CN106265793A - 海洋红树植物老鼠簕提取物在制备治疗老年痴呆症药物中的应用 - Google Patents
海洋红树植物老鼠簕提取物在制备治疗老年痴呆症药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供海洋红树植物老鼠簕提取物在制备治疗和/或预防老年痴呆症药物中的应用,其中所述老鼠簕提取物通过下述方法制备:1)将老鼠簕叶置提取器中,以浓度为30%~95%的乙醇回流提取,老鼠簕叶与溶剂的重量体积比为1:10~30,提取时间1~3小时,提取次数1~3次,提取液合并,减压浓缩至无醇味,离心,收集上清液;将步骤1)获得的上清液通过聚酰胺层析柱,其中所述聚酰胺层析柱以5%的乙酸水溶液混悬聚酰胺填充,聚酰胺填料用量为老鼠簕叶重量的1~2倍,依次以水,10%乙醇洗脱3个柱体积,再以70%乙醇洗脱5个柱体积,收集70%乙醇段,减压浓缩,获得所述的老鼠簕提取物。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物制备领域,具体地涉及植物提取物的新用途。
背景技术
老年痴呆(又称阿尔兹海默症,Alzheimer’s Disease,简称AD),是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病,临床可表现为认知和记忆功能不断的恶化,日常生活能力进行性减退,并可有各种神经精神症状和行为障碍。据相关资料显示,早在2006年,全世界约有2600万人患有阿尔茨海默症,到2050年估计全球每85人就有1人罹患该病。据不完全统计,我国目前约有500万阿尔茨海默症患者,占世界的四分之一。随着人类寿命的延长,该病的发病率日益上升,已成为老年人的主要致死疾病之一,是仅次于心脏病、癌症、中风所导致老年人死亡的第四大杀手。
目前市面上治疗老年痴呆症的药物主要有两种:胆碱脂酶抑制剂(AChEI)和NMDA受体的拮抗剂。前者主要是通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性,减少乙酰胆碱的降解,从而提高脑内胆碱能水平,提高患者的认知力,代表药物为多奈哌齐。作为NMDA受体的拮抗剂,美金刚(memantine,Namenda)于2003年被美国FDA批准上市。尽管这些药物被广泛地应用,但大多只能减轻症状,提高病人的认知力,并不能用于治疗或者阻止疾病的恶化进程。因此迫切需要作用于新机制的药物出现。
老鼠簕(Acanthus illicifolius L)是一种生长在海岸潮间地带的红树林植物,属爵床科老鼠簕属植物,主要分布于印度、菲律宾、马来西亚等东南亚各国,在我国广东、广西、福建和海南等省也广泛分布。该植物为《全国中草药汇编》收录的药用红树植物之一。其性味微咸、凉;具有清热解毒、消肿散结、止咳平喘等功效。主治淋巴肿大、急慢性肝炎、肝脾肿大、胃痛、咳嗽、哮喘等。在印度、菲律宾等东南亚各国及我国海南民间广泛用于急慢性肝炎的治疗。
中国专利申请200810071371.3涉及“药用红树植物老鼠簕总黄酮的提取方法”,使用50~70%乙醇超声提取减压蒸馏获得老鼠簕总黄酮。中国专利申请201310267606.7涉及一种红树植物老鼠簕提取物的制备方法,采用70~80%乙醇回流法提取,得老鼠簕粗提液Ⅰ和残渣,然后将所得的残渣通过超声提取法,得老鼠簕粗提液Ⅱ,再将两次老鼠簕粗提液进行脱色、浓缩,即得到老鼠簕提取物。
本发明人在寻找新型抗老年痴呆症药物中发现老鼠簕具有一定的抗老年痴呆症作用,并通过老鼠簕叶提取纯化方法与抗老年痴呆症活性的相关性研究,发现通过在本发明提取条件下得到的老鼠簕提取物具有优异的抗老年痴呆症的效果,并通过实验,得出了针对抗老年痴呆症防治效果的实验动物有效剂量。
发明内容
本发明目的是提供用海洋红树植物老鼠簕提取物在制备治疗和/或预防老年痴呆症药物的用途。
根据本发明的一方面,海洋红树植物老鼠簕提取物可通过将老鼠簕叶经乙醇提取后,经聚酰胺柱层析得到。
具体的,海洋红树植物老鼠簕提取物的制备包括如下步骤:
(1)将老鼠簕叶药材置提取器中,以浓度为30%~95%的乙醇回流提取,老鼠簕叶药材与溶剂的重量体积比为1:10~30,提取时间1~3小时,提取次数1~3次,提取液合并,减压浓缩至无醇味,离心,得上清液。
