CN106399107B - 一种海洋饵料微藻的保存方法 - Google Patents

一种海洋饵料微藻的保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海洋饵料微藻的保存方法，步骤1：微藻的培养，步骤1‑1：培养微藻的天然海水需沉淀、砂滤、过滤、灭菌、冷却等处理后使用；步骤1‑2微藻的初级培养：控温室恒温培养；步骤1‑3微藻的扩大培养：将初级培养的藻种培养后，采用半封闭式充气培养进行扩大培养；步骤2：微藻的浓缩，采用无机絮凝剂对扩大培养的藻液进行浓缩；步骤3：微藻的收集，收集上述步骤浓缩的微藻；步骤4：微藻的保存保存上述步骤收集的微藻，添加3‑5g/L的甘油，置于4‑5℃的冰箱内冷藏保存。本发明的有益效果，能够对微藻进行一个长时期的保存。经过保存后的微藻经过恢复后仍然具有较好的活性。

Description

一种海洋饵料微藻的保存方法
技术领域
本发明涉及一种藻类保存方法，更具体的说是涉及一种海洋饵料微藻的保存方法。
背景技术
微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富、光合利用度高的自养植物，细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等，使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。
藻类个体大小悬殊，其中，只有在显微镜下才能分辨其形态的微小藻类类群被人们称为微藻(microalgae)，故此微藻不是一个分类学上的名称。
微藻种类繁多，微藻细胞中含有：蛋白质、脂类、藻多糖、β-胡萝卜素、多种无机元素(如Cu，Fe，Se，Mn，Zn等)等高价值的营养成分和化工原料。微藻的蛋白质含量很高，是单细胞蛋白(SCP)的一个重要来源。微藻所含的维生素A、维生素E、硫氨素、核黄素、吡多醇、维生素B12、维生素C、生物素、肌醇、叶酸、泛酸钙和烟酸等增加了其作为SCP的价值。藻中类胡萝卜素含量较高，具有着色和营养的作用，可用来防治癌症、抗辐射、延缓衰老，增强机体免疫力等生理作用。化学合成均为反式的β-胡萝卜素，对人体有致癌、致畸的作用，而顺式异构体在抗癌、抗心血管疾病功能比全反式异构体高，藻粉中β-胡萝卜素含量高达14％。藻细胞中甘油含量较高，是优质的化妆品原料，也是化工、轻工和医药工业中用途极广的有机中间体。
同时，也是海产品饲养中较好的饲料。但是在当做饲料使用过程中，很难一直会有新鲜的微藻，现有技术中缺乏对于微藻保存的方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种海洋饵料微藻的保存方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种海洋饵料微藻的保存方法：
步骤1：微藻的培养
步骤1-1：培养微藻的天然海水需沉淀、砂滤、过滤、灭菌、冷却等处理后使用；
步骤1-2微藻的初级培养：控温室恒温培养；
步骤1-3微藻的扩大培养：将初级培养的藻种培养后，采用半封闭式充气培养进行扩大培养；
步骤2：微藻的浓缩
采用无机絮凝剂对扩大培养的藻液进行浓缩；
步骤3：微藻的收集
收集上述步骤浓缩的微藻；
步骤4：微藻的保存
保存上述步骤收集的微藻，添加3-5g/L的甘油，置于4-5℃的冰箱内冷藏保存。作为本发明的进一步改进，
所述步骤步骤1-2中，微藻的初级培养：微藻采用3-5L三角锥瓶在控温室恒温培养，温度为25±2℃，光照周期12∶12，每天摇藻3次。
