CN101660997A - 一种降低背景干扰的表面等离子共振传感器及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在表面等离子共振检测中，能够消除样品背景层影响的表面等离子共振检测器件结构及检测方法。该结构根据不同金属材料的表面等离子共振的产生条件及对被检测物变化的灵敏度不同的原理，在同一个检测器件上，集成了两种或两种以上能激发表面等离子的传感层，同时对同一待测样品进行检测，并分别得到响应，从而实现对于待测样品的标签层与背景层变化的响应的区分，起到了消除背景层干扰的作用。本发明能够在简单的结构下对样品进行精确检测，避免了待测样品背景层的干扰，增加了检测系统的精度和可靠性。此外，本发明的检测器件设计和加工简单，体积小，便于实际应用，也便于集成化、小型化。

Description

一种降低背景干扰的表面等离子共振传感器及其检测方法

技术领域

本发明涉及传感器及传感技术领域，具体涉及实现表面等离子共振检测的器件结构和相应检测方法。

背景技术

表面等离子是沿着金属和电介质间界面传播的由金属表面电荷的集体振荡形成的振动模式。表面等离子波存在于两种介电常数符号相反(一般为金属与电介质)的介质界面上，并沿金属表面传播。准直光束中垂直于介质表面的波矢分量激发金属表面电子振荡形成倏逝波，当光束平行于介质界面的波矢分量与表面等离子波的传播常数匹配时，光束能量就能通过倏逝波耦合进入介质界面形成表面等离子波，反射光能量减弱。当准直光束满足一定波长和入射角度条件时，光束耦合进入表面等离子波的能量比例最大，反射光能量最弱，同时相位产生延迟，形成表面等离子共振(SPR)，此时产生表面等离子共振的光波波长称为共振波长，光波入射角度称为共振角度，同时在反射光强的响应曲线上看到一个反射光强度衰减的尖峰，这个尖峰称为共振吸收峰。

当金属附近物质的折射率、厚度等参数发生改变时，相应引起表面等离子波的传播常数的变化，进而导致光波与表面等离子波的耦合特性变化，表现为耦合共振条件的改变，如共振角度、共振波长、强度、相位的变化。利用这些条件的变化来检测待测物的物理参数变化，是表面等离子共振传感器形成的基础。根据所测量的光波参数的不同，表面等离子共振传感器检测技术分为角度、波长、强度或者相位测量。

因为表面等离子共振效应对附着在金属薄膜表面的介质折射率等物理属性非常敏感，表面等离子共振技术近年来成为生化检测的热门测量手段，在生物分子相互作用、药物筛选、临床诊断、食物检测及环境监控、生物学等领域得到广泛应用。

表面等离子共振为实现特异性检测通常需要使用标签分子。标签分子通过物理或化学作用在金属薄膜表面形成标签层。标签分子与被检测物具有特异性的分子识别特征。当被检测物经过金属薄膜表面时，标签分子与被检测物即可通过分子间相互作用(如氢键、配位键、范德华力等)形成特异性吸附，从而改变标签层的折射率或厚度，进而反映为表面等离子共振共振条件的改变，形成表面等离子共振的特异性响应，实现表面等离子共振的特异性检测。除去表面等离子共振检测过程中的特异性响应，还存在表面等离子共振的非特异性响应。这是由于表面等离子波是一种倏逝波，该波的振幅随着离开金属界面距离的增加而呈指数衰减，在表面等离子共振检测中，距离金属界面1μm左右的物质特性对表面等离子共振效应都有一定影响。由于通常标签层的厚度都比较小，即使吸附了待测物质的标签层其厚度也不过50-200nm，因此，表面等离子共振响应信号也会受到标签层以外的缓冲溶液的因素影响，例如缓冲溶液温度的起伏，缓冲溶液成分、浓度的变化，非标签分子的吸附。由这些变化引起的表面等离子共振响应统称为表面等离子共振的非特定响应。待测样品分层结构见图1，这里将缓冲溶液称为背景层。

