CN106350599A - 一种高精度指导华法林用量的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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CN106350599A CN201610959781.6A CN201610959781A CN106350599A CN 106350599 A CN106350599 A CN 106350599A CN 201610959781 A CN201610959781 A CN 201610959781A CN 106350599 A CN106350599 A CN 106350599A
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Abstract

本发明提供了一种高精度指导华法林用量的检测试剂盒，该试剂盒包括含VKORC1(1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6的扩增引物、PCR反应试剂、RFLP试剂。本发明还提供了利用上述试剂盒的检测方法。本发明能够更准确的预测患者的华法林最佳服用量，从而辅助临床医生更合理安全的使用华法林，尽快达到稳定INR值，减少用药初期的出血及血栓风险，提高治疗效果。

Description

一种高精度指导华法林用量的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高精度指导华法林用量的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
华法林是目前应用最广泛的口服抗凝药,仅口服有效，奏效慢而持久。
华法林广泛应用于预防和治疗静脉、动脉血栓栓塞性疾病。心房纤颤或心脏瓣膜机械瓣置换术后的患者需要终身服用华法林。由于其治疗窗较窄，在使用相同抗凝剂量的华法林时，可导致不同个体发生出血或血栓等严重的并发症，这主要与剂量的个体差异有关，使其临床应用受到限制，华法林用药不当所引起的不良反应,甚至能够威胁生命。
随着遗传药理学的发展，人们发现编码华法林代谢和药效的酶的基因存在遗传多态性，而且在很大程度上解释了华法林的个体差异和种族差异。以遗传药理为基础的华法林药物基因组学剂量预测方程得到越来越多的关注，2007年美国食品与药品监督管理局更新华法林的处方，推荐用药前患者接受相关基因型检测。
目前，对于华法林的检测方面，主要集中在VKORC1(-1639G/A)和CYP2C9*3(1061A/C)，如中国专利201210082350.8，但仅检测这两种基因型仅能解释大约50％的华法林用量的个体差异，精度不高。
随着研究的推进，中国专利201210003997.7提出了联用CYP2C9*3、CYP2C9*1、VKORC1-1639AG、VKORC1-1639GG和CYP4F2rs2108622TT制备相应的试剂盒并对华法林剂量进行预测的方案，并取得了较好的效果；中国专利201210196926.3提出了联用VKORC1(-1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*6、CALUrs339097制备相应试剂盒的方案；中国专利201310033313.2也提出了利用CYP2C9、VKORC1、CYP4F2、CALU和GGCX的相关基因型制备试剂盒的方案。
然而，上述试剂盒还存在精度不高，达到稳定INR值所需时间较长的缺点。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高精度指导华法林用量的检测试剂盒，该试剂盒包括含VKORC1(1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6的扩增引物、PCR反应试剂、RFLP试剂；
所述VKORC1(1639G/A)的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-TCCAGGGTTCAAGTGGTTCTC-3’
R:5’-ATTCATGCAGGGACATCTTTGG-3’；
所述CYP4F2(V433M)的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-AGTCCCGGTCATCTCCCGCCAT-3’
R:5’-CGCCAGCCTTGGAGAGACAGACA-3’；
所述GGCX rs11676382的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-GCAGAACAAGAAAGCAGGCCATCA-3’
R:5’-TCTTAGACGCCAACAAAGGCTCCA-3’；
所述CYP2C9*2的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-CACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAG-3’
R:5’-GTGATATGGAGTAGGGTCACCCAC-3’；
所述CYP2C9*3的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-TGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3’
R:5’-CTATGAATTTGGGGACTTCG-3’；
所述CYP2C9*5的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-CCTGAATTGCTACAACAAATGTGCC-3’
R:5’-ATGAATTTGGGGACTTCGAAAACA-3’；