作为本发明的进一步改进，
所述步骤1-3中，将初级培养的藻种培养7-10天后，接种到50-60L的塑料白桶，采用半封闭式充气培养，接种比例为1∶8-1∶20，光照为室外太阳光，室外温度为25±5℃。
作为本发明的进一步改进，
所述步骤2：停止对塑料白桶充气装置，添加絮凝剂后，静置沉淀。
作为本发明的进一步改进，
所述步骤2中，絮凝剂浓度为0.3-0.9g/L，絮凝时间为30-120min，微藻沉淀度为50-95％。
作为本发明的进一步改进，
所述步骤2中絮凝剂种类为聚合氯化铝、明矾、复合絮凝剂中至少一种。
作为本发明的进一步改进，
所述步骤3中，待微藻浓缩后，抽吸白桶的上清液，弃液，收集桶底部沉淀的微藻。
作为本发明的进一步改进，
所述复合絮凝剂包括下列重量份组成：
硅藻土：10份
丙烯酰胺：2份
硫酸铵：0.05份
硅酸钠：10份
丙烯基氯化二甲基硅烷：1份
烯丙胺基三甲基硅烷：1份
丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯：1份
聚合氯化铝：3份
硅藻糖：1份。
作为本发明的进一步改进，
所述复合絮凝剂包括下述方法制备：
步骤A：将硅藻土捣碎，与硅酸钠充分混合，在50℃恒温条件下保温1小时；
步骤B：将丙烯酰胺、硫酸铵、丙烯基氯化二甲基硅烷、烯丙胺基三甲基硅烷加入到保温后的混合物中，之后升高温度至120℃进行聚合，1小时；
步骤C：降温至80℃，将聚合氯化铝、丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯、硅藻糖加入，在80℃下保温1小时，得到复合絮凝剂。
本发明的有益效果，能够对微藻进行一个长时期的保存。经过保存后的微藻经过恢复后仍然具有较好的活性。
首先是步骤1中，取出作为微藻保存的载体的海水，进行初步处理，能够防止海水中的有害物质会对微藻造成损害。另外，中在控温环境下对微藻进行初级培养，使得微藻能够处于一个生长期，微藻在生产过程中会产生生长素，之后在进行扩大培养，在半封闭式充气的条件下，能够最大程度保证生长素不会被破坏，从而促使后期微藻恢复后仍然具有较好的活性。
步骤2中加入絮凝剂，使得微藻能够凝聚在一起，这样便于对微藻的收集，同时也减小了微藻的保存体积，方便运输和储藏。
而在絮凝剂上可以选用常见的聚合氯化铝和明矾。同时本申请也提供一种自制的复合絮凝剂。
复合絮凝剂，以硅藻土、丙烯酰胺、硅酸钠为主体，首先配置硅藻土与硅酸钠的混合物，在保温过程中，使得硅藻土和硅酸钠更好地混合，同时也能偶使得硅藻土和硅酸钠上的活性基团处于一个活化状态，之后加入丙烯酰胺与其发生聚合反应，同时加入丙烯基氯化二甲基硅烷、烯丙胺基三甲基硅烷作为偶联剂，使得载体上形成三维网状结构，特别是选用丙烯基氯化二甲基硅烷、烯丙胺基三甲基硅烷能够进一步保护生长素的稳定性，提高微藻的存活率。
加入聚合氯化铝之后，能够使得聚合氯化铝在80℃下能够附着在整个高分子载体上，使得絮凝效果更佳集中，同时在载体本身也具有较好的絮凝效果，这样就可以提高絮凝效果。而丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯的加入能够起到一个很好的分散剂的作用，使得在聚合前，各物料之间能够均匀混合在一起，使得聚合出来的絮凝剂在性质上能够更加均匀，同时丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯也作为一个中间媒介，参与整个聚合反应中去，能够降低整个聚合反应的温度，各通过丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯相互交联在一起。
