CN106337031B - 伊格尔兹氏菌Eggerthella sp． D II‑9在降解呕吐毒素中的应用 - Google Patents
伊格尔兹氏菌Eggerthella sp． D II‑9在降解呕吐毒素中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株伊格尔兹氏菌Eggerthella sp.D II‑9在降解呕吐毒素中的应用。该菌株已于2016年6月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60049。该菌株可高效地将DON完全降解成其弱毒产物——脱环氧呕吐毒素（DOM‑1），且该菌株对DON降解活性的维持不依赖于DON的持续存在。该菌株活性稳定、代谢能力强、代谢温度和pH值范围广，可用于饲料加工和食品加工领域DON的脱毒、DON脱毒制剂的制备，以及DON脱环氧代谢相关酶的分离、DON脱环氧代谢工程菌的制备和DON耐受转基因植物的培育等方面，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于霉菌毒素降解技术领域。更具体地，涉及伊格尔兹氏菌Eggerthellasp. D II-9在降解呕吐毒素中的应用。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON），因能引起猪、狗、猫等动物呕吐反应，故又称为呕吐毒素（vomitoxin）。DON污染粮谷的情况非常普遍，许多粮谷类都受到严重污染，如小麦、燕麦、大豆和黑麦等。中国、巴西、美国、阿根廷和南非等世界各地均有DON污染粮食的报导。2016年在中国山东调查了359份面粉样品的霉菌毒素污染状况，发现DON的检出率最高，达到97.2%，平均污染浓度为86.7 μg/kg（Li et al., 2016）。不仅在粮谷作物中DON的污染严重，在饲料原料及全价配合饲料中的污染也很普遍。2012~2014年，随机收集的我国中部地区饲料及配合饲料190份，DON的阳性率为77.4%（Liu et al., 2016）。DON是一种毒性很强的霉菌毒素，可使人和动物体重减轻，腹泻，扰乱肠道系统的稳态、并影响内分泌系统及免疫系统等（Tang et al., 2015），并能通过血液循环到达血脑屏障，从而造成潜在的神经毒性（Behrens et al., 2015）。DON抑制蛋白质的合成、细胞的增殖，从而可能导致基因毒性、细胞毒性等（Lautert et al., 2014）。猪是对DON最敏感的动物，当饲料中DON浓度达到1~2 ppm就会使采食量降低（Prelusky et al., 1994）。
DON是单端孢霉烯族化合物B类，其化学名为12，13-环氧-3α，7α，15-三羟基单端孢霉-9-烯-8酮，分子式为C15H20O6。DON具热稳定性，能耐170～350℃的高温，并耐酸碱。目前，DON的脱毒方法主要包括物理、化学、生物方法三类。物理脱毒法主要有活性碳及蒙脱石吸附（Abdel-Wahhab et al., 2015）、漂洗研磨、高温处理等；化学脱毒方法包括酸、碱、氧化剂等的处理。但是，不管是物理的还是化学的方法，都有可能带来二次污染、影响口感、降低粮食的营养价值等。相对传统的物理和化学方法，生物方法越来越受到研究者的重视。生物脱毒即生物降解是通过微生物或者酶将有毒的物质转化为低毒甚至无毒的代谢产物（Awadet al., 2010）。DON的主要毒性基团是C12、13的环氧基团，研究表明其脱环氧产物（Deepoxideoxinivalenol, DOM-1）的毒性只相当于DON原药的1/55（Sundstol et al.,2004），是公认的一种解毒途径。
国外虽有脱环氧代谢DON的纯培养微生物，但是均被注册专利，国内尚没有相关微生物的报导。因此，分离具有自主知识产权的 DON脱环氧代谢微生物对于我国研究开发DON的生物脱毒剂及其在饲料生产和食品加工上的应用具有十分重要的作用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中DON脱毒微生物的缺陷和不足，提供一株具备高效DON脱环氧代谢能力的伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9在降解代谢呕吐毒素方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9在降解DON方面的应用。
具体地，所述应用是将DON降解为脱环氧呕吐毒素（Deepoxideoxinivalenol,DOM-1）。
更具体地，所述应用是将伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9应用于饲料加工或食品加工等领域中DON的脱毒。
该菌株能将呕吐毒素（Dexoynivaneol, DON）高效降解成DOM-1。
该菌株在体外最适培养条件下，100～1000 CFU接种到200 μl 体系，24～48 h内可以将DON完全转化为DOM-1。
而且，该菌株对DON降解活性的维持不依赖于DON，在不含DON的培养基中连续培养多代不会导致活性降低或丢失。
经过鉴定，该菌株属于革兰氏阳性菌，大小为0.2～0.3μm×0.7～1.0μm，呈细杆状，无鞭毛。该菌株已于2016年6月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60049。
该菌株是从鸡肠道微生物中分离筛选得到的，具体的分离筛选方法包括抗生素筛选、梯度稀释筛选、96孔板筛选、比较宏基因组学、培养条件优化和16S rDNA鉴定等。并通过培养基、温度、pH值等培养条件的分析，摸索出了其发挥脱环氧代谢活性的最佳条件。