在表面等离子共振实际测量中，背景层对测量结果的影响不能忽视。有时背景层的非特定响应甚至大于标签层的特定响应，从而使得表面等离子共振测量系统无法区分表面等离子共振条件的改变是由何种响应引起的，对检测的结果影响非常大。因此，如何消除背景层的影响是实际表面等离子共振系统中必须考虑解决的问题之一。目前，采用的解决方法有：

(1)实验中维持背景层条件稳定不变。通过采用同种缓冲液，并尽量严格地控制缓冲液的温度、浓度、pH值均保持不变，以降低背景层波动。该方法的控制条件较多，实现较为困难。

(2)增加参比通道。所谓的参比通道就是该通道中没有标签层，即被检测物不与标签层发生生化反应，那么参比通道中得到的响应就是背景层的响应。将检测通道所得表面等离子共振响应信号与之比较，就能消除背景层的非特定响应。但实际检测中，背景层在有无标签层的情况下的响应并非完全相同的。消除背景影响并不彻底。另外该方法需要占用两个样品通道，不利于测量系统的小型化和集成化。

(3)四角棱镜双通道对比。采用宽光谱的光源以固定的入射角入射，用特制的四角棱镜取代原来的三角棱镜，使入射光通过棱镜内的反射，形成两束以不同入射角的宽光谱光束，入射到同一个表面等离子共振传感器的金属层上，从而在不同波长的位置上分别激发表面等离子共振，得到关于同一生化反应和背景层特性下的两组表面等离子共振响应。该两组表面等离子共振响应对标签层和背景层变化的响应各不相同，从而分辨标签层的特定响应和背景层的非特定响应，达到消除背景层影响的目的。但此类方法中，为了有效消除背景影响，其中所涉及的特制四角棱镜的形状大小与表面等离子共振响应有着紧密的联系，需要精细的设计计算与制作，实现起来较为复杂。

(4)采用在入射光角度相同的情况下，在相同的表面等离子共振传感器件的金属薄膜上的部分区域覆盖一层电介质薄膜。利用宽光谱入射光，波长扫描的方式，在无电介质薄膜和有电介质薄膜处得到不同的表面等离子共振响应。与方法(3)类似，利用二者对标签层和背景层变化的响应的不同，达到分辨标签层和背景层的响应、消除背景的目的。此种方法，因为要在相同的传感器金属膜结构下得到不同的表面等离子共振响应，需要在已有金属膜的部分区域再涂覆电介质薄膜，不仅实现比较复杂而且可能影响和限制在金属表面制备标签层。因此，这样的方法的可实现性较低。

发明内容

本发明提出一种降低表面等离子共振检测中背景层干扰的新方法，以及实现该方法的一种表面等离子共振传感器结构。

一方面，本发明提供的表面等离子共振传感检测结构是利用金属薄膜激发表面等离子波的一种表面等离子共振传感器结构。该传感器结构主要有两部分组成，一部分是将入射光能量耦合进传感器的光学耦合元件，另一部分是能激发表面等离子共振的传感层。本发明在同一个传感器结构中，采用两种或两种以上能够激发表面等离子共振现象的不同金属薄膜组成传感层。在其他条件(光源、入射角度、被检测样品、背景层性质)都一致的情况下，对比不同材料传感层的表面等离子共振响应差异，以达到消除背景干扰的目的。

上述传感结构中，整个传感层由两个或两个以上、空间上互不交叠的区域构成，每个区域内的金属薄膜由一种金属材料构成，整个传感层由两种或两种以上的金属薄膜组成；

上述传感结构中，所述的传感所用的金属薄膜由能够产生表面等离子共振的金属材料构成，例如金，银，铜，铝，或其合金；

上述传感结构中，传感层中的两种或两种以上金属材料的选择必须满足：在各个不同金属薄膜上激发表面等离子共振的共振条件(即表面等离子共振角度或表面等离子共振波长)都不相同；

上述传感结构中，入射光同时照在不同的金属薄膜区域上，或者通过单次或多次反射的方式，照在不同的金属薄膜区域上；

上述传感结构中，入射光入射到传感层的不同金属薄膜区域上都有显著的表面等离子共振响应，且响应不相同；

上述传感结构中，为了在传感层的不同区域得到相同的表面修饰，在能够区分两个区域的不同响应的情况下，在传感层表面再附加一层极薄的金属薄膜。附加的薄膜不能影响原来的表面等离子共振激发

