CN106279457A - 蓝藻胞外多糖的制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蓝藻胞外多糖的制备和使用方法，所述蓝藻胞外多糖制备方法至少包括：1）对固氮蓝藻进行培养，总干重控制在0.02-0.20 g/L的起始接种浓度，接种到液体培养基，培养温度20-32℃，光循环（0-24h/24-0h），光强度为50-200 μmol/m2/s；2）将培养过的固氮蓝藻液离心、过滤膜、浓缩、加入沉淀剂沉淀后弃上清液得到的沉淀冻干即为固氮蓝藻的胞外多糖的粗品。利用本发明或的蓝藻胞外多糖与有机肥料混合后可以用于种植蔬菜，明显提高蔬菜的产量。

Description

蓝藻胞外多糖的制备和使用方法
技术领域
本发明涉及一种蓝藻胞外多糖的制备和使用方法，属于微生物领域。
背景技术
蓝藻多糖备受关注，在医学、工业和农业领域都有一定应用。自20世纪50年代以来,已报道有33个属超过100种蓝藻被发现具有分泌胞外多糖的能力,按照伯杰氏分类手册,这些蓝藻广泛分布于5个亚属中。目前,对其中的念珠藻属(Nostoc)、螺旋藻属(Spirulina)、节螺藻属(Arthrospira)、微鞘藻属(Microcoleus)等的多糖研究较多。
蓝藻胞外多糖是一种酸性杂多糖。在蓝藻胞外多糖中共发现4大类单糖:有己糖类的葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖；有戊糖类的核糖、木糖和阿拉伯糖；脱氧己糖类的岩藻糖、鼠李糖和甲基鼠李糖；以及酸性己糖类的葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。在蓝藻胞外多糖中葡萄糖是出现频率最高的单糖，其次是半乳糖,鼠李糖和甘露糖，但也有一些蓝藻产生的胞外多糖中，木糖、阿拉伯糖、半乳糖或海藻糖高于葡萄糖的含量，核糖较少。蓝藻胞外多糖的性质差异很大,多数蓝藻的胞外多糖上有糖醛酸和硫酸基团等带电基团的存在,硫酸基团同时也是多糖呈抗病毒特性的基础,而乙酰基团、缩氨酸部分及脱氧糖等疏水基团的存在使多糖呈乳化特性。
近来,出于环境保护与工业生产需要,研究者对新型微生物类多糖进行了大量研究，这些研究结果显示,利用蓝藻生产胞外多糖具有一些优于植物或大型藻类的特性。但截至目前,仍没有蓝藻胞外多糖类产品出现,理论研究与大批量工业生产之间仍然有很多技术性问题亟待解决。
国内研究者考察了普通念珠藻的多糖类物质等对蔬菜类的促生长作用。但是多糖成分比较复杂，促生长的机理和发挥作用的成分还不明确。这些实验也仅针对普通念珠藻提取物对水稻、大豆、绿豆、小白菜、萝卜和生菜的发芽率实验。盛家荣等发现普通念珠藻的水提物可以促进水稻、绿豆和大豆的出芽率，而其碱提物却会对蔬菜发芽产生抑制作用。
过量的化肥施用对我国农业的可持续发展造成严重的威胁。发展生物肥既可以增加土壤肥力，减少化肥用量，还能进行一定程度上达到土壤改良的目的。目前，农业部正式登记的微生物肥料有1352种。基于蓝藻胞外多糖的有机共混肥料大有可为。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种全新的蓝藻胞外多糖制备方法和使用方法，为胞外多糖作为肥料用于种植蔬菜提供了依据，为蓝藻多糖作为肥料实现工业化的生产开辟道路。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种蓝藻胞外多糖制备方法，所述蓝藻胞外多糖制备方法至少包括：
1)对固氮蓝藻进行培养，总干重控制在0.02-0.20g/L的起始接种浓度，接种到液体培养基中，培养温度20-32℃，光循环(10-24h/14-0h)，光强度为50-200μmol/m2/s；
2)将培养过的固氮蓝藻液离心、过滤膜、浓缩、加入沉淀剂沉淀后弃上清得到的沉淀冻干即为固氮蓝藻的胞外多糖的粗品；
优选地，所述固氮蓝藻选自念珠藻藻株或鱼腥藻藻株中的任意一种单一藻株。
优选地，所述固氮蓝藻选自不同念珠藻藻株和不同鱼腥藻藻株中的至少两种藻株。
优选地，所述胞外多糖包括以下物质:葡萄糖30-40重量份、半乳糖30-45重量份、鼠李
糖10-15重量份、阿拉伯糖10-20重量份和海藻糖0-10重量份。
优选地，所述步骤1)中的培养的时间为5-7天。
优选地，所述步骤2)中滤膜的孔径为0.22μm。
优选地，所述步骤2)中浓缩采用旋转蒸发浓缩的方法。
优选地，还包括步骤3)向胞外多糖中加入去离子水重溶、加入沉淀剂得到胞外多糖的精品。
更优选地，所述步骤3)至少重复两次。