所述CYP2C9*6的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-AGAGCTTGGTATATGGTATGTATGCT-3’
R:5’-CTTAAAGTGCTTCTCAAGCATTACTGA-3’。
所述PCR反应试剂包括高保真taq酶、Mg2+、缓冲液、ddH2O。
所述RFLP试剂包括限制性内切酶、缓冲液、ddH2O。
本发明还提供了利用上述试剂盒的检测方法，方法包括如下步骤：
(1)采集外周血2ml，EDTA抗凝，采用SnoMagTM Blood DNA Extraction Kit提取基因组DNA；
(2)利用所述扩增引物，对提取的基因组DNA进行PCR扩增；PCR反应体系为20ul：基因组DNA 1ul，2×EasyTaq PCR Super Mix 10ul，引物(F/R 10uMol)0.5ul，双蒸水8.5ul；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，共35个循环，72℃延伸5min，12℃Hold 0min；
(3)用琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)所得的扩增产物进行观察与分析，判断扩增条带是否为目的条带且明亮、清晰：分别取5ul扩增产物混合2ul 6×loading buffer依次加入2％琼脂糖凝胶的加样孔中，最后加入5ul DL500DNA Marker作为分子量标，琼脂糖凝胶以绿如蓝核酸染料为染色剂，100V稳压电泳40分钟，在凝胶成像仪中观察带型；达到要求则进行下一步，否则重复步骤(2)；
(4)以限制性内切酶MspI、PvuII、HindIII、AvaII、KpnI、AluI、MnlI分别对VKORC1(-1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6的PCR产物进行消化，体系总共10ul：PCR产物5ul，限制性内切酶0.5ul，酶对应的缓冲液1ul，ddH2O 3.5ul；37℃恒温2小时；
(5)用琼脂糖凝胶电泳对步骤(4)所得的酶切产物进行观察与分析，判断扩增条带是否为目的条带且明亮、清晰：分别取10ul酶切产物混合2ul 6×loading buffer依次加入2％琼脂糖凝胶的加样孔中，最后加入5ul DL500DNA Marker作为分子量标，琼脂糖凝胶以绿如蓝核酸染料为染色剂，100V稳压电泳40分钟，在凝胶成像仪中观察带型；
(6)将所得的VKORC1(-1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6基因型以及患者的年龄、身高、体重代入以下计算公式得出华法林最佳服用量：
＝exp(0.727-0.007×age+0.384×BSA+0.403×VKORC1 6484AG+0.554×VKORC16484AA-0.482×CYP2C9*1/*3-1.583×CYP2C9*3/*3)
式中BSA(m2)＝0.0061×height(cm)+0.0128×weight(kg)-0.1529；age单位为years；VKORC1-6484AG VKORC1-6484AA CYP2C9*1/*3、CYP2C9*3/*3是计为1，否则计为0。Exp表示自然对数(e)的指数
本发明的有益效果：
本发明能够更准确的预测患者的华法林最佳服用量，从而辅助临床医生更合理安全的使用华法林，尽快达到稳定INR值，减少用药初期的出血风险，提高治疗效果。
附图说明
图1为VKORC1(-1639G/A)多态性酶切电泳图；
图2为CYP4F2(V433M)多态性酶切电泳图；
图3为GGCX rs11676382多态性酶切电泳图；
图4为CYP2C9*2多态性酶切电泳图；
图5为CYP2C9*3多态性酶切电泳图；
图6为CYP2C9*5多态性酶切电泳图；
图7为CYP2C9*6多态性酶切电泳图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)首先采集患者外周血2ml，EDTA抗凝，采用SnoMagTM Blood DNA ExtractionKit提取基因组DNA，严格按照试剂盒说明书操作。
(2)对提取的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为20ul：基因组DNA 1ul，2×EasyTaq PCR Super Mix 10ul，引物(F/R 10uMol)0.5ul，双蒸水(ddH2O)8.5ul；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，共35个循环，72℃延伸5min，12℃Hold0min。引物序列如下：
VKORC1 F:5’-TCCAGGGTTCAAGTGGTTCTC-3’
R:5’-ATTCATGCAGGGACATCTTTGG-3’
CYP4F2 F:5’-AGTCCCGGTCATCTCCCGCCAT-3’
R:5’-CGCCAGCCTTGGAGAGACAGACA-3’
GGCX F:5’-GCAGAACAAGAAAGCAGGCCATCA-3’
R:5’-TCTTAGACGCCAACAAAGGCTCCA-3’
CYP2C9*2 F:5’-CACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAG-3’
R:5’-GTGATATGGAGTAGGGTCACCCAC-3’
CYP2C9*3 F:5’-TGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3’
R:5’-CTATGAATTTGGGGACTTCG-3’
CYP2C9*5 F:5’-CCTGAATTGCTACAACAAATGTGCC-3’
R:5’-ATGAATTTGGGGACTTCGAAAACA-3’
