CN106338497A - 一种表面等离子体共振显微成像装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种面等离子体共振显微成像装置，其中，光源、物镜、CCD相机组成SPR显微成像光路，通过在物镜与相机中间设置PS分光镜，通过PS分光镜将光分成S光和P光，并在CCD相机上分开成像；还可以使用移动平台控制待测样品的移动可以降低背景噪音的干扰，可以较大程度的改善基线的平稳程度，从而可以获得清晰的纳米粒子信号。这两种方法可以改善SPR成像过程中光源波动和机械的整体噪声导致信噪比较低的问题，以及由于光学元件瑕疵，光的干涉等光路问题导致成像背景不均匀从而对实验观察和测量纳米粒子变化造成影响的问题。

Description

一种表面等离子体共振显微成像装置及方法

技术领域

本发明属于仪器设备领域，具体涉及一种SPR显微成像装置及方法。

背景技术

表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是指金属表面存在的自由振动电子在一定条件下被光激发，吸收光的能量发生共振的物理光学过程。

当光线从光密介质照射到光疏介质，在入射角大于某个特定的角度(临界角)时，会发生全反射(Total Internal Reflected，TIRF)现象，如图1所示。入射光和介质表面法线构成入射面，入射光波的电场可分解成两个相互正交的偏振光分量，一个为在入射面内的横磁波，将其称为TM波或p偏振波；另一个为垂直于入射面，与界面平行的横电波，将其称为TE波或s偏振波。入射光一部分发生反射形成反射光，另一部分则穿透金属表面形成折射波，沿着垂直于界面的方向按指数衰减，又称为消失波(Evanescent wave)。消失波在光疏介质中其有效穿透深度一般为100～200nm。其衰减的物理原因是因为导体内存在自由电子，在电磁波的作用下导体内出现诱导电流，产生焦耳热，消耗了电磁波的能量，因而振幅减弱。波的衰减方向总是与界面垂直，与入射波的方向无关，但是穿透深度与入射波的方向有关系。

如果在两种介质界面之间存在几十纳米的金属薄膜(一般为50nm左右的金膜)，那么全反射时产生的消失波的p偏振分量波将会进入金属薄膜。与金属薄膜中的自由电子相互作用，激发出沿金属薄膜表面传播的表面等离子体波(Surface Plasmon Wave，SPW)。而s偏振光由于电场方向与界面平行，不会激发产生表面等离子体。当入射光的角度或波长到某一特定值时，入射光的大部分会转换成表面等离子体波的能量，从而使全反射的反射光能量突然下降，在反射谱上出现共振吸收峰，此时入射光的角度或波长称为的共振角或共振波长，如图2所示。

电磁波发生共振的条件是两个波具有相同的频率和波矢。首先入射光和表面等离子体都属于电磁波。平面单色电磁波从一种媒质入射到另一种媒质频率不发生变化，因而消失波的频率等于入射波频率。由于消失波激发而产生的表面等离子体有着与消失波的相同频率，若表面等离子体与入射光在X轴方向上的分量具有相同的波矢，则二者将发生共振。

SPR的共振角或共振波长与金属薄膜表面的性质密切相关，通常情况下，采用一定厚度的金膜作为传感界面，在金膜厚度、激发光波长等参数固定的情况下，发生表面等离子体共振时的入射角(SPR角)由传感界面附近的介电常数决定。如果在金薄膜表面附着被测物质(一般为溶液或者生物分子)或附近溶液的浓度发生改变，会引起金属薄膜表面折射率的变化，从而光学信号发生改变。这使其成为一种折射率传感器，根据这个信号，就可以获得被测物质的折射率或浓度等信息，进而发展成为一种监测表面反应过程的生物化学传感器。

