处理。其中笼具、垫料每周高压灭菌两次。
将人肺腺癌细胞株A549复苏，用10%胎牛血清的DMEM培养液置37℃，5%CO2的培养箱培养，待细胞生长至80%瓶底面积时，用0.25％胰蛋白酶消化，收集细胞于离心管内，1000r·min-1离心5min，弃上清，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，用不含血清的DMEM培养液重悬细胞后用血球计数板计数，调整细胞密度为5*106/ml，用注射器接种于裸鼠腋下，0.2ml/只，每次注射前将细胞摇匀，以保证肿瘤成瘤比较均匀，接种完成后用手指轻压注射点，防止细胞外渗。所有细胞保证在两小时内接种完毕。所有操作均在无菌操作台内进行。七天后,所有裸鼠均成荷瘤鼠。
2.2体内抑瘤实验
将荷瘤鼠随机分成六组，每组六只。六组包括：（1）对照组，注射生理盐水；（2）裸药组，注射去甲斑蝥素注射剂（按1mg·kg-1）；（3）NCTD nano-micelle低剂量组（0.5mg·kg-1）；（4）NCTD nano-micelle高剂量组（1mg·kg-1）；（5）anti- CAⅨ NCTD nano-micelle低剂量组（0.5mg·kg-1）；（6）anti- CAⅨ NCTD nano-micelle高剂量组（1mg·kg-1）。接种的第二天，开始进行尾静脉注射给药，给药持续八天。从给药的第一天起，每天观察裸鼠的饮食，精神状态，用游标卡尺测肿瘤长径（a）短径（b），按公式V=ab2/2，估算肿瘤的近似体积（cm3）。绘制肿瘤生长曲线。给药结束后的第二天，将小鼠处死，剥瘤，称重。
实验期间裸鼠一般情况良好，未见死亡。处死时解剖各器官均未见转移情况。以时间(周数)为横坐标，肿瘤的体积（cm3）为纵坐标作曲线，得到各组移植瘤生长曲线见图2所示。
从图2中可以看出，在给药的前三周，对照组和所有实验组小鼠的肿瘤大小没有显著变化。从第三周开始到第八周对照组小鼠身上的肿瘤体积呈持续快速增长的趋势，到第八周，对照组小鼠的呼吸非常困难。相比而言，经碳酸酐酶Ⅸ抗体载药胶束高浓度组的小鼠肿瘤体积的变化曲线最为平缓，即使到了第八周，小鼠身上也只能见到略微突起的肿瘤块。
将小鼠处死后剥瘤，称重，并计算抑瘤率。对小鼠给药前的体重，剥瘤前体重及瘤重分别作单向方差分析和LSD多重比较，结果见下表所示（）。实验后所有小鼠的体重都不同程度的得到了增大，以生理盐水组小鼠体重变化最为显著，该组剥瘤前的小鼠平均重量达到30.2克，而经CAⅨ修饰的载药胶束高浓度组仅为25.2。比较抑瘤率发现，各组间的瘤重具有显著差异(F=54．208，P=0．000)，进行LSD多重比较，比较比较载药胶束组、NCTD组与生理盐水组有显著性差异(P=0．000)，比较载药胶束组与NCTD组有显著性差(P=O.000)，比较同剂量anti- CAⅨ NCTD nano-micelle组与NCTD nano-micelle组具有显著性差(P=0.000)。
*P＜0.05 vs 对照组p＜0.05 vs NCTD # P＜0.05 vs 同剂量的NCTD nano-micelle
SPSS分析结果显示，去甲斑蝥素对A549肿瘤的抑制作用显著，相比于裸药组，载药胶束具有更佳的肿瘤抑制作用，且载药胶束经碳酸酐酶Ⅸ抗体修饰后，抑瘤效果更明显。随着载药胶束浓度的增大，抑瘤率也增加，高浓度组的抑瘤率高达75.65%。相同剂量的载药胶束和原料药比较，载药胶束的抑瘤率更高。实验证明，去甲斑蝥素经聚合物包载后再加上碳酸酐酶Ⅸ抗体的修饰后，双重增加了其在体内的抗肿瘤作用。
以上实验将载药胶束与anti- CAⅨ通过共价键形成一种新型的主动靶向纳米制剂。anti- CAⅨ既能抑制CA IX催化活性，防止肿瘤继续恶化，又能引导载药胶束到达肿瘤组织，使胶束在肿瘤坏死区域低pH值条件下迅速解聚而实现快速释药,并将抗肿瘤药物去甲斑蝥素输送到靶器官和靶细胞，致使细胞凋亡和坏死进而使癌细胞死亡。该递药系统将去甲斑蝥素与抗体同时转递到肿瘤特异部位，既利用anti- CAⅨ能特异性与实体肿瘤部位高表达的CA IX抗原结合，缓解肿瘤组织的坏死区域，又利用去甲斑蝥素到达肿瘤组织能抑制癌细胞分裂，在提高靶向性的同时降低对正常组织的毒副作用，实现高效抗肿瘤和改善预后的双重作用。本实验结果表明，碳酸酐酶Ⅸ抗体可以充当癌症治疗药物的优良载体并且具有良好的靶向性和抗癌攻效。

Claims (6)

1.一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，其特征在于制备步骤如下：
第一步：将去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000-MAL用乙醇超声溶解后，逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中，挥发30min，倒入透析袋中，所述透析袋的截留相对分子质量3500，在蒸馏水中透析后得到聚合物胶束溶液，所述聚合物胶束溶液中去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000-MAL的重量比为1:190～240:20～21；
第二步：将聚合物胶束溶液在4000 r·min-1条件下离心30min，取上清液，即得去甲斑蝥素纳米胶束；
第三步：将DTT溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为800 mmol/L的DTT溶液，将EDTA溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为500 mmol/L的EDTA溶液；将Anti-CA Ⅸ溶于PBS缓冲溶液中制成浓度为0.5mg/mL的Anti-CA Ⅸ溶液；
第四步：将EDTA溶液和DTT溶液加入anti-CA Ⅸ溶液中，在室温下静置2h，接着加入乙酸乙酯萃取得到经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液，其中EDTA溶液、DTT溶液和Anti-CA Ⅸ溶液的体积比为1:5:50，每次加入的乙酸乙酯的体积与anti-CA Ⅸ溶液的体积比为4:1；
第五步：将制得的去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成浓度为（5～20）mg·mL-1的去甲斑蝥素纳米胶束溶液，取去甲斑蝥素纳米胶束溶液和经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液置于一个试管中，室温条件下孵化12h，即得由Anti-CA Ⅸ修饰去甲斑蝥素胶束纳米粒，其中去甲斑蝥素纳米胶束溶液和经过还原的Anti-CA Ⅸ溶液的体积比为1:1。
2.根据权利要求1所述的一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，其特征在于：所述第一步中逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中的速度为每隔10s加入1滴。
3.根据权利要求1所述的一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，其特征在于：所述第一步中在蒸馏水中透析的具体步骤为在1000mL的蒸馏水中透析24h，每4h换一次水。
4.根据权利要求1所述的一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，其特征在于：所述第一步中去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000-MAL的重量比为1:200:20。
5.根据权利要求1所述的一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，其特征在于：所述第四步中萃取的具体步骤是加入乙酸乙酯萃取5次，每次放置10min后用移液枪去除上层乙酸乙酯，同时除去游离DTT。
6.根据权利要求1所述的一种由Anti-CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，其特征在于：所述第五步中将制得的去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成浓度为10 mg·mL-1的去甲斑蝥素纳米胶束溶液。
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