优选地，所述步骤2)和步骤3)中的沉淀剂为4℃预冷的等体积的丙酮，所述沉淀在4℃下进行；或沉淀剂为乙醇，使得加入乙醇后乙醇的最终体积分数75-80％。
本发明的另一个方面，提供了一种含有蓝藻包外多糖的肥料，所述肥料包括蓝藻胞外多糖1重量份和有机肥料500-10000重量份。
优选地，所述有机肥为动物粪便。
本发明的另一个方面提供了一种含有蓝藻胞外多糖的肥料用于种植蔬菜的方法。
如上所述，本发明的蓝藻多糖的制备和使用方法，具有以下有益效果：
在降低化肥用量的前提下，可以有效提高蔬菜产量10％以上。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS INENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。
实施例1
步骤1)选用念珠藻F280(购自中国科学院FACHB淡水藻种库)，总干重为0.02g/L的起始接种浓度，将藻种库中的藻种接种到300mL BG11培养基，光强度为88μmol/m2/s，光暗循环，光暗时间比为14h:10h，室温下培养5天。
步骤2)将培养过的固氮蓝藻液离心、过0.22μm的滤膜、减压旋转蒸发浓缩、加入等体积的4℃预冷的丙酮，4℃下沉淀并弃上清，沉淀后弃上清得到的沉淀冻干即为固氮蓝藻的胞外多糖的粗品；
步骤3)向胞外多糖粗品中加入去离子水重溶后，加入等体积的4℃预冷的丙酮，4℃下沉淀并弃上清，沉淀后弃上清，再重复一次，得到的沉淀冻干即为固氮蓝藻的胞外多糖的纯品。
步骤4)配制1.0mg/mL的胞外多糖纯品溶液，使用苯酚硫酸法测定胞外多糖溶液中糖浓度，计算纯度；使用1M稀硫酸95℃下酸解2h，之后稀释5倍使用HPLC分析，过HPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm)分析其单糖组成。测定结果为，35.14％葡萄糖、35.14％半乳糖、12.16％鼠李糖、13.06％阿拉伯糖和4.5％海藻糖。
步骤5)将上述的胞外多糖10克与动物(猪)粪便5000克混合，用于种植生菜。
实施例2
步骤1)选用鱼腥藻B1611(购自美国德州大学UTEX藻种库)和念珠藻F280(购自中国科学院FACHB淡水藻种库)，其中鱼腥草0.05g/L，念珠藻0.05g/L接种到BG11培养基，光强度为50μmol/m2/s，光暗循环，光暗时间比为20h:4h，室温下培养5天。
步骤2)将培养过的固氮蓝藻液离心、过0.22μm的滤膜、减压旋转蒸发浓缩、加入等体积的4℃预冷的丙酮，4℃下沉淀并弃上清，沉淀后弃上清得到的沉淀冻干即为固氮蓝藻的胞外多糖的粗品；
步骤3)向胞外多糖粗品中加入去离子水重溶后，加入等体积的4℃预冷的丙酮，4℃下沉淀并弃上清，沉淀后弃上清得到的沉淀冻干即为固氮蓝藻的胞外多糖的纯品。
步骤4)配制1.0mg/mL的胞外多糖纯品溶液，使用苯酚硫酸法测定胞外多糖溶液中糖浓度，计算纯度；使用1M稀硫酸95℃下酸解2h，之后稀释5倍使用HPLC分析，过HPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm)分析其单糖组成。测定定结果为，36.72％葡萄糖、45％半乳糖、10.94％鼠李糖和7.34％阿拉伯糖。
步骤5)将上述的胞外多糖5克与动物(牛)粪便10千克混合，用于种植白菜。
实施例3
步骤1)选用念珠藻F280和鱼腥藻F243(都购自中国科学院FACHB淡水藻种库)，其中总干重为0.2g/L，接种到300mL BG11培养基，光强度为200μmol/m2/s，光暗循环，光暗时间比为12h:12h，室温下培养7天。
步骤2)将培养过的固氮蓝藻液离心、过0.22μm的滤膜、减压旋转蒸发浓缩、加入无水乙醇至最终体积分数80％，沉淀并弃上清，沉淀后弃上清得到的沉淀冻干即为固氮蓝藻的胞外多糖的粗品；
步骤3)向胞外多糖粗品中加入去离子水重溶后，加入等体积的4℃预冷的丙酮，4℃下沉淀并弃上清，沉淀后弃上清，再重复两次，得到的沉淀冻干即为固氮蓝藻的胞外多糖的纯品。
步骤4)配制1.0mg/mL的胞外多糖纯品溶液，使用苯酚硫酸法测定胞外多糖溶液中糖浓度，计算纯度；使用1M稀硫酸95℃下酸解2h，之后稀释5倍使用HPLC分析，过HPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm)分析其单糖组成。测定结果为，34.70％葡萄糖、36.53％半乳糖、13.53％鼠李糖、13.20％阿拉伯糖和2.04％海藻糖。
步骤5)将上述的胞外多糖1克与动物(鸡)粪便10千克混合，用于种植黄瓜。
实施例4