然而，现有的SPR成像装置如图4所示，在成像过程中光源波动和机械的整体噪声导致信噪比较低，以及由于光学元件瑕疵，光的干涉等光路问题使得成像背景不均匀，对实验观察和测量纳米粒子变化造成影响的问题。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种SPR显微成像方法，可以有效地SPR成像过程中光源波动和机械的整体噪声的影响。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种SPR显微成像装置，其中，光源、物镜、CCD相机组成SPR显微成像光路，其特征在于，在物镜与相机中间设置有PS分光镜，通过PS分光镜将光分成S光和P光，并在CCD相机上分开成像；因为SPR现象仅发生在P光，故实验信号发生在P光，而光源和机械引起的噪声在P光和S光处同时存在，将P光的信号减去S光处的背景可以减去光源和机械引起的噪声，提炼出更纯净的实验信号；还包括移动平台，用于控制待测样品的移动，也可以达到去光源和机械引起的背景噪声的影响。

优选地，所述移动平台为压电陶瓷平移台或电动移动平台。更优选地，所述的移动平台为压电陶瓷平移台。压电陶瓷平移台是一种可以精确稳定控制移动的压电平移台，比起一般的电动平台，该平台具有高精度，无回程差，高可靠性，重复精度可达到几纳米等优点。

本发明进一步提出了一种SPR显微成像方法，包括如下步骤：

(1)在现有的SPR显微成像装置的显微镜和CCD相机之间安装PS分光镜，调整PS分光镜使得P光成像和S光成像分别在CCD芯片的两端，调整PS分光镜的偏振片的位置使得P光和S光成像的亮度大致相等，然后记录实验过程中P光成像与S光成像的变化。由于SPR现象仅发生在P光，故实验信号发生在P光，而光源和机械等引起的噪声在P光和S光处同时存在，将选定区域的P光的信号减去S光处的背景可以减去光源和机械引起的噪声；

(2)利用移动平台减去背景对实验观察和测量的影响，其中：

当纳米粒子比较少的情况下，控制移动平台在两点之间重复跳跃，两点的距离在10微米左右，使纳米粒子在两个位置时信号不要互相干扰即可；用相机记录该过程，并通过数据处理，用纳米粒子在B处的图像减去A位置的图像，重复跳跃n次，就可以得到n张图片组成的已减掉背景的图像，如果纳米粒子在该过程中发生变化，就可以得到无背景干扰的信号变化曲线；

当纳米粒子较多时，信号互相交错，此时控制移动平台进行由内至外的螺旋式移动，这样移动可以使界面中的背景和纳米粒子尽可能均等的经过每一个像素，其中，纳米粒子的信号使得像素的信号变亮或变暗，而背景的信号相对稳定，经过这样的移动过程，对每一个像素的信号取中位数可以较好的抵消纳米粒子的信号对该像素的影响而保留背景的信号对像素的影响。记录移动过程，然后对每一个像素取中位数，这样可以保留背景噪声对像素数值的影响而尽量减小纳米粒子信号对像素的影响，得到一张背景图，用实验记录的图像减去该背景图，就可以得到近乎只有纳米粒子信号的图像。

其中，所述移动平台为压电陶瓷平移台或电动移动平台。优选地，所述移动平台为压电陶瓷平移台。当使用电动移动平台时，需要尽量减小台子在多次移动中造成的机械抖动。

有益效果：与现有技术相比，本发明的SPR显微成像装置可以降低信噪比，同时可以较大程度的改善基线的平稳程度，从而可以获得清晰的纳米粒子信号，解决SPR成像过程中光源波动和机械的整体噪声导致信噪比较低的问题以及由于光学元件瑕疵，光的干涉等光路问题使得成像背景不均匀，对实验观察和测量纳米粒子变化造成影响的问题。