上述传感结构中，所述的光学耦合元件采用棱镜、光栅、光纤、波导耦合元件中的任何一种。

另一方面，本发明提供了一种表面等离子共振的测量方法，包括以下步骤：

(1)对传感层进行生化预处理，使标签分子附着在传感层上，形成标签层；

(2)将P偏振的入射光入射到表面等离子共振传感组件上；

(3)入射光通过光学耦合元件同时或先后依次照射在传感层的不同金属材料的区域上；

(4)将背景溶液进样，入射光在不同的传感层区域上发生反射，在不同的条件下产生表面等离子共振，通过分别对表面等离子共振传感组件的出射光进行测量，得到不同传感层区域对应的表面等离子共振条件；

(5)将待检测溶液进样，入射光在传感层的不同区域上、在不同条件下产生表面等离子共振，通过分别对表面等离子共振传感组件的出射光进行测量，得到传感层不同区域对应的表面等离子共振条件；

(6)根据上述测量传感层的不同金属薄膜区域下的表面等离子共振条件的变化量，通过数据处理算法，得到待测样品的检测信息。

上述方法所述的步骤(3)中，金属薄膜结构根据上面所述的传感结构，由分布在不同空间区域上的两种或两种以上的金属薄膜构成。入射光同时照在两种或两种以上金属表面上，分别产生对应于不同金属材料的表面等离子共振；或者将入射光先后照在两种或两种以上的金属上分别产生对应于不同金属的表面等离子共振，即入射光先照在某一金属材料的区域上，然后经过单次或多次反射后以相同角度入射到另一金属材料的区域上，分别先后产生相应的表面等离子共振。

上述方法所述的步骤(6)中，检测传感层的不同区域，即不同金属薄膜所激发出的表面等离子共振效应的出射光信号。对于每一种金属薄膜，由其表面的表面等离子共振产生的条件，得到一组表面等离子共振响应。因而对于两种或两种以上的不同金属薄膜，得到对于相同标签层和背景层条件下的两个或两个以上表面等离子共振响应。当标签层或背景层特性发生变化后，再次测量的两个或两个以上表面等离子共振响应与前面测量的表面等离子共振响应，构成两组或两组以上表面等离子共振条件。由于不同金属薄膜对标签层和背景层特性变化所引起的表面等离子共振条件变化的灵敏度不同，，因此由这两组或两组以上的表面等离子共振条件分别解出标签层和背景层的物理量变化，达到消除背景层干扰的目的。

本发明的表面等离子共振传感的测量结构及其测量系统具有以下优点：

1.本发明可用于实现表面等离子共振生化反应过程的高精度检测，相对于目前的检测结构，能够分辨生化反应标签层及待测样品中背景层变化的影响，消除背景层带来的干扰，使得对于待测物质的测量结果更为准确。

2.本发明的金属薄膜结构组成的表面等离子共振传感组件采用的扫描方式为角度扫描，波长扫描、强度扫描、相位扫描中的任何一种。

3.本发明具有广泛的兼容性，适用于目前多种的表面等离子共振检测结构，包括传统单层金属表面等离子共振、长程表面等离子共振、耦合等离子波导共振、波导耦合表面等离子共振中的任何一种检测结构

4.本发明所涉及的测量结构的体积小，有利于检测装置的小型化、集成化。

5.本发明无需参考通道即可实现消除背景的测量，节省资源，有利于实现多通道、高通量的并行检测。

6.本发明制作简单实现方便，应用灵活，兼容性强，成本较低，操作便捷。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1待测溶液样品分层结构；

