CN106265709A - 梓醇在制备防治或延缓肌无力和/或肌萎缩的药物中的应用 - Google Patents
梓醇在制备防治或延缓肌无力和/或肌萎缩的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了梓醇的医药用途,本发明通过实验发现梓醇能够显著改善糖尿病引起的肌无力和肌萎缩,逆转糖尿病引起的骨骼肌中I型肌纤维的缺失,结果表明梓醇能够增强骨骼肌抓力,改善糖尿病引起的运动能力下降,增加骨骼肌总重量以及腓肠肌和比目鱼肌重量,并且改善胰岛素抵抗,降低空腹血糖,从而改善糖尿病引起的肌无力和肌萎缩。因此梓醇可用于防治或延缓糖尿病引起的肌无力和/或肌萎缩。并且该药物可以从传统中药中提取,所用药物价格便宜、安全有效、容易获得,市场前景大好。
Description
技术领域
本发明涉及梓醇的一种医药用途,用于制备防治或延缓糖尿病引起的肌无力和/或肌萎缩的药物。
背景技术
糖尿病(Diabetes)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。血糖的升高是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损,或两者兼有而引起的。糖尿病早期(Pre-diabetes)是指血糖高于正常水平,但尚未达到糖尿病的诊断水平,即糖稳态受损期。主要分为空腹血糖受损(IFG)和糖耐量受损(IGT)两个阶段,最后发展成为糖尿病。随着人们饮食结构和生活习惯的改变,糖尿病发病率逐年升高,致死率、致残率也不断增加。据不完全统计,截止2012年全球糖尿病患者为371万人,早期糖尿病患者为642万人。糖尿病近端肌萎缩综合征(Bruns-Garland综合征)是经典的糖尿病性肌病,该症患病率约占所有糖尿病患者的0.8%,其特点是:主要累及下肢近端肌群,但远端也可受累,手部肌萎缩也较常见。临床呈亚急性、疼痛性、非对称性,常发生于2型糖尿病,并常伴肌无力、肌萎缩。
糖尿病肌病光镜下主要表现为肌纤维的萎缩,呈失神经性、继发性肌病改变。引起糖尿病肌病的因素包括糖尿病微血管病变、代谢紊乱和糖尿病神经病变以及遗传因素,但目前并未找到糖尿病肌病的确切病因和靶点,此外目前没有一种药物能够治愈糖尿病,单纯以降血糖为目的来防治或者延缓糖尿病性肌病疗效也甚微。基于以上原因,急需开发更为安全、有效的药物,以骨骼肌为治疗靶点,改善骨骼肌功能,促进葡萄糖在外周组织中的摄取与利用的降糖药,不仅能够降血糖而且都够防治或者延缓糖尿病性肌无力和肌萎缩。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供梓醇在制备防治或延缓糖尿病引起的肌无力和/或肌萎缩的药物中的应用。
为解决上述问题,本发明提供如下技术方案:用高脂饮食诱导早期糖尿病,转基因糖尿病鼠模拟2型糖尿病,研究梓醇对糖尿病引起的肌无力和/或肌萎缩的治疗作用。
本发明的有益效果在于:本发明公开了梓醇在制备防治或延缓糖尿病引起的肌无力和/或肌萎缩的药物中的应用,梓醇可以显著改善糖尿病引起的肌无力,逆转糖尿病引起的骨骼肌中I型肌纤维的缺失,改善胰岛素抵抗,降低空腹血糖,并且能够改善糖尿病引起的运动能力下降,因此梓醇可用于防治或延缓糖尿病引起的肌无力和/或肌萎缩。并且该药物可以从传统中药中提取,所用药物价格便宜、安全有效、容易获得,市场前景大好。
附图说明
图1为梓醇的化学结构式。
图2为不同处理组db/db小鼠体重曲线。
图3为不同处理组db/db小鼠空腹血糖及糖耐量结果图。
图4为不同处理组db/db小鼠骨骼肌重量及血清胰岛素含量结果图。
图5为骨骼肌肌纤维免疫组化染色及肌纤维分析图(A:野生型组;B:模型组;C:梓醇组)。
图6为早期糖尿病模型小鼠糖耐量和胰岛素耐量曲线图。
