CN106367513A - Loc647309在制备前列腺癌诊断制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了LOC647309或其表达产物在制备前列腺癌诊断制剂中的应用。本发明公开了一种前列腺癌的诊断制剂，所述诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片或免疫方法检测LOC647309的表达水平。本发明还公开了一种诊断前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒能够通过检测生物学样品中的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的表达水平来诊断前列腺癌。本发明公开了一种与前列腺癌相关的LOC647309 mRNA，并进一步证实该LOC647309或其表达产物在前列腺癌中表达下调。利用LOC647309检测前列腺癌不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

LOC647309在制备前列腺癌诊断制剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及人LOC647309在制备前列腺癌诊断制剂中的应用。
背景技术
前列腺癌是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一。世界范围内，前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二，在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势，且增长比欧美发达国家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95％发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。前列腺癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。在我国约80％的病人首先发现远处转移病灶才发现前列腺癌。此时，病变已达晚期，预后不良。
前列腺癌的临床诊断方式目前主要有血清前列腺特异性抗原(PSA)检测、直肠指检、直肠超声波检测、活组织病理检查等。PSA(Prostate Specific Antigen)为前列腺组织特异性抗原，由前列腺的解剖结构可知PSA通过前列腺导管进入血液和尿液中，一些病例或生理情况下PSA会进入血液中去，如前列腺炎症、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等，因此通过检测血清PSA水平来预测前列腺癌具有一定的假阳性率。从1991年开始，检测血清中PSA含量用于预测前列腺癌，含量高于4ng/mL认为是前列腺癌阳性，灵敏度79％，特异性20％-59％，平均灵敏度约33％，在浓度4-10ng/mL灰区部分，特异性是最低的，这时往往需要通过侵入性的穿刺活检进行确定，给患者带来极大痛苦及精神和经济负担。所以PSA并不能较好的作为诊断前列腺癌的标志物。直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要通过医生的食指触摸前列腺，用以发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根治的机会。但以上的方法都存在局限性。例如直肠指检的局限性主要在4个方面：(1)患者前列腺肿块不大时，易漏诊；(2)部分患者前列腺癌肿大不明显，但已属于晚期，不易根治；(3)患者直肠有疾患时不能使用此检测；(4)医生经验不足时可能有漏诊或者误诊的可能。
目前，对于中晚期前列腺癌患者，手术治疗的效果差，大多数采用药物治疗。根据不同的病情可以采用化学药物治疗、外放射治疗、放射性核素内放射治疗以及各种疗法的综合应用等。然而，放化疗药物不仅作用于肿瘤，还可以作用于肿瘤周围健康的组织，因而在杀伤肿瘤的同时，也给机体带来了很大的副作用，最终影响对肿瘤的治疗效果。
LOC647309又名GEMC1(Geminin coiled coil domain containing protein 1，染色体卷曲螺旋域包含蛋白1)是一种蛋白编码基因，位于3号染色体上，与TOPBP1相互作用，参与调节DNA修复。现研究表明，GEMC1是一种人类纤毛病亚型的候选基因，它对于脑、气管、肺和输卵管组织特有的多纤毛细胞的产生是不可或缺的。目前，还没有关于GEMC1与前列腺癌的相关报道。因此，本领域迫切需要开发早期判断前列腺癌的特异性标志物，并开发前列腺癌的靶向药物。
发明内容
为了实现前列腺癌的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供一种新的前列腺癌相关mRNA，以及该mRNA的表达产物。
本发明的目的还在于提供前列腺癌相关mRNA或其表达产物在制备前列腺癌诊断制剂中的应用。
为实现上述目的，本发明首先提供LOC647309或其表达产物在制备前列腺癌诊断制剂中的应用。
优选地，所述LOC647309包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
优选地，所述LOC647309或该mRNA的表达产物在前列腺癌组织中表达下调。
进一步地，本发明提供了一种前列腺癌的诊断制剂，所述诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片或免疫方法检测LOC647309的表达水平。
优选地，所述的荧光定量PCR方法至少包括一对特异扩增LOC647309的引物；所述基因芯片方法至少包括一条与LOC647309杂交的核酸探针。
优选地，所述的引物包括上游引物和下游引物，上游引物为SEQ ID NO:2，下游引物为SEQ ID NO:3。
优选地，所述基因芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述的LOC647309核苷酸的部分或全部序列。
优选地，所述免疫方法来检测LOC647309的表达水平。优选地，所述免疫方法为western blot、ELISA和/或胶体金检测方法。
所述ELISA法为使用ELISA检测试剂盒，所述的试剂盒包括：包被单LOC647309克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
