CN106282298A - 一种选择性培养基的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种选择性培养基的制备方法，目前在致病菌选择性培养中，主要通过化学试剂和抗生素实现选择性培养，这种方法在某些致病菌培养中存在选择性不足，对目标菌的生长存在影响等问题。噬菌体，具有高度的选择性，能够选择性的杀死干扰菌株，并且不会对目标菌的生长产生影响，因此，可以作为选择性培养基的选择剂应用于致病菌的快速扩增。本发明克服了现有技术的不足，将噬菌体做为添加剂添加到选择性培养基内，实现致病菌的选择性扩增。
Description
技术领域
本发明涉及到能够特异性裂解细菌的噬菌体作为添加剂在致病菌选择性培养基中的应用，属于生物工程领域。
背景技术
食品安全事件层出不穷，其中由于致病菌引起的食源性事件更是给人们的健康带来了极大的伤害还安全隐患。因此，对食品和食品加工环境的检测提出了更高的要求。众所周知食品中致病菌的含量低，背景菌含量高的等特点，例如标准要求食品中沙门氏菌、单核增生李斯特菌为25g样品中不得检出(GB29921-2013)，而未处理样品中菌含量普遍处于10^3-10^7CFU/mL，而中国国标检测方法普遍存在检测时间长(3-7天)不适合做日常监测。酶显色法、免疫检测及核酸检测等快速检测方法得到很大的发展。但是和标准方法相同，快速检测方法的检测灵敏度仍然和限量要求之间存在着巨大的差异，因此选择增菌是食品中致病菌检测的必需步骤。另外后续检测方法无论是化学检测、酶法或者免疫法检测，都对选择性增菌提出了更高的要求。目前多用化学试剂和抗生素等作为选择剂去除一些干扰菌的生长，然而，这些选择剂的选择性有一定的局限行，另外，添加量增加，对目标菌的生长也有影响，影响结果的可靠性。而噬菌体作为细菌病毒，具有非常强的特异性，并且其安全性得到美国FDA的GRAS认证。目前，噬菌体在生物杀菌和超级细菌感染治疗中已经有大量的应用，但在在致病菌选择性增菌、快速培养中少有应用。
发明内容
目前在致病菌选择性培养中，主要通过化学试剂和抗生素实现选择性培养，这种方法在某些致病菌培养中存在选择性不足，对目标菌的生长存在影响等问题。本发明克服了现有技术的不足，发明了一种选择性培养基的制备方法，使用的基础培养基为标准培养基。
本发明的一个目的是公开一种培养基的添加剂，该添加剂可以杀死主要干扰菌，从而实现特异性扩增，其主要组份为特异性噬菌体。
本发明的有一目的是公开该类噬菌体的获得方法。
本发明的再一目的是公开该类添加剂对后续的免疫检测、酶底物显色检测没有影响。
本发明的优势在于：噬菌体，具有高度的选择性，能够选择性的杀死干扰菌株，并且不会对目标菌的生长产生影响，因此，可以作为选择性培养基的选择剂应用于致病菌的快速扩增。
具体实施方式
实施例1 噬菌体的制备
1)样品制备 收集自然界中的样品，主要为污水和土壤(土壤样品按照1∶5比例用去离子水稀释)，用NaOH调节，使pH调节为7.8，5000r/min离心15min，并用0.45um的滤膜过滤，在其中按照1∶1比例加入2倍LB培养基，加入筛选菌株(例如，筛选金黄色葡萄球菌的噬菌体则加入金黄色葡萄球菌)，使其终浓度达到3.0×107CFU/ml，37℃培养12-24h。8000r/min，离心15min，制备待测样品。
2)噬菌体筛选，制备LB固体平板，调价菌体浓度为1.0×108CFU/ml，在其中加入上述制备样品，涂布于LB固体平板上，带表面干燥后，37℃倒置培养过夜。通过观察是否出现噬菌体斑来确定是否筛选到噬菌体。
3)用吸头挑取噬菌斑，加入到对数期筛选菌中(OD6000.3-0.8)，37℃震荡培养4-6小时，待澄清后，离心，过滤，得噬菌体。
4)分别用不同的细菌菌株测定噬菌体对不同菌株的敏感性，筛选得到所需噬菌体。
实施例2
金黄色葡萄球菌作为一种常见的致病菌，显色平板作为一种快速、高效的检测方法在该菌的检测中得到广泛的应用，但是猪葡萄球菌和金葡在显色平板上具有相同的反应，并且不能够通过添加抗生素的方式进行去除(对抗生素的抗性相同)，噬菌体可以实现金黄色葡萄球菌的选择性增长。