图2并联式结构表面等离子共振传感组件结构示意图；

图3表面等离子共振角度扫描系统流程示意框图；

图4并联式结构表面等离子共振传感组件测得曲线；

图5串联式结构表面等离子共振传感组件结构示意图；

图6串联式结构表面等离子共振传感组件测得曲线；

具体实施方式

图2给出了一个根据本发明内容所述的传感层结构实例的示意图。采用直角棱镜作为光学耦合元件。由金属薄膜1和金属薄膜2组成传感层，将棱镜底面分成两个长方形传感层区域，两区域相邻。金属薄膜1区域镀55nm厚的金膜，金属薄膜2区域镀55nm厚的银膜，形成传感层的两个区域。同时为了保证生化检测过程中，标签分子的修饰条件相同，在传感层的两个区域表面再镀一层5nm的金膜。入射光从棱镜侧边入射，光斑落在两个区域的分界线上，光束照射在传感层的两个区域上的面积相同。此种结构由于在传感层的不同区域上表面等离子共振的激发是并行的，故称之为并联式结构。

本实例中的表面等离子共振检测系统采用Kretschmann型表面等离子共振装置。系统结构示意框图见图3，包括：

光源1：波长为670nm的单色光源，目的为了得到固定单波长入射光；

光路元件2：包括半波片，偏振片，及准直透镜。目的是为了得到P偏振且固定入射角度的准直入射光；

表面等离子共振传感组件3：采用本发明所述的表面等离子共振传感组件，其中传感层已经过生化预处理，即传感层上已吸附标签分子；

待测样品4：通过样品通道或样品池装置进入表面等离子共振传感组件3，与标签分子发生作用；

表面等离子共振信号检测装置5：采用光电二极管，将其置于光线的出射光路上，接收出射光的光强信号，并且将光强信号转换成电压信号；

数据处理设备6：将采集到的实验数据进行计算，得到测量结果。

实验中采用角度扫描：利用机械转台，改变入射到传感层上的角度，激发表面等离子共振。当进行角度扫描时，入射角度随时间连续改变，此时光点保持沿着分界线移动。

上述表面等离子共振检测系统的检测方法如下：

由光源发出的光，经过光路配套元件得到P偏振的准直入射光；

入射光由棱镜耦合，平均分布在传感层的两种金属薄膜区域内；

将生化待测样品进样，即通过样品通道或样品池到达已经有标签层的传感层，并与其作用；

控制机械转台进行角度扫描，同时对光电探测器测得的反射光强做实时的采集；

对实验数据按以下方法进行处理计算：

当反射光强达到最小值时，金属薄膜上对应的入射光角度称为表面等离子共振共振角。由于两种金属介电常数不同，则所对应的表面等离子共振共振角也就不同。设金膜的表面等离子共振共振角为θ_Au，设银膜的表面等离子共振共振角为θ_Ag。由于入射光束一半分布在金层上，一半分布在银层上，传感器的整体表面等离子共振响应包括上述两个表面等离子共振峰。由于表面等离子波对于标签层和背景层的变化都有响应，但对于不同材料的金属薄膜所激发的表面等离子共振响应受到标签层和背景层的影响的大小也不相同。因此，表面等离子共振角的变化与标签层和背景层的微小变化和金属薄膜材料特性有着紧密的联系，通过测量不同材料金属薄膜的表面等离子共振角的变化及其差异，计算分别得到标签层与背景的折射率变化。

设标签层的折射率为n_S，背景层的折射率为n_B。在表面等离子共振装置中通入待测物质溶液，待测物质与标签层发生作用后，标签层和背景层折射率都将发生变化。n_S1，n_B1分别为生化反应前，标签层和背景层的折射率。n_S2，n_B2分别为生化反应后，标签层和背景层的折射率。需检测的标签层和背景层的折射率变化为：

Δn_S＝n_S1-n_S2    (6)

Δn_B＝n_B1-n_B2    (7)

进行角度扫描后，表面等离子共振角也会发生变化。分别得到金、银薄膜传感层的表面等离子共振角分别对应标签层和背景层的折射率改变的函数关系：

Δθ_Au＝S_AuΔn_S+S′_AuΔn_B    (8)

Δθ_Ag＝S_AgΔn_S+S′_AgΔn_B    (9)