附图说明

图1为表面等离子共振物理模型；

图2为SPR吸收谱图；

图3为Kretschmann型的示意图；

图4为现有的SPR显微成像装置的原理示意图；

图5为本发明的SPR显微成像装置的原理示意图；

图6为PS分光棱镜分光示意图，其中圆圈代表S光，箭头代表P光；

图7为PS光在CCD芯片分别成像示意图；

图8为PS光实际成像示意图；

图9采用中位数去背景法时的移动轨迹示意图；

图10为采用P光减S光处理前后信噪比的示意图，其中，作图为处理前，右图为处理后；

图11为采用重复跳跃法处理SPR显微图像的前后对比图，其中，左图为处理前，有图为处理后；

图12为采用重复跳跃法处理SPR显微图像信号变化图，其中，干扰较大的为处为理前的示意图，较为平稳的为处理后的图；

图13.1左侧的图为原始图像，右侧为对图像黑线处做像素的距离和强度图；

图13.2为取中位数后得到的图像(左)和强度图(右)；

图13.3为为采用中位数去背景法后(原始图像减去背景后得到的图像)的图像和强度图。

具体实施方式

本发明在传统的SPR显微成像光路的基础上，设计了一种由光源(light source)、物镜(objective)，压电陶瓷平移台(piezo stage)、PS分光镜(beam spliter)和CCD相机组合而成的体系，主要是在现有的SPR显微成像装置中增加了压电陶瓷平移台和PS分光镜。其结构图如图5所示。

通过在显微镜与相机中间添加一分光器件PS分光镜(beam spliter)，通过分光棱镜将光分成S光和P光，在相机上分开成像，因为SPR现象仅发生在P光，故实验信号发生在P光，而光源和机械等引起的噪声在P光和S光处同时存在，将P光的信号减去S光处的背景可以减去光源和机械引起的噪声，得到出更纯粹的实验信号。

其中，PS分光棱镜示意图如图6所示。经PS分光镜分光后，在CCD相机上分别成像，如图7和图8分别为PS光在CCD芯片分别成像示意图以及实际成像示意图。

本发明的工作过程如下：

将PS分光镜安装至显微镜与CCD相机中间，调整至水平，调整分光镜使得P光成像和S光成像分别在CCD芯片的两端，调整偏振片的位置使得P光和S光成像的亮度大致相等，然后记录实验过程中P光成像与S光成像的变化。将选定区域的P光的信号减去S光处的背景可以减去光源和机械引起的噪声；

压电陶瓷平移台是一种可以精确稳定控制移动的压电平移台，比起一般的电动平台，该平台具有高精度，无回程差，高可靠性，重复精度可达到几纳米等优点。在本实验中，引入压电陶瓷平移台(piezo stage)的主要目的是为了减去背景对实验观察和测量的影响。为了达到减去背景的目的，根据不同的实验条件，我们使用了以下两种办法。

(1)重复跳跃法：

在纳米粒子比较少的情况下，我们可以控制piezo stage在A、B两点之间重复跳跃，两点的距离大约在10微米左右，使纳米粒子在两个位置时信号不要互相干扰即可。

用相机记录该过程，并通过数据处理用纳米粒子在B处的图像减去A位置的图像，重复跳跃n次，就可以得到n张图片组成的已减掉背景的图像，如果纳米粒子在该过程中发生变化，那我们就可以得到无背景干扰的信号变化曲线。

(2)中位数去背景法：

当纳米粒子较多时，信号互相交错，不适合用上一种方法减背景，我们可以控制piezo stage进行如下图9所示的移动，记录移动过程，然后对每一个像素取中位数，这样可以保留背景噪声对像素数值的影响而尽量减小纳米粒子信号对像素的影响，得到一张背景图，用实验记录的图像减去该背景图，就可以得到近乎只有纳米粒子信号的图像。

通过使用本发明的SPR显微成像装置，可以达到如下技术效果：

一、降低信噪比：

在CdS光刻蚀实验中，CdS纳米粒子在高功率的红光照射下会发生光刻蚀，SPR信号表现为强度降低，但由于光源噪声较大，所以信号变化不甚明显(如图10左所示)，用P光信号减去S光信号，就可得到较明显的强度降低的信号(如图10右所示)。