1.金黄色葡萄球菌和猪葡萄球菌的培养：
挑取金黄色葡萄菌(ATCC25923)，猪葡萄球菌，配制LB培养基，并高温灭菌，分别挑取平板中的金黄色葡萄球菌和猪葡萄球菌单克隆，接种于LB培养基中，37℃培养过夜。计数备用。
2.猪葡萄球菌噬菌体的培养
将猪葡萄球菌放大培养至500ml，在对数期(OD6000.4-0.8)接种猪葡萄球菌噬菌体(该噬菌体特异感染裂解猪葡萄球菌，对金黄色葡萄球菌不敏感)，37℃继续培养6h，待培养液澄清后，5000r/min离心20min，然后用0.22um的滤膜过滤，保存备用。经过测定噬菌体的底物为5×1010PFU/ml。
3.检测试验
检测样本制备
1)猪葡萄球菌待检样：将猪葡萄球菌待检样品稀释至100CFU/ml。
2)混合待检样：经计算，稀释获得混合待检样，其中金黄色葡萄球菌浓度为100CFU/ml、猪葡萄球菌浓度为100CFU/ml
3)将检测样品分成若干份份，分别添加不同浓度的猪葡萄球菌噬菌体，并用北京良润生物科技有限公司提供的金黄色葡萄球测试片(显色底物为X-α-gluc)进行检测(取样品1ml，加入到测试片上，37℃培养18-24h)，检测方式及检测结果如下
实验结果可以看出当噬菌体的使用终浓度高于1.0×106PFU/ml在不影响金黄色葡萄球菌生长的前提下，可以有效抑制猪葡萄球菌的生长，使测试片拥有更好的特异性。
实施例3
鼠伤寒沙门氏菌，和肠炎沙门氏菌是最为常见的致病性沙门氏菌，细菌的分型对溯源和疾病治疗具有重要的意义，但是在免疫检测中，抗体和乙型副伤寒沙门氏菌有交叉，即不能够有效区分鼠伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌。利用乙型副伤寒沙门氏菌的噬菌体，可以有效灭杀该菌，同时不影响鼠伤寒沙门氏菌的生长和检测。
1.鼠伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌的培养
挑取鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)，乙型副伤寒沙门氏菌(CMCC(B)50094)
配制LB培养基，并高温灭菌，分别挑取平板中的鼠伤寒沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌单克隆，接种于LB培养基中，37℃培养过夜。计数备用。
2.乙型副伤寒沙门氏菌噬菌体的培养
将乙型副伤寒沙门氏菌放大培养至500ml，在对数期(OD6000.4-0.8)接种乙型副伤寒沙门氏菌噬菌体(该噬菌体特异感染裂解乙型副伤寒沙门氏菌，对金黄色葡萄球菌不敏感)，37℃继续培养6h，待培养液澄清后，5000r/min离心20min，然后用0.22um的滤膜过滤，保存备用。经过测定噬菌体的底物为5×1010PFU/ml。
3.检测试验
检测样本制备
1)乙型副伤寒沙门氏菌待检样：将乙型副伤寒沙门氏菌待检样品稀释至100CFU/ml。
2)混合待检样：经计算，稀释获得混合待检样，其中鼠伤寒沙门氏菌浓度为100CFU/ml、乙型副伤寒沙门氏菌浓度为100CFU/ml
3)将检测样品分成若干份份，分别添加不同浓度的乙型副伤寒沙门氏菌噬菌体，用国标法进行增菌，并用北京良润生物科技有限公司提供的鼠伤寒沙门氏菌金标检测卡进行检测，检测方式及检测结果如下
实验结果可以看出当噬菌体的使用终浓度高于1.0×103PFU/ml时，即可以有效控制乙型副伤寒沙门氏菌对鼠伤寒沙门氏菌检测的影响。
Claims (4)
1.一种选择性培养基的制备方法，其特征在于具有高度的选择性，其组成为标准培养基加添加剂。
2.权利要求1中所述的标准培养基，其特征在于包括中国国标、其他国家标准或者企行业也标准的培养基。
3.权利要求1中所述添加剂，其特征为含有一种或者一种以上的噬菌体，噬菌体均具有特异性。
4.权利要求3中所述噬菌体来源于自然界，未经过改造。
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