图7为早期糖尿病模型小鼠骨骼肌肌纤维免疫组化染色图。(A:野生型组;B:IFG模型组;C:IFG模型梓醇治疗组;D:IFG模型二甲双胍治疗组;E:IGT模型组;F:IGT模型梓醇治疗组;G:IGT模型二甲双胍治疗组)。
具体实施方式
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
db/db(C57BL/KsJ)小鼠是Leptin受体点突变导致leptin信号通路障碍,从而导致小鼠出现肥胖、胰岛素抵抗、高血糖、脂肪肝等症状。db/db小鼠出生后6周即可出现明显的肥胖和空腹血糖增加,饮水量、尿量增加,8-12周时血糖显著升高。db/db小鼠不仅有典型的糖尿病临床表现,也表现出心肌病、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病足、周围神经病变及肌无力等。
本发明所用实验动物为db/db转基因小鼠(命名为BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/Jnju)和C57BL/6NCrlVr小鼠,均购自南京大学南京生物医药研究院。
本发明中的药物为梓醇,其结构式如图1所示,全名脱对羟基苯甲酸梓苷,属环烯醚萜苷类化合物,是玄参科植物地黄中主要活性成分之一。
本发明降血糖所用阳性对照药为二甲双胍是临床上治疗糖尿病的一线药物。
实施例1
梓醇治疗糖尿病后期引起的肌无力的药效学评价,具体方法如下:购买db/db(C57BL/KsJ)小鼠12只,C57BL/6NCrlVr小鼠6只,野生型的C57BL/6NCrlVr小鼠作为正常对照NC组(n=6),db/db(C57BL/KsJ)小鼠按体重分层随机分为2组,分别命名为db/db模型组(n=6)和梓醇治疗组(200mg/kg,n=6)具体分组及给药方式如表1所示:
表1、实验小鼠具体分组及给药剂量和给药方式
组别 | 动物数 | 给药方式 | 给药剂量 | 首次给药时间点(8周龄) |
NC组 | 6 | 灌喂等体积蒸馏水 | 0.1ml/10g | 57d |
db/db模型组 | 6 | 灌喂等体积蒸馏水 | 0.1ml/10g | 57d |
梓醇治疗组 | 6 | 灌喂等体积梓醇 | 200mg/kg | 57d |
每天上午9时至10时给药,每周一上午10时至11时称量体重,电子称的称重范围是0.1至300g之间,其结果如图2所示。表明梓醇对db/db小鼠具有轻微增加体重的作用。
悬吊时间测定:给药第55天进行小鼠前、后肢抓力测定,测量神经肌肉运动强度,抓力感受装置是由平行的金属丝(直径5mm)构成的,使其倾斜于地面45°,将小鼠置于感受器缓慢旋转180°,装置离地面20cm预防小鼠掉落不足以造成伤害,秒表记录小鼠在钢丝抓握的时间,每只测3次取平均值,结果如表2所示。
表2、db/db小鼠悬杆实验时间统计结果
分组 | NC组 | db/db模型组 | 梓醇治疗组 |
时间(seconds) | 304±64.4 | 7.57±4.04* | 23.83±9.66*# |
*P<0.01vs NC组;#P<0.01vs模型组
结果表明,给药55天后梓醇治疗组较db/db模型组实验小鼠在吊前后肢抓力方面优于模型组,表明梓醇能够改善db/db小鼠高血糖引起的肌无力。
空腹血糖及糖耐量测定:每周二上午8时(隔夜禁食12h)麻醉眼眶静脉丛取血约100ul,2500rpm离心5min,取上层血清按葡萄糖检测试剂盒(威特曼生物科技南京有限公司)测定血糖含量。给药第50天进行糖耐量测定,隔夜禁食12h,腹腔注射葡萄糖(2g/kg,0.1ml/10kg),分别于0,30,60,90,120分钟测定血糖。空腹血糖及糖耐量结果如图3所示。
结果表明,梓醇能够显著降低db/db模型小鼠空腹血糖,并且能明显改善糖耐量受损。