其中，Δθ_Au＝θ_Au2-θ_Au1，Δθ_Ag＝θ_Ag2-θ_Ag1，都通过实验测得。而方程中的Δn_S，Δn_B就是要求解的量。S_Au，S_Ag分别表示金和银层对应的表面等离子共振角对标签层折射率变化的灵敏度。S’_Au，S’_Ag分别表示金和银层对应的表面等离子共振角对背景层折射率变化的灵敏度。这些灵敏度，由理论计算得到。根据公式(3)-(5)，通过计算一定折射率附近的表面等离子共振角度随标签层或背景层折射率变化的斜率，即可得到对应的灵敏度。将其代入上述的方程组，分别计算求得标签层与背景层折射率的微小变化。得以对生化反应实验的过程进行测量和判断。

本实例中的系统主要物理参数为：

棱镜折射率：   1.76；

金薄膜折射率： 0.154+3.55i；

银薄膜折射率： 0.0666+4.045i；

标签层厚度：   5nm；

根据上述参数和公式(3)-(5)，得到上述结构中

S_Au＝3.0330；S’_Au＝68.4469；S_Ag＝2.5711；S’_Ag＝64.6767；

分别在标签层及背景层发生变化之前和之后进行两次角度扫描，这里设标签层的折射率从1.430变化到1.440，背景层的折射率由于环境因素的影响，从1.330变化到1.335。表面等离子共振响应曲线见图4。

分别测量得到：

θ_Au1＝54.9581°；θ_Au2＝55.3314°；

θ_Ag1＝53.8712°；θ_Ag2＝54.2210°；

计算得：Δθ_Au＝0.3733°；Δθ_Ag＝0.3498°；

将上述参数带入式(10)，即可算得折射率的改变量：

Δn_S＝0.0100；Δn_B＝0.0050；

上述结果与实际折射率变化非常接近。

如果采用传统的表面等离子共振器件及检测方法，不区分标签层和背景层的不同响应，认为金属薄膜下的溶液为一个整体。以单层银膜为例，上述实验条件下，根据θ_Ag1，θ_Ag2的差别，则计算得到的被检测物的折射率变化为：Δn＝0.005，该测量结果显然不符合实际。

经过对两种结果的比较说明，本发明较准确地获得标签层及背景层的折射率变化，从而去除背景层变化的影响。

除了并联式结构，根据本发明内容所述，入射光先后依次入射到传感层的不同金属薄膜区域上，分别产生对应的表面等离子共振，这种结构可称之为串联式结构。下面举例说明，如图5，采用等腰梯形棱镜作为光学耦合元件，其上下两底边相互平行。其下底面为传感面，上底面镀全反射膜。，分别采用金属薄膜1和金属薄膜2，两种不同金属薄膜作为传感层。金属薄膜1区域镀55nm厚的金膜，金属薄膜2区域镀55nm厚的银膜，形成两个区域。同时为了保证生化检测过程中，标签分子的修饰条件相同，在两个区域表面再镀一层5nm的金膜。入射光从棱镜的一侧入射，在金膜上反射后，经棱镜上底面反射，以同样的角度入射到银膜上。

本实例中的表面等离子共振检测系统采用Kretschmann型表面等离子共振装置。系统结构示意框图见图3，包括：

光源1：波长为670nm的单色光源，目的为了得到固定单波长入射光；

光路元件2：包括半波片，偏振片，及准直透镜。目的是为了得到P偏振且固定入射角度的准直入射光；

表面等离子共振传感组件3：采用本发明所述的表面等离子共振传感组件，其中传感层已作好生化预处理，即传感层上已吸附标签分子；

待测样品4：通过样品通道或样品池装置进入表面等离子共振传感组件3，与标签分子发生作用；

表面等离子共振信号检测装置5：采用光电二极管，将其置于光线的出射光路上，接收出射光的光强信号，并且将光强信号转换成电压信号；

数据处理设备6：将采集到的实验数据进行计算，得到测量结果。

实验中采用角度扫描：利用机械转台，改变入射到传感层上的角度，激发表面等离子共振。当进行角度扫描时，入射角度随时间连续改变，始终先入射到金膜上然后经反射入射到银膜上。