该菌株活性稳定、代谢能力强、代谢温度和pH值范围广，可用于饲料加工和食品加工领域DON的脱毒、饲料加工和食品加工领域DON脱毒制剂的制备，DON脱环氧代谢相关酶的分离、DON脱环氧代谢工程菌的制备、DON脱环氧代谢酶制剂的制备、DON耐受转基因植物的培育。
另外，优选地，具体在降解DON的应用时，伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9降解DON的最适pH为5～10，最适温度为30～45℃。
更优选地，所述降解DON的最适pH为6.5～10。
优选地，伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9降解DON的最适条件还包括：生长在含80% N2、10% H2和10% CO2的混合气体环境中。
另外，伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9在制备DON脱毒制剂中的应用，在制备DON脱环氧代谢酶方面的应用，都应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述DON脱毒制剂是指可以应用于饲料加工或食品加工等领域中的DON脱毒制剂。
另外，伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9或其中的DON脱环氧代谢酶在制备DON脱毒酶制剂中的应用，以及在构建DON脱毒工程菌或培育DON耐受转基因植物方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。
所述DON脱毒工程菌主要可以应用于饲料加工、食品加工等领域中DON脱毒。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9在降解DON方面的应用，该菌株是从鸡肠道微生物中分离筛选得到的，能将DON高效降解成DOM-1，该菌株在体外最适培养条件下，100～1000 CFU接种到200 μl 体系，24～48 h内可以将DON完全转化为DOM-1。
而且，该菌株对DON降解活性的维持不依赖于DON，在不含DON的培养基中连续培养多代不会导致活性降低或丢失。
该菌株活性稳定、代谢能力强、代谢温度和pH值范围广，可用于饲料加工和食品加工领域DON的脱毒、饲料加工和食品加工领域DON脱毒制剂的制备，以及DON脱环氧代谢相关酶的分离、DON脱环氧代谢工程菌的制备、DON脱环氧代谢酶制剂的制备和DON耐受转基因植物的培育等方面。
附图说明
图1为鸡肠道微生物DON脱环氧代谢能力的HPLC检测结果；A为DON，DOM-1标品的HPLC检测结果，B为鸡肠道微生物代谢DON情况。
图2为伊格尔兹氏菌的革兰氏鉴定。
图3为伊格尔兹氏菌的电镜观察图片。
图4为伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9的系统发育树。
图5为不同温度条件下伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9代谢DON的结果（1：100接种约1000 CFU）。
图6为不同pH条件下伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9代谢DON的结果（1：100接种约1000 CFU）。
图7为最适条件下Eggerthella sp. D II-9代谢DON的HPLC检测结果；A为DON，DOM-1标品的HPLC检测结果，B为该菌株最适条件下代谢DON情况。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 鸡肠道微生物混合菌群的DON脱环氧代谢能力分析
1、方法
（1）从市场（华南农业大学周边的菜市场）随机购买一只温氏鸡，用手术刀割破其颈动脉，使鸡因失血过多而死亡。
（2）解剖腹部取出鸡的盲肠、大肠和小肠各3～5cm，肠道内容物用L10培养基混匀。
（3）静置3～5min，取100μl加入到900μl L10培养基中，添加10mg/ml DON母液10μl，使其终浓度为100μg/ml。
（4）将接种好的样品及厌氧袋放进一个厌氧盒中，37 ℃厌氧培养3天。
（5）取样100μl，加三倍体积的乙腈于待萃取的菌液中，涡旋震荡混匀，10000rpm，离心1min，将上清用N2吹干。
（6）加三倍体积的乙腈，涡旋震荡混匀，离心，上清用N2吹干，然后加200μl左右13%的乙腈溶解沉淀，混合均匀。
（7）1ml医用注射器吸取上述溶液，用0.2μm的尼龙针式滤器过滤至上样瓶，使用高效液相色谱HPLC对其脱环氧代谢活性进行检测。
2、结果如附图1所示，所分离的鸡肠道微生物菌群对DON具有高效的脱环氧代谢能力。
实施例2 伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9的分离鉴定
1、抗生素、梯度稀释、96孔板筛选
首先对实施例1所述的鸡肠道微生物菌群进行抗生素、梯度稀释、96孔板筛选获得具备DON脱环氧代谢能力的富集菌群。具体方法如下：
（1）选用四环素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、泰勒霉素、林可霉素、头孢霉素、头孢噻肟、链霉素、氯霉素等抗生素与鸡肠道微生物孵育，筛选出一个抗生素组合：四环素+泰勒霉素+林可霉素+氨苄青霉素，在此抗生素组合条件下，可以极大抑制非目标菌的生长。
（2）取抗生素筛选后有活性的菌群做菌种，梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，HPLC检测发现稀释10-7组可以代谢DON为DOM-1，10-8不可以，而10-9不长菌，说明目的菌在菌群中的比例约为1/100～1/10。