二、基线平稳：

基线的平稳对实验也非常重要，下图表为测量未发生反应时，纳米粒子上信号的相对标准偏差变化。由图表可知，采取本方法对基线的平稳程度有较大改善。

上述表格比较了两种光源两种采样条件在加入PS分束镜前后光强稳定性的变化。本实验采用Thorlabs DET100A/M硅探测器探测各种条件下光源的光强，并把光信号转换为电压信号，通过计算电压信号的相对标准偏差可以比较不同条件下光的稳定性。其中，每栏的第一个数字代表加入分束镜前的光电压信号的相对标准偏差，第二个数字代表加入分束镜后，用P光部分减去S光部分后的光电压信号的相对标准偏差。由图表可知，在不同光源，不同采样条件的条件下，加入PS分束镜均可较好地改善光的稳定性，而基线的稳定性很大程度取决于光源的稳定性。

三、降低背景干扰：

当纳米粒子比较少的情况下，采用重复跳跃法降低背景干扰。图11为采用重复跳跃法处理SPR显微图像的对比图，其中，左图为处理前，有图为处理后，从图中可以看出，通过重复跳跃法处理后，可以得到无背景干扰的信号变化曲线，如图12所示。

当纳米粒子较多时，信号互相交错，不适合用上一种方法减背景，采用中位数去背景法降低背景干扰，如图13.1～13.3所示，图13.1左侧的图为原始图像，右侧为用ImageJ软件对图像黑线处做像素的距离和强度图，从而可以很直观的比较纳米粒子的信号和背景噪声的信噪比。如果背景噪声较大，纳米粒子的信号会掩盖在噪声中，而背景噪声被减掉之后可以很清楚的看到纳米粒子和背景的区别。从图中可以看出，背景光强不均使得纳米粒子的信号较模糊；图13.2为取中位数后得到的图像(左)和强度图(右)，图13.3为采用中位数去背景法后(原始图像减去背景后得到的图像)的图像和强度图，结果表明，采用中位数去背景法后纳米粒子的信号清晰。

Claims (4)

1.一种表面等离子体共振显微成像装置，其中，光源、物镜、CCD相机组成表面等离子共振显微成像光路，其特征在于，在物镜与相机中间设置有PS分光镜，通过PS分光镜将光分成S光和P光，并在CCD相机上分开成像；还包括移动平台，用于控制待测样品的移动。

2.根据权利要求1所述的表面等离子体共振显微成像装置，其特征在于，所述移动平台为压电陶瓷平移台或电动移动平台。

3.一种表面等离子体共振显微成像方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在现有的SPR显微成像装置的显微镜和CCD相机之间安装PS分光镜，调整PS分光镜使得P光成像和S光成像分别在CCD芯片的两端，调整PS分光镜的偏振片的位置使得P光和S光成像的亮度大致相等，然后分别记录实验过程中P光成像与S光成像。由于SPR现象仅发生在P光，故实验信号发生在P光，而光源和机械等引起的噪声在P光和S光处同时存在，将选定区域的P光的信号减去S光处的背景可以减去光源和机械引起的噪声；

(2)利用移动平台减去背景对实验观察和测量的影响，其中：

当纳米粒子比较少的情况下，控制移动平台在A、B两点之间重复跳跃，两点的距离在10微米左右，使纳米粒子在两个位置时信号不要互相干扰即可；用相机记录该过程，并通过数据处理用纳米粒子在B处的图像减去A位置的图像，重复跳跃n次，就可以得到n张图片组成的已减掉背景的图像，如果纳米粒子在该过程中发生变化，就可以得到无背景干扰的信号变化曲线；

当纳米粒子较多时，信号互相交错，此时控制移动平台进行由内至外的螺旋式移动，记录移动过程，然后对每一个像素取中位数，这样可以保留背景噪声对像素数值的影响而尽量减小纳米粒子信号对像素的影响，得到一张背景图，用实验记录的图像减去该背景图，就可以得到近乎只有纳米粒子信号的图像。

4.根据权利要求3所述的显微成像方法，其特征在于，所述移动平台为压电陶瓷平移台或电动移动平台。