上述表面等离子共振检测系统的检测方法如下：

由光源发出的光，经过光路配套元件得到P偏振的准直入射光；

入射光由棱镜耦合，首先入射到下底面的金膜上，然后经上底面反射，入射到下底面的银膜上；

将生化待测样品进样，即通过样品通道或样品池到达已经有标签层的传感层，并与其作用；

控制机械转台进行角度扫描，同时对光电探测器测得的反射光强做实时的采集；

对实验数据按以下方法进行处理计算：

棱镜折射率：   1.76；

金薄膜折射率： 0.154+3.55i；

银薄膜折射率： 0.0666+4.045i；

标签层厚度：   5nm；

S_Au＝3.0442；S’_Au＝68.5361；S_Ag＝2.5694；S’_Ag＝64.6477；

分别在标签层及背景层发生变化之前和之后进行两次角度扫描，这里标签层的折射率设为从1.430变化到1.450，背景层的折射率从1.330变化到1.335。表面等离子共振响应曲线见图6。

分别测量得到：

θ_Au1＝54.9801°；θ_Au2＝55.3539°；

θ_Ag1＝53.8630°；θ_Ag2＝54.2128°；

故：Δθ_Au＝0.3738°；Δθ_Ag＝0.3498°；

将上述参数带入式(10)，即可算得折射率的改变量；

Δn_S＝0.092；Δn_B＝0.005；

由此较准确地获得被测层及背景层的折射率变化。

Claims (9)

1.一种能够降低表面等离子共振检测中背景层变化对测量结果干扰的表面等离子共振传感器结构，包括具有两个或两个以上形状任意但互不交叠的区域的传感层，各个区域内由不同种金属的薄膜构成，整个传感层由两种或两种以上能够产生表面等离子共振的金属薄膜同时组成。

2.根据权利要求1所述的表面等离子共振传感器结构，其特征在于，所述传感层使用的金属薄膜材料包括金，银，铜，铝等所有能产生表面等离子共振的金属或其合金材料，且材料的介电系数已知。

3.根据权利要求1所述的表面等离子共振传感器结构，其特征在于，分割后的每个区域上金属薄膜的选择必须满足：当采用波长扫描时，每个金属薄膜上激发表面等离子共振的表面等离子共振波长都不相同；当采用角度扫描时，激发表面等离子共振的表面等离子共振共振角都不相同。

4.根据权利要求1所述的表面等离子共振传感器结构，其特征在于，每个区域由的金属薄膜对于标签层和背景层的变化的灵敏度不同。

5.根据权利要求1所述的表面等离子共振传感器结构，其特征在于，入射光同时照在不同的金属薄膜区域上，或者通过单次或多次反射的方式，先后照在不同的金属薄膜区域上。

6.根据权利要求1所述的表面等离子共振传感器结构，其特征在于，传感层的不同区域上应具有相同的标签层修饰。当需要得到相同的标签层修饰时，先在传感层的各个不同区域上附加一层由同一种材料构成的极薄的金属薄膜，然后再做标签层修饰，附加的金属薄膜不影响原来的表面等离子共振的激发，其厚度范围为5-10nm。

7.根据权利要求1所述的表面等离子共振传感器结构，其特征在于，通过求解由不同条件所激发的表面等离子共振的方程，分别得到待测样品标签层和背景层折射率变化的响应。

8.一种用于上述传感器结构的测量方法，包括以下步骤：

(1)在所述传感器的传感层表面修饰标签分子；

(2)将所述偏振光同时或先后入射到所述传感器传感层的不同区域上；

(3)固定入射光波长改变入射光角度，得到反射光的反射强度的信息；

(4)在所述传感器的传感层表面使标签分子成与被检测物质充分反应；

(5)重复上述步骤(2)，(3)；

(6)根据步骤(3)，(5)得到的信息以及不同传感区域的响应差异，确定被标签层和背景层的折射率或厚度变化。

9.一种用于上述传感器结构的测量方法，包括以下步骤：

(1)在所述传感器的传感层表面修饰标签分子；

(2)将所述偏振光同时或先后入射到所述传感器传感层的不同区域上；

(3)固定入射光角度改变入射光波长，得到反射光的反射强度的信息；

(4)在所述传感器的传感层表面使标签分子成与被检测物质充分反应；

(5)重复上述步骤(2)，(3)；

(6)根据步骤(3)，(5)得到的信息以及不同传感区域的响应差异，确定被标签层和背景层的折射率或厚度变化。

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