（3）活化有活性的菌种，待菌体生长到对数期，取2 ml菌液至5 ml BD管，然后放入分散仪中分散60s，BD管中的菌液密度约为3×108 CFU/ml，通过进一步的稀释使菌体密度约为10CFU/μl，取1μl至10～12ml新鲜培养基，颠倒混匀，分装到96孔板中，约200μl/孔，约1/3孔中长菌，而在长菌的孔中，只有1个孔的菌体经检测是有脱环氧代谢DON的能力。
2、比较宏基因组学分析
对上述有脱环氧代谢DON的能力的菌体，进行比较宏基因组学分析，分析DON脱环氧代谢菌富集菌群在活性丧失前后的物种差异。
（1）按1：103的接种比例，将有活性的菌种及无活性的菌种分别接种，1ml体系，厌氧培养2天，收集菌液，离心，弃上清。
（2）使用细菌基因组小提取试剂盒（Axygen康宁生命科学有限公司）提取有活性菌群和无活性菌群的基因组，将有活性菌群及无活性菌群的基因组用干冰运送至天津诺禾致源生物科技有限公司进行测序。
（3）测序结果显示，两个菌群的优势物种都是肠杆菌，丰度占97%以上，而劣势物种方面活性菌群存在某些物种是无活性菌群所没有的，其中劣势物种中的Coriobacteriaceae（红椿菌科）微生物所占比例最高（约96%）。
3、筛选DON脱环氧代谢的纯培养菌株
通过优化培养基，从富集菌群中筛选DON脱环氧代谢的纯培养菌株，具体方法如下：
（1）现有的培养基：NB营养肉汤，其用法是称取此肉汤18 g，加热搅拌溶于1000 ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
（2）改良培养基
改良培养基：上述NB营养肉汤中添加0.1%精氨酸，终浓度1.5%琼脂。
（3）按上述配方配制改良培养基，稀释菌液104倍涂平板，厌氧培养1～5 d。
1 d后长出第一批克隆，随机挑取20个验证活性，发现几乎不能代谢DON，3～5 d后长出新的克隆，随机挑取20个验证活性，发现均能代谢DON，连续划线3次以上活性不丢失。获得具有DON脱环氧代谢能力的纯培养菌株（单克隆菌株）。
4、DON脱环氧代谢的纯培养菌株的鉴定
（1）对上述获得的具有DON脱环氧代谢能力的单克隆菌株进行革兰氏染色，如附图2所示，该菌株为革兰氏阳性菌。
（2）对上述单克隆菌株进行电镜观察鉴定，如附图3所示，其大小约为（0.2～0.3μm×0.7～1.0μm），呈细杆状，无鞭毛。
（3）对上述单克隆菌株进行16S rRNA基因测序，并构建系统发育树（如附图4所示）。序列比对发现，该菌株属于伊格尔兹氏菌属（Eggerthella），因此，将该菌株命名为伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9，并于2016年6月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60049，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例3 伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9降解DON的最适条件
1、温度分析
设置一系列温度梯度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，定点取样检测代谢DON的情况。
结果如附图5所示，脱环氧代谢DON的最适温度范围为30～45℃。
低温（＜30 ℃）不会使菌体失活，只是会使脱环氧代谢DON毒素的代谢转化率有所降低，但是最终仍然可以100%代谢DON；高温（＞50 ℃）会使菌体失活，完全丧失脱环氧代谢DON的能力。
2、pH分析
设置一系列pH梯度5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，定点取样检测代谢DON的情况。
结果如附图6所示，在pH 5～10的范围内，均将DON完全转化成DOM-1，但是脱环氧代谢DON的最适pH范围为6.5～10.0之间。
伊格尔兹氏菌在偏酸性条件下不会使活性丧失，只是会使转利率有所降低（因“改良营养肉汤NB 培养基”在pH ＜ 5时不稳定易析出，所以最低pH值设为5.0）；在碱性条件下有利于脱环氧代谢，甚至在pH高达10.0的条件下仍能高效的代谢DON。
3、在最适培养基、最适温度、最适pH条件下，100～1000 CFU伊格尔兹氏菌接种到200μl体系，其可以在24～48 h内将100μg/ml的DON完全脱环氧代谢为DOM-1（如附图7所示）。
5、另外，对伊格尔兹氏菌Eggerthella sp. D II-9生长环境其他组成进行了优化筛选，结果显示，最佳气体环境组成为80% N2、10% H2和10% CO2的混合气。
Claims (5)
1.伊格尔兹氏菌（Eggerthella sp.） D II-9在降解代谢呕吐毒素方面的应用，其特征在于，该菌株已于2016年6月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCCNO：60049；所述应用是将伊格尔兹氏菌D II-9应用于饲料加工或食品加工领域中呕吐毒素的脱毒。
2.权利要求1中所述的伊格尔兹氏菌D II-9在制备呕吐毒素脱毒制剂中的应用。
3.权利要求1中所述的伊格尔兹氏菌D II-9在制备呕吐毒素脱环氧代谢酶方面的应用。
4.权利要求1中所述的伊格尔兹氏菌D II-9在制备呕吐毒素脱毒酶制剂中的应用。
5.权利要求1中所述的伊格尔兹氏菌D II-9在构建呕吐毒素脱毒工程菌或培育呕吐毒素耐受转基因植物方面的应用。
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