CYP2C9*6 F:5’-AGAGCTTGGTATATGGTATGTATGCT-3’
R:5’-CTTAAAGTGCTTCTCAAGCATTACTGA-3’
(3)用琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)所得的扩增产物进行观察与分析，判断扩增条带是否为目的条带且明亮、清晰：分别取5ul扩增产物混合2ul 6×loading buffer依次加入2％琼脂糖凝胶的加样孔中，最后加入5ul DL500DNA Marker作为分子量标，琼脂糖凝胶以绿如蓝核酸染料为染色剂，100V稳压电泳40分钟，在凝胶成像仪中观察带型。达到要求则进行下一步，否则重复步骤(2)。
(4)以限制性内切酶MspI、PvuII、HindIII、AvaII、KpnI、AluI、MnlI分别对VKORC1-1639G>A、CYP4F2V433M、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6的PCR产物进行消化，总共10ul体系：PCR产物5ul，限制性内切酶0.5ul，酶对应的缓冲液1ul，ddH2O 3.5ul；37℃恒温2小时。
(5)用琼脂糖凝胶电泳对步骤(4)所得的酶切产物进行观察与分析，判断扩增条带是否为目的条带且明亮、清晰：分别取10ul酶切产物混合2ul 6×loading buffer依次加入2％琼脂糖凝胶的加样孔中，最后加入5ul DL500DNA Marker作为分子量标，琼脂糖凝胶以绿如蓝核酸染料为染色剂，100V稳压电泳40分钟，在凝胶成像仪中观察带型。
基因型鉴定如图1～图7所示，经PCR扩增后，VKORC1-1639G>A、CYP4F2V433M、GGCXrs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6的目的片段大小分别为423bp、358bp、300bp、375bp、152bp、310bp、368bp。
根据酶切产物判断基因型，VKORC1-1639G>A的基因型有三种，野生型GG：207bp与216pb两条带，杂合子GA：423、207bp与216pb三条带，突变纯合子AA：423一条带，如图1所示(其中M：DNA Marker；泳道1：野生型GG)；
CYP4F2V433M的基因型有三种，野生型CC：150bp与208pb两条带，杂合子CT：358、150bp与208pb三条带，突变纯合子TT：423一条带，如图2所示(其中M：DNA Marker；泳道2：野生型CC)；
GGCX rs11676382的基因型有三种，野生型CC：149bp与151bp两条带，杂合子CG：300、149bp与151bp三条带，突变纯合子GG：300一条带，如图3所示(其中M：DNA Marker；泳道3：野生型CC)；
CYP2C9*2的基因型有三种，野生型CYP2C9*1/*1：79bp与296bp两条带，杂合子CYP2C9*1/*2：375bp、79bp与296bp三条带，突变纯合子CYP2C9*2/*2：375bp一条带，如图4所示(其中M：DNA Marker；泳道4：野生型CYP2C9*1/*1)；
CYP2C9*3的基因型有三种，野生型CYP2C9*1/*1：152bp一条带，杂合子CYP2C9*1/*3：152bp、134bp与18bp三条带，突变纯合子CYP2C9*3/*3：134bp与18bp两条带，如图5所示(其中M：DNA Marker；泳道5：野生型CYP2C9*1/*1)；
CYP2C9*5的基因型有三种，野生型CYP2C9*1/*1：243bp与67bp两条带，杂合子CYP2C9*1/*5：243bp、124bp、119bp与67bp四条带，突变纯合子CYP2C9*5/*5：124bp、119bp与67bp三条带，如图6所示(其中M：DNA Marker；泳道6：野生型CYP2C9*1/*1)；
CYP2C9*6的基因型有三种，野生型CYP2C9*1/*1：216bp、130bp与22bp三条带，杂合子CYP2C9*1/*6：216bp、152bp、130bp与22bp四条带，突变纯合子CYP2C9*6/*6：216bp与152bp两条带，如图7所示(其中M：DNA Marker；泳道7：突变纯合子CYP2C9*6/*6)；
(6)将所得患者的VKORC1-1639G>A、CYP4F2V433M、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6基因型以及患者的年龄、身高、体重代入以下计算公式得出患者的华法林最佳服用量：
该患者的身高为172cm，体重60kg，年龄为41岁，基因型分别为VKORC1-1639G>A：GG、CYP4F2V433M：CC、GGCX rs11676382：CC、CYP2C9*2：*1/*1、CYP2C9*3:*1/*1、CYP2C9*5:*1/*1、CYP2C9*6:*6/*6。
实验例1
根据实施例1的方法，对105位患者进行测试，未发现假阳性，说明本发明方法的敏感性和特异性均达到了100％。
实验例2
以实施例1的服药方法为实验组，以申请号为201310033313.2中国专利的方法为对照组1，以3mg的服药量为对照组2，对124名患者进行INR相关检测。其中，实验组共42名，对照组1共44名，对照组2共38名。
实验组在第3、5、7天的INR达标率为45.2％、61.9％、83.8％；对照组1在第3、5、7天的INR达标率为38.3％、50.1％、69.4％；对照组2在第3、5、7天的INR达标率为11.0％、22.7％、46.0％。
实验组首次达标的时间为4.10±1.22天；对照组1首次达标的时间为6.23±2.30天；对照组2首次达标的时间为7.55±2.69天。

Claims (4)