硅藻糖本身的结构就与本发明的载体具有较好的相容性，因此加入过程后能够在短时间内分散均匀，同时海藻糖本身具有对微藻具有保护作用，能够使得微藻在经过保存供以后，长时间存放后仍然具有较好的活性。
具体实施方式
实施例一：
一种海洋饵料微藻的保存方法：
步骤1：微藻的培养
步骤1-1：培养微藻的天然海水需沉淀、砂滤、过滤、灭菌、冷却等处理后使用；
步骤1-2微藻的初级培养：控温室恒温培养；
步骤1-3微藻的扩大培养：将初级培养的藻种培养后，采用半封闭式充气培养进行扩大培养；
步骤2：微藻的浓缩
采用无机絮凝剂对扩大培养的藻液进行浓缩；
步骤3：微藻的收集
收集上述步骤浓缩的微藻；
步骤4：微藻的保存
保存上述步骤收集的微藻，添加5g/L的甘油，置于5℃的冰箱内冷藏保存。
所述步骤步骤1-2中，微藻的初级培养：微藻采用5L三角锥瓶在控温室恒温培养，温度为25±2℃，光照周期12∶12，每天摇藻3次。
所述步骤1-3中，将初级培养的藻种培养19天后，接种到50L的塑料白桶，采用半封闭式充气培养，接种比例为1∶10，光照为室外太阳光，室外温度为25±5℃。
所述步骤2：停止对塑料白桶充气装置，添加絮凝剂后，静置沉淀。
作为本发明的进一步改进，
所述步骤2中，絮凝剂浓度为0.3g/L，絮凝时间为60min，微藻沉淀度为80％。所述步骤2中絮凝剂种类为聚合氯化铝。
所述步骤3中，待微藻浓缩后，抽吸白桶的上清液，弃液，收集桶底部沉淀的微藻。
实施例二
一种海洋饵料微藻的保存方法：
步骤1：微藻的培养
步骤1-1：培养微藻的天然海水需沉淀、砂滤、过滤、灭菌、冷却等处理后使用；
步骤1-2微藻的初级培养：控温室恒温培养；
步骤1-3微藻的扩大培养：将初级培养的藻种培养后，采用半封闭式充气培养进行扩大培养；
步骤2：微藻的浓缩
采用无机絮凝剂对扩大培养的藻液进行浓缩；
步骤3：微藻的收集
收集上述步骤浓缩的微藻；
步骤4：微藻的保存
保存上述步骤收集的微藻，添加5g/L的甘油，置于5℃的冰箱内冷藏保存。
所述步骤步骤1-2中，微藻的初级培养：微藻采用5L三角锥瓶在控温室恒温培养，温度为25±2℃，光照周期12∶12，每天摇藻3次。
所述步骤1-3中，将初级培养的藻种培养19天后，接种到50L的塑料白桶，采用半封闭式充气培养，接种比例为1∶10，光照为室外太阳光，室外温度为25±5℃。
所述步骤2：停止对塑料白桶充气装置，添加絮凝剂后，静置沉淀。
作为本发明的进一步改进，
所述步骤2中，絮凝剂浓度为0.3g/L，絮凝时间为60min，微藻沉淀度为80％。所述步骤2中絮凝剂种类为明矾。
所述步骤3中，待微藻浓缩后，抽吸白桶的上清液，弃液，收集桶底部沉淀的微藻。
实施例三
一种海洋饵料微藻的保存方法：
步骤1：微藻的培养
步骤1-1：培养微藻的天然海水需沉淀、砂滤、过滤、灭菌、冷却等处理后使用；
步骤1-2微藻的初级培养：控温室恒温培养；
步骤1-3微藻的扩大培养：将初级培养的藻种培养后，采用半封闭式充气培养进行扩大培养；
步骤2：微藻的浓缩
采用无机絮凝剂对扩大培养的藻液进行浓缩；
步骤3：微藻的收集
收集上述步骤浓缩的微藻；
步骤4：微藻的保存
保存上述步骤收集的微藻，添加5g/L的甘油，置于5℃的冰箱内冷藏保存。
所述步骤步骤1-2中，微藻的初级培养：微藻采用5L三角锥瓶在控温室恒温培养，温度为25±2℃，光照周期12：12，每天摇藻3次。