所述胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的LOC647309单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗LOC647309单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
进一步地，本发明提供一种诊断前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒能够通过检测生物学样品中的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的表达水平来诊断前列腺癌。
优选地，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；
优选地，所述基因检测试剂盒包括用于检测SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的引物或探针；包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂；还包括人正常的前列腺组织或细胞的总RNA或DNA。
优选地，所述蛋白免疫检测试剂盒包括LOC647309蛋白的特异性抗体，作为抗体，可通过使用作为抗GEMC1(LOC647309)抗体的多克隆抗体或单克隆抗体来实施。作为抗GEMC1抗体可使用市售品的抗体，另外，也可由公知的方法制造。
进一步地，本发明提供一种治疗前列腺癌的制剂，所述制剂中含有促进LOC647309或其表达产物表达的试剂。
优选地，所述促进LOC647309表达的试剂包括促进基因转录的试剂，促进基因翻译的试剂，促进LOC647309蛋白含量提高的试剂；所述促进LOC647309表达产物的试剂包括促进LOC647309表达稳定性的试剂，促进LOC647309表达产物活性的试剂，促进LOC647309表达产物功能的试剂。
优选地，所述制剂能抑制前列腺癌细胞增殖和迁移。优选地，所述制剂用构建过表达载体的方法促进LOC647309或其表达产物的表达。
本发明的有益效果如下：
本发明公开了一种与前列腺癌相关的LOC647309，并进一步证实该LOC647309或该mRNA的表达产物在前列腺癌组织中表达下调。利用该mRNA检测前列腺癌不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1为前列腺癌组织及癌旁组织LOC647309表达情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明的发明人对前列腺癌组织样本及癌旁组织样本的mRNA进行高通量转录组测序，通过生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选mRNA LOC647309，现有研究中并没有LOC647309和前列腺癌相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了LOC647309在前列腺癌细胞中表达下调。
本发明的LOC647309是在本发明之前的已知mRNA，其基本信息如下：Genbank登录号：NCBI参考序列:NM_001146686.2，来源于人类基因组。
本发明还采用RT-PCR方法和基因芯片方法检测上述mRNA在前列腺癌组织和癌旁正常组织的表达，并验证了该mRNA在前列腺癌中表达下调。
本文使用的术语“表达下调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过前列腺癌分期确定与前列腺癌不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一基因相比，所述基因在从患前列腺癌或通过前列腺癌分期确定的前列腺癌已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平降低。根据本发明，“表达下调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达降低，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低。
实施例1高通量测序筛选差异表达基因
1、取样
取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院泌尿外科手术中获得组织标本27例，所有标本均经病理学检查证实，其中癌旁组织样本8例、前列腺癌标本19例，编号后置-80℃低温冰箱保存。
2、对组织样本进行总RNA提取
采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5分钟；
②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
3、RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
4、高通量测序
测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1，FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达LOC647309，该mRNA在前列腺癌组织样本中表达下调。
实施例2RT-PCR验证前列腺癌组织及癌旁组织LOC647309表达情况
1、材料
20例前列腺癌组织样本及8例癌旁组织样取自北京协和医院2012至2015年期间泌尿外科手术中前列腺癌样本，对其进行分组及编号。所有样本均经过病理学检查证实。
2、方法
2.1对组织样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。
2.2逆转录合成cDNA
采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。将获得的cDNA样品稀释10倍后保存在-20℃冰箱备用。
2.3Real-Time PCR
2.3.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt法进行数据相对定量分析。
2.3.2引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_001146686.2(LOC647309)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
表1引物序列
操作过程如下：
表2Real Time反应体系
组分 加入量
2×mix 10μL
上游引物(10uM) 0.5μL
下游引物(10uM) 0.5μL
模板 2μL
加入灭菌蒸馏水 至25μL