1.一种高精度指导华法林用量的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含VKORC1(1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6的扩增引物、PCR反应试剂、RFLP试剂；
所述VKORC1(1639G/A)的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-TCCAGGGTTCAAGTGGTTCTC-3’
R:5’-ATTCATGCAGGGACATCTTTGG-3’；
所述CYP4F2(V433M)的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-AGTCCCGGTCATCTCCCGCCAT-3’
R:5’-CGCCAGCCTTGGAGAGACAGACA-3’；
所述GGCX rs11676382的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-GCAGAACAAGAAAGCAGGCCATCA-3’
R:5’-TCTTAGACGCCAACAAAGGCTCCA-3’；
所述CYP2C9*2的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-CACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAG-3’
R:5’-GTGATATGGAGTAGGGTCACCCAC-3’；
所述CYP2C9*3的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-TGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3’
R:5’-CTATGAATTTGGGGACTTCG-3’；
所述CYP2C9*5的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-CCTGAATTGCTACAACAAATGTGCC-3’
R:5’-ATGAATTTGGGGACTTCGAAAACA-3’；
所述CYP2C9*6的扩增引物的核苷酸序列为：
F:5’-AGAGCTTGGTATATGGTATGTATGCT-3’
R:5’-CTTAAAGTGCTTCTCAAGCATTACTGA-3’。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括高保真taq酶、Mg2+、缓冲液、ddH2O。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RFLP试剂包括限制性内切酶、缓冲液、ddH2O。
4.一种利用如权利要求1-3任一项所述的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)采集外周血2ml，EDTA抗凝，采用SnoMagTM Blood DNA Extraction Kit提取基因组DNA；
(2)利用所述扩增引物，对提取的基因组DNA进行PCR扩增；PCR反应体系为20ul：基因组DNA 1ul，2×EasyTaq PCR Super Mix 10ul，引物(F/R 10uMol)0.5ul，双蒸水8.5ul；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，共35个循环，72℃延伸5min，12℃Hold 0min；
(3)用琼脂糖凝胶电泳对步骤(2)所得的扩增产物进行观察与分析，判断扩增条带是否为目的条带且明亮、清晰：分别取5ul扩增产物混合2ul 6×loading buffer依次加入2％琼脂糖凝胶的加样孔中，最后加入5ul DL500DNA Marker作为分子量标，琼脂糖凝胶以绿如蓝核酸染料为染色剂，100V稳压电泳40分钟，在凝胶成像仪中观察带型；达到要求则进行下一步，否则重复步骤(2)；
(4)以限制性内切酶Mspl、Pvull、Hindlll、Avall、Kpnl、Alul、Mnll分别对VKORC1(-1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6的PCR产物进行消化，体系总共10ul：PCR产物5ul，限制性内切酶0.5ul，酶对应的缓冲液1ul，ddH2O 3.5ul；37℃恒温2小时；
(5)用琼脂糖凝胶电泳对步骤(4)所得的酶切产物进行观察与分析，判断扩增条带是否为目的条带且明亮、清晰：分别取10ul酶切产物混合2ul 6×loading buffer依次加入2％琼脂糖凝胶的加样孔中，最后加入5ul DL500DNA Marker作为分子量标，琼脂糖凝胶以绿如蓝核酸染料为染色剂，100V稳压电泳40分钟，在凝胶成像仪中观察带型；
(6)将所得的VKORC1(-1639G/A)、CYP4F2(V433M)、GGCX rs11676382、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5、CYP2C9*6基因型以及患者的年龄、体重代入以下计算公式得出华法林最佳服用量：
＝exp(0.727-0.007×age+0.384×BSA+0.403×VKORC1 6484AG+0.554×VKORC1 6484AA-0.482×CYP2C9*1/*3-1.583×CYP2C9*3/*3)
式中BSA(m2)＝0.0061×height(cm)+0.0128×weight(kg)-0.1529：age单位为years；VKORC1-6484 AG VKORC1-6484AA CYP2C9*1/*3、CYP2C9*3/*3是计为1，否则计为0。Exp表示自然对数(e)的指数。
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