所述步骤1-3中，将初级培养的藻种培养19天后，接种到50L的塑料白桶，采用半封闭式充气培养，接种比例为1∶10，光照为室外太阳光，室外温度为25±5℃。
所述步骤2：停止对塑料白桶充气装置，添加絮凝剂后，静置沉淀。
作为本发明的进一步改进，
所述步骤2中，絮凝剂浓度为0.3g/L，絮凝时间为60min，微藻沉淀度为80％。所述步骤2中絮凝剂种类为复合絮凝剂。
所述步骤3中，待微藻浓缩后，抽吸白桶的上清液，弃液，收集桶底部沉淀的微藻。
所述复合絮凝剂包括下列重量份组成：
硅藻土：10份
丙烯酰胺：2份
硫酸铵：0.05份
硅酸钠：10份
丙烯基氯化二甲基硅烷：1份
烯丙胺基三甲基硅烷：1份
丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯：1份
聚合氯化铝：3份
硅藻糖：1份。
作为本发明的进一步改进，
所述复合絮凝剂包括下述方法制备：
步骤A：将硅藻土捣碎，与硅酸钠充分混合，在50℃恒温条件下保温1小时；
步骤B：将丙烯酰胺、硫酸铵、丙烯基氯化二甲基硅烷、烯丙胺基三甲基硅烷加入到保温后的混合物中，之后升高温度至120℃进行聚合，1小时；
步骤C：降温至80℃，将聚合氯化铝、丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯、硅藻糖加入，在80℃下保温1小时，得到复合絮凝剂。
将实施例一、实施例二、实施例三中，选用的微藻为微绿球藻，分别保存1个月、3个月、半年、1年的时间后，对其进行藻类恢复试验，并记录藻液中藻密度，并计算存活率。
藻液中活藻密度采用平板藻落计数法，测定方法参考《工业微生物实验技术手册》(中国轻工业出版社，1997)。
藻类恢复方法为：
配置营养液：
硝酸铵30～150毫克
磷酸二氢钾2毫克
柠檬酸铁5毫克
海水(过滤煮沸)1000毫升。
直接将实施例中藻类放入到营养液中进行培养即可。
藻类存活率 一个月 三个月 半年 一年
实施例一 96％ 91％ 88％ 80％
实施例二 94％ 90％ 89％ 83％
实施例三 95％ 93％ 92％ 88％
本发明的有益效果，能够对微藻进行一个长时期的保存。经过保存后的微藻经过恢复后仍然具有较好的活性。
首先是步骤1中，取出作为微藻保存的载体的海水，进行初步处理，能够防止海水中的有害物质会对微藻造成损害。另外，中在控温环境下对微藻进行初级培养，使得微藻能够处于一个生长期，微藻在生产过程中会产生生长素，之后在进行扩大培养，在半封闭式充气的条件下，能够最大程度保证生长素不会被破坏，从而促使后期微藻恢复后仍然具有较好的活性。
步骤2中加入絮凝剂，使得微藻能够凝聚在一起，这样便于对微藻的收集，同时也减小了微藻的保存体积，方便运输和储藏。
而在絮凝剂上可以选用常见的聚合氯化铝和明矾。同时本申请也提供一种自制的复合絮凝剂。
复合絮凝剂，以硅藻土、丙烯酰胺、硅酸钠为主体，首先配置硅藻土与硅酸钠的混合物，在保温过程中，使得硅藻土和硅酸钠更好地混合，同时也能偶使得硅藻土和硅酸钠上的活性基团处于一个活化状态，之后加入丙烯酰胺与其发生聚合反应，同时加入丙烯基氯化二甲基硅烷、烯丙胺基三甲基硅烷作为偶联剂，使得载体上形成三维网状结构，特别是选用丙烯基氯化二甲基硅烷、烯丙胺基三甲基硅烷能够进一步保护生长素的稳定性，提高微藻的存活率。