用PowerGreen PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)分别对目的基因引物和内参基因引物进行扩增。实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec)×35个循环。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。反应结束后，取5ul的PCR产物进行2％琼脂糖电泳，用快速胶回收试剂盒(invitrogen公司)将大小为220bp的片段进行切胶回收并测序，结果用blast软件进行同源性分析。
3、实验结果
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较LOC647309在前列腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中LOC647309在前列腺癌患组织中的表达水平仅为癌旁组织的35％倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析LOC647309在前列腺癌患者中表达下调的结果；RT-PCR产物经回收后，在ABI3730全自动测序仪上测序，该220bp的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用VectorNTI advance 10软件(Invitrogen公司)将该序列与LOC647309整个mRNA序列进行比对，比对结果显示，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为LOC647309基因的一部分序列，符合率为100％。
实施例3基因芯片验证前列腺癌组织及癌旁组织样本LOC647309表达情况
1、材料的取得，同实施例2。
2、总RNA的提取，同实施例1的方法。
3、基因芯片验证
总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Amhion的RNA FragmentationReagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的mRNA作为差异表达mRNA。
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著意义。结果显示，与癌旁组织样本相比，前列腺癌组织样本中LOC647309的mRNA水平仅为36％，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4前列腺癌检测试剂盒
基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述的用于前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物对如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，和特异扩增内参基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；包括SYBRGreen聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCL，2.5mMMgCL2，200mM(NH4)2SO4。
通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定反应体系如表3所示：
表3PCR反应体系
最佳反应条件为：
95℃预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。
取30例待检测前列腺癌病人的少量前列腺细胞，待检前列腺癌病人为北京协和医院泌尿科就诊前列腺癌患者。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从前列腺细胞中提取RNA，使用试剂盒中试剂，按照最佳反应体系与条件进行PCR反应，使用试剂盒中正常癌旁组织cDNA作为Real-Time PCR定量检测中的对照cDNA，检测组织样本的LOC647309相对正常癌旁组织表达量变化，分析检测结果，样本和对照间比较采用t检验，P<0.05为差异显著，判为检测样本阳性。
检测结果显示，在30例待检测病人中，有24例病人的LOC647309在前列腺细胞表达水平仅为癌旁组织中的30-40％。经临床进一步检测，该24例病人确定患有前列腺癌，其他6例没有患有前列腺癌，临床检测结果与本发明制备的试剂盒检测结果一致。据此推断，本前列腺癌的诊断试剂盒可以明确区分出前列腺癌患者，并以此为临床提供诊断线索。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.LOC647309或其表达产物在制备前列腺癌诊断制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LOC647309包括如SEQ ID NO:1所示的特异性核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LOC647309或其表达产物在前列腺癌组织中表达下调。
4.一种前列腺癌的诊断制剂，其特征在于，所述诊断制剂包括用荧光定量PCR方法、基因芯片或免疫方法检测LOC647309的表达水平。
5.如权利要求4所述的诊断制剂，其特征在于，所述的荧光定量PCR方法至少包括一对特异扩增LOC647309的引物；所述基因芯片方法至少包括一条与LOC647309杂交的核酸探针。
6.如权利要求5所述的诊断制剂，其特征在于，所述的引物包括上游引物和下游引物，上游引物为SEQ ID NO:2，下游引物为SEQ ID NO:3。
7.一种诊断前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒能够通过检测生物学样品中的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的表达水平来诊断前列腺癌。
8.一种治疗前列腺癌的制剂，其特征在于，所述制剂中含有促进LOC647309或其表达产物表达的试剂。
9.如权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述促进LOC647309表达的试剂包括促进基因转录的试剂，促进基因翻译的试剂，促进LOC647309蛋白含量提高的试剂；所述促进LOC647309表达产物的试剂包括促进LOC647309表达稳定性的试剂，促进LOC647309表达产物活性的试剂，促进LOC647309表达产物功能的试剂。
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