(2)将步骤(1)中上清液通过聚酰胺层析柱,其中所述聚酰胺层析柱以5%的乙酸水溶液混悬聚酰胺填充,聚酰胺填料用量为老鼠簕叶药材的1~2倍,依次以水,10%乙醇洗脱3个柱体积,再以70%乙醇洗脱5个柱体积,收集70%乙醇段,减压浓缩,即为本发明中的老鼠簕提取物。
优选的,海洋红树植物老鼠簕提取物的制备可进一步优化为:
i)将老鼠簕叶药材置提取器中,以浓度为70%的乙醇回流提取,老鼠簕叶药材与溶剂的重量体积比为1:20,提取时间2小时,提取次数2次,提取液合并,减压浓缩至无醇味,离心,得上清液。
ii)将步骤(1)中上清液通过聚酰胺层析柱,聚酰胺填料用量为老鼠簕叶药材的1.5倍,依次以水,10%乙醇洗脱3个柱体积,再以70%乙醇洗脱5个柱体积,收集70%乙醇段,减压浓缩,即为本发明中的老鼠簕提取物。
用上述方法制备的老鼠簕提取物具有优异的抗老年痴呆症的效果,因此老鼠簕提取物具有应用于临床治疗和/或预防老年痴呆症的潜在应用价值。
具体实施方式
为更好地理解本发明的本质,下面通过对本发明较佳实施方式的进行描述,详细说明本发明但不限制本发明。
以下实施例中使用的材料和试剂,除特殊说明,均为普通市售。
实施例1:老鼠簕提取物1的制备
取老鼠簕叶药材(购自广州红树林种苗基地)5kg置提取器中,加100L浓度为70%的乙醇回流提取,提取2次,每次提取时间2小时,提取液合并,减压浓缩至无醇味,离心,得上清液。将上清液通过装有7.5L以5%的乙酸水溶液混悬聚酰胺填料(型号:PA66,规格:30~60目)填充的层析柱,依次以水,10%乙醇洗脱3个柱体积,再以70%乙醇洗脱5个柱体积,收集70%乙醇段,减压浓缩,得到老鼠簕提取物370g。
实施例2:老鼠簕提取物2的制备
取老鼠簕叶药材5kg置提取器中,加80L浓度为80%的乙醇回流提取,提取3次,每次提取时间3小时,提取液合并,减压浓缩至无醇味,离心,得上清液。将上清液通过装有10L以5%的乙酸水溶液混悬聚酰胺填料(型号:PA66,规格:30~60目)填充的层析柱,依次以水,10%乙醇洗脱3个柱体积,再以70%乙醇洗脱5个柱体积,收集70%乙醇段,减压浓缩,得到老鼠簕提取物390g。
实施例3:老鼠簕提取物3的制备
取老鼠簕叶药材5kg置提取器中,加80L浓度为80%的乙醇回流提取,提取3次,每次提取时间3小时,提取液合并,减压浓缩至无醇味,离心,得上清液。将上清液通过装有10L以水为溶剂混悬聚酰胺填料(型号:PA66,规格:30~60目)填充的层析柱,依次以水,10%乙醇洗脱3个柱体积,再以70%乙醇洗脱5个柱体积,收集70%乙醇段,减压浓缩,得到老鼠簕提取物338g。
中国专利申请200810071371.3公开了“药用红树植物老鼠簕总黄酮的提取方法”,以及中国专利申请201310267606.7公开了“红树植物老鼠簕提取物的制备方法”,分别使用50~80%和70~80%乙醇提取。在植物药提取工业中,通常选用70~80%左右的乙醇作为提取溶剂,因为对于常规药材而言,该浓度的乙醇提取效率更高,而不同浓度的乙醇提取得到的提取物有效成分的组成差别不大,主要在于含量不同。为此,本发明对比研究了与专利200810071371.3和专利201310267606.7所得到的提取物中总黄酮的含量。
分别完全按照专利200810071371.3方法提取得到提取物4,完全按照专利201310267606.7方法提取得到提取物5,采用常用的紫外分光光度法,以芦丁为对照品分别测定以上提取物1-4中的总黄酮含量,结果如下表:
表 不同提取方法得到的老鼠簕提取物中总黄酮含量
编号 | 提取物1 | 提取物2 | 提取物3 | 提取物4 | 提取物5 |
含量(%) | 56.3 | 55.5 | 40.6 | 23.1 | 19.8 |
通过以上对比说明,本发明老鼠簕药材经乙醇提取后,再通过聚酰胺色谱柱层析后,总黄酮含量得到大幅度提高。然而,常规采用的以水为溶剂填充的聚酰胺柱层析方法(如实施例3)虽然能够大幅度的提高老鼠簕提取物中的总黄酮含量,但最高含量只能达到40%左右,经过进一步的研究发现以5%的乙酸水溶液填充聚酰胺层析柱,可以将老鼠簕提取物中的总黄酮含量提高到55%以上,完全达到了中药、天然药物5类有效部位新药不低于50%的要求。
实施例4:老鼠簕提取物对Αβ25-35诱导的PC-12细胞损伤模型修复作用
老鼠簕提取物按照实施例1的方法制备。
细胞接板培养:取生长良好的PC-12细胞,用PBS平衡溶液清洗,经0.25%胰酶消化制成细胞悬液,计数后调节细胞浓度为1×105个/mL。将此细胞悬液接种于96孔细胞培养板中,每孔接种100μL,各孔各加入100μL D-hank’s平衡盐溶液。将接种细胞后的培养板置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养24小时,备用。