加入聚合氯化铝之后，能够使得聚合氯化铝在80℃下能够附着在整个高分子载体上，使得絮凝效果更佳集中，同时在载体本身也具有较好的絮凝效果，这样就可以提高絮凝效果。而丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯的加入能够起到一个很好的分散剂的作用，使得在聚合前，各物料之间能够均匀混合在一起，使得聚合出来的絮凝剂在性质上能够更加均匀，同时丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯也作为一个中间媒介，参与整个聚合反应中去，能够降低整个聚合反应的温度，各通过丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯相互交联在一起。
硅藻糖本身的结构就与本发明的载体具有较好的相容性，因此加入过程后能够在短时间内分散均匀，同时海藻糖本身具有对微藻具有保护作用，能够使得微藻在经过保存供以后，长时间存放后仍然具有较好的活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种海洋饵料微藻的保存方法，其特征在于：
步骤1：微藻的培养
步骤1-1：培养微藻的天然海水需沉淀、砂滤、过滤、灭菌、冷却处理后使用；
步骤1-2微藻的初级培养：控温室恒温培养；
步骤1-3微藻的扩大培养：将初级培养的藻种培养后，采用半封闭式充气培养进行扩大培养；
步骤2：微藻的浓缩
采用复合絮凝剂对扩大培养的藻液进行浓缩；
步骤3：微藻的收集
收集上述步骤浓缩的微藻；
步骤4：微藻的保存
保存上述步骤收集的微藻，添加3-5g/L的甘油，置于4-5℃的冰箱内冷藏保存；
所述复合絮凝剂包括下列重量份组成：
硅藻土：10份
丙烯酰胺：2份
硫酸铵：0.05份
硅酸钠：10份
丙烯基氯化二甲基硅烷：1份
烯丙胺基三甲基硅烷：1份
丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯：1份
聚合氯化铝：3份
硅藻糖：1份。
2.根据权利要求1所述的一种海洋饵料微藻的保存方法，其特征在于：
所述步骤步骤1-2中，微藻的初级培养：微藻采用3-5L三角锥瓶在控温室恒温培养，温度为25±2℃，光照周期12∶12，每天摇藻3次。
3.根据权利要求2所述的一种海洋饵料微藻的保存方法，其特征在于：
所述步骤1-3中，将初级培养的藻种培养7-10天后，接种到50-60L的塑料白桶，采用半封闭式充气培养，接种比例为1∶8-1：20，光照为室外太阳光，室外温度为25±5℃。
4.根据权利要求3所述的一种海洋饵料微藻的保存方法，其特征在于：
所述步骤2：停止对塑料白桶充气装置，添加复合絮凝剂后，静置沉淀。
5.根据权利要求4所述的一种海洋饵料微藻的保存方法，其特征在于：
所述步骤2中，复合絮凝剂浓度为0.3-0.9g/L，絮凝时间为30-120min，微藻沉淀度为50- 95％。
6.根据权利要求5所述的一种海洋饵料微藻的保存方法，其特征在于：
所述步骤3中，待微藻浓缩后，抽吸白桶的上清液，弃液，收集桶底部沉淀的微藻。
7.根据权利要求6所述的一种海洋饵料微藻的保存方法，其特征在于：
所述复合絮凝剂由下述方法制备：
步骤A：将硅藻土捣碎，与硅酸钠充分混合，在50℃恒温条件下保温1小时；
步骤B：将丙烯酰胺、硫酸铵、丙烯基氯化二甲基硅烷、烯丙胺基三甲基硅烷加入到保温后的混合物中，之后升高温度至120℃进行聚合，1小时；
步骤C：降温至80℃，将聚合氯化铝、丙烯酸乙氧基乙氧基乙酯、硅藻糖加入，在80℃下保温1小时，得到复合絮凝剂。
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