步骤1)选用鱼腥藻B1611(购自美国德州大学UTEX藻种库)，念珠藻F280和鱼腥藻F243(都购自中国科学院FACHB淡水藻种库)，总干重为0.10g/L，将藻种库中的藻种涂布于BG11无氮琼脂平板，光强度为88μmol/m2/s，光暗循环，光暗时间比为24h:0h，32℃下培养7天。
步骤2)将培养过的固氮蓝藻液离心、过0.22μm的滤膜、减压旋转蒸发浓缩、加入无水乙醇至最终乙醇体积分数75％，沉淀并弃上清，沉淀后弃上清得到的沉淀冻干即为固氮蓝藻的胞外多糖的粗品；
步骤3)向胞外多糖粗品中加入去离子水重溶后，加入等体积的4℃预冷的丙酮，4℃下沉淀并弃上清，沉淀后弃上清得到的沉淀冻干即为固氮蓝藻的胞外多糖的纯品。
步骤4)配制1.0mg/mL的胞外多糖纯品溶液，使用苯酚硫酸法测定胞外多糖溶液中糖浓度，计算纯度；使用1M稀硫酸95℃下酸解2h，之后稀释5倍使用HPLC分析，过HPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm)分析其单糖组成。测定定结果为，30.75％葡萄糖、39.38％半乳糖、11.87％鼠李糖、17.0％阿拉伯糖和1.0％海藻糖。
步骤5)将上述的胞外多糖10克与动物(鸭)粪便10千克混合，用于种植西红柿。
效果实施例
分别将上述4个实施例中制备的固氮蓝藻的胞外多糖与有机肥料混合，混合后的肥料用于生菜，同时设定对照组(除了采用的有机肥料不含有胞外多糖外，其他栽培防范与实施例组相同)的生菜的，测定肥料的使用量和每亩生菜的产量。
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
每亩生菜产量(Kg) 1206 4267 3655 4370
对照组产量 1089 3861 3260 3890
从上述实施例可以看出，由于在有机肥料中添加了胞外多糖，每亩生菜的产量明显提高。从而说明胞外多糖在用于种植素菜具有很大的优势，值得进一步的研究和投入生产。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (13)

1.一种蓝藻胞外多糖制备方法，其特征在于，所述蓝藻胞外多糖制备方法至少包括：
1)对固氮蓝藻进行培养，总干重控制在0.02-0.20g/L的起始接种浓度，接种到液体培养基，培养温度20-32℃，光循环(10-24h/14-0h)，光强度为50-200μmol/m2/s；
2)将培养过的固氮蓝藻液离心、过滤膜、浓缩、加入沉淀剂沉淀后弃上清液得到的沉淀冻干即为固氮蓝藻的胞外多糖的粗品。
2.根据权利要求1所述的蓝藻胞外多糖制备方法，其特征在于：所述固氮蓝藻选自念珠藻藻株或鱼腥藻藻株中的任意一种单一藻株。
3.根据权利要求1所述的蓝藻胞外多糖制备方法，其特征在于：所述固氮蓝藻选自不同念珠藻藻株和不同鱼腥藻藻株中的至少两种藻株。
4.根据权利要求1所述的蓝藻胞外多糖制备方法，其特征在于：所述胞外多糖包括以下物质:葡萄糖30-40重量份、半乳糖30-45重量份、鼠李糖10-15重量份、阿拉伯糖10-20重量份和海藻糖0-10重量份。
5.根据权利要求1所述的蓝藻胞外多糖制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的培养的时间为5-7天。
6.根据权利要求1所述的蓝藻胞外多糖制备方法，其特征在于：所述步骤2)中滤膜的孔径为0.22μm。
7.根据权利要求1所述的蓝藻胞外多糖制备方法，其特征在于：所述步骤2)中浓缩采用旋转蒸发浓缩的方法。
8.根据权利要求1所述的蓝藻胞外多糖制备方法，其特征在于：还包括步骤3)向胞外多糖中加入去离子水重溶、加入沉淀剂得到胞外多糖的精品。
9.根据权利要求8所述的蓝藻胞外多糖制备方法，其特征在于：所述步骤3)至少重复两次。
10.根据权利要求8所述的蓝藻胞外多糖制备方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤3)中的沉淀剂为4℃预冷的等体积的丙酮，所述沉淀在4℃下进行；或沉淀剂为乙醇使得加入乙醇后最终乙醇的体积分数75-80％。
11.一种含有如权利要求1所述的蓝藻胞外多糖的肥料，其特征在于：所述肥料包括蓝藻胞外多糖1重量份和有机肥料500-10000重量份。
12.根据权利要求11所述的含有蓝藻胞外多糖的肥料，其特征在于：所述有机肥为动物粪便。
13.如权利要求11所述的含有蓝藻胞外多糖的肥料用于种植蔬菜。
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