将接种后的96孔细胞培养板按列分组,依次设空白组、模型组、给药组1、给药组2、给药组3等。空白组每孔加入含水细胞营养液20μL,再加入30μL无菌蒸馏水;模型组每孔加入含水细胞营养液20μL,再加入30μLΑβ25-35(75μmol/L)溶液(β淀粉样蛋白25-35片段商品名:Αβ25-35,购自Sigma公司);给药组每孔加入不同浓度的含药细胞营养液20μL,再加入30μLΑβ25-35(75μmol/L)溶液;以上各组放入5%CO2、37℃恒温培养箱中培养48小时。
在各组细胞造模和给药培养48小时后,每孔分别加入0.5%MTT溶液各20μL,继续放入5%CO2、37℃恒温培养箱中培养4小时,吸弃孔内液体,分别加入150μL DMSO溶液,立即振摇10min,置酶标仪570nm处测定OD值(实验结果见表1)。
表1老鼠簕提取物抗Αβ25-35诱导的PC-12细胞损伤结果
(**表示与模型组比较p<0.05)
实验结果:不同浓度下的老鼠簕提取物均具有显著的抗Aβ诱导PC12细胞损伤作用。
Aβ是目前已知的老年痴呆主要病因,已有大量研究证实Αβ25-35几乎与内生性的Aβ片段具有同等的毒性,故常通过Αβ25-35造模老年痴呆模型。加入一定浓度的Αβ25-35后,PC12细胞的生长受到抑制,细胞的平均OD值显著下降,而加入不同浓度的老鼠簕提取物后,细胞OD值较模型组显著升高,说明不同浓度下的老鼠簕提取物均具有显著的抗Aβ诱导PC-12细胞损伤作用,从而在细胞层面证明不同浓度的老鼠簕提取具有抗老年痴呆的活性。
实施例5:老鼠簕提取物对小鼠记忆能力的影响
老鼠簕提取物按照实施例1的方法制备。
取ICR种小鼠60只(购自南京金莱生物科技有限公司),适应性饲养1周后,随机分成6组,每组10只,雌雄各半。分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。正常对照组、模型对照组分别每天灌胃0.5%CMC-Na溶液(给药体积,0.2ml/10g),阳性对照组每天灌胃石杉碱甲溶液(给药体积,0.2ml/10g),药物组分别灌胃不用浓度的药液(给药体积,0.2ml/10g)。连续给药2周后,除正常组外,腹腔注射东莨菪碱溶液1mg/kg,注射体积0.1ml/10g,连续注射5天。通过Y迷宫试验,以小鼠受到电击后逃避到安全区的次数作为考察指标,考察老鼠簕提取物对小鼠学习记忆能力的影响(实验结果见表2)。
表2小鼠Y迷宫学习记忆能力试验结果
(**表示与模型组比较p<0.01;*表示与模型组比较p<0.05)
试验结果表明:小鼠通过腹腔注射东莨菪碱后,模型组小鼠的学习记忆能力,与正常组相比,明显下降;而阳性对照组合给药组小鼠,相比模型组小鼠的学习记忆能力得到了明显的改善,其中石杉碱甲和高中剂量老鼠簕提取物组的正确次数显著提高。
Claims (3)
1.海洋红树植物老鼠簕提取物在制备治疗和/或预防老年痴呆症药物中的应用。
2.权利要求1所述的应用,其中老鼠簕提取物采用以下制备方法制备:
1)将老鼠簕叶置提取器中,以浓度为30%~95%的乙醇回流提取,老鼠簕叶与溶剂的重量体积比为1:10~30,提取时间1~3小时,提取次数1~3次,提取液合并,减压浓缩至无醇味,离心,收集上清液;
2)将步骤1)获得的上清液通过聚酰胺层析柱,其中所述聚酰胺层析柱以5%的乙酸水溶液混悬聚酰胺填充,聚酰胺填料用量为老鼠簕叶重量的1~2倍,依次以水,10%乙醇洗脱3个柱体积,再以70%乙醇洗脱5个柱体积,收集70%乙醇段,减压浓缩,获得所述的老鼠簕提取物。
3.权利要求2所述的应用,其中老鼠簕提取物的制备方法包括:
i)将老鼠簕叶置提取器中,以浓度为70%的乙醇回流提取,老鼠簕叶药材与溶剂的重量体积比为1:20,提取时间2小时,提取次数2次,提取液合并,减压浓缩至无醇味,离心,收集上清液;
ii)将步骤i)中获得的上清液通过聚酰胺层析柱,其中所述聚酰胺层析柱以5%的乙酸水溶液混悬聚酰胺填充,聚酰胺填料用量为老鼠簕叶药材的1.5倍,依次以水,10%乙醇洗脱3个柱体积,再以70%乙醇洗脱5个柱体积,收集70%乙醇段,减压浓缩,获得所述的老鼠簕提取物。
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