给药56天(8周)后,于第57天(隔夜禁食12h)20%乌拉坦麻醉处死小鼠,腹股沟静脉取血,2500rpm离心5min,取上层血清测定胰岛素含量。随后解剖后肢总肌肉称重并快速液氮冷冻,第二天转移至负80冰箱备用。骨骼肌重量及胰岛素含量结果如图4所示。
结果表明,梓醇给药能增加db/db鼠骨骼肌重量,并且能显著改善胰岛素抵抗。
免疫组化标记骨骼肌I型肌纤维和II型肌纤维:骨骼肌切片用稀释的快收缩肌肌球蛋白抗体(MY-32,1∶500,Abcam公司,美国)4℃过夜,洗涤后用生物素化得鼠二抗室温孵育1h,染色洗涤后封片,于激光共聚焦下拍照。随后用image-Plus统计分析肌纤维比例,结果如图5所示。
结果表明,db/db模型组小鼠骨骼肌I型肌纤维较NC组显著缺失,梓醇治疗后能显著逆转I型肌纤维的缺失。
实施例2
梓醇治疗HFD诱导的早期糖尿病引起的肌无力的药效学评价,具体方法如下:购买C57BL/6NCrlVr小鼠64只,小鼠按体重分层随机分为8组,分别为NC对照组1(n=8),IFG模型组(n=8),梓醇治疗组1(n=8),二甲双胍治疗组1(n=8),NC对照组2(n=8),IGT模型组(n=8),梓醇治疗组2(n=8),二甲双胍治疗组2(n=8)。除NC对照组1和NC对照组2用正常饲料RD(南通特洛菲饲料科技有限公司)喂养,其他各组用高脂饲料HFD(TP24200,南通特洛菲饲料科技有限公司)喂养。HFD造模6周后验证空腹血糖调节受损(IFG)模型成功,NC对照组1(n=8),IFG模型组(n=8),梓醇治疗组1(n=8),二甲双胍治疗组1(n=8)开始给药,各组给药4周;HFD造模12周后验证胰岛素抵抗(IGT)模型成功,NC对照组2(n=8),IGT模型组(n=8),梓醇治疗组2(n=8),二甲双胍治疗组2(n=8)开始给药,各组给药4周。具体分组及给药方式如表3所示:
表3、实验小鼠具体分组及给药剂量和给药方式
悬吊时间测定:给药第26天进行小鼠前、后肢抓力测定,测量神经肌肉运动强度,抓力感受装置是由平行的金属丝(直径5mm)构成的,使其倾斜于地面45°,将小鼠置于感受器缓慢旋转180°,装置离地面20cm预防小鼠掉落不足以造成伤害,秒表记录小鼠在钢丝抓握的时间,结果如表4所示。
表4、小鼠前后肢悬吊时间
分组 | 时间(seconds) |
NC对照组1 | 107.76±27.52 |
IFG模型组 | 19.85±5.99* |
梓醇治疗组1 | 38.43±12.28*# |
二甲双胍治疗组1 | 32.33±10.29* |
NC对照组2 | 124.17±29.24 |
IGT模型组 | 21.5±7.24* |
梓醇治疗组2 | 48.5±19.16*# |
二甲双胍治疗组2 | 30±11.45* |
*P<0.01vs NC组;#P<0.01vs模型组
结果表明,给药26天后梓醇治疗组较IFG模型组和IGT模型组实验小鼠在吊前后肢抓力方面明显优于模型组,表明梓醇能够改善HFD诱导的早期糖尿病引起的肌无力,但是二甲双胍给药26天并不能改善HFD诱导的早期糖尿病引起的肌无力。
肌抓力测定:给药第26天进行小鼠前、后肢抓力测定,每只小鼠测3次,取平均值为该小鼠的最大肌抓力。结果如表5所示。
表5、小鼠肌抓力测定
分组 | 肌抓力(g) |
NC对照组1 | 93.89±6.02 |
IFG模型组 | 83.33±7.51 |
梓醇治疗组1 | 88.75±5.96 |
二甲双胍治疗组1 | 86.25±8.45 |
NC对照组2 | 96.67±3.60 |
IGT模型组 | 73.54±6.63* |
梓醇治疗组2 | 90.83±6.67# |
二甲双胍治疗组2 | 77.71±6.90* |
*P<0.01vs NC组;#P<0.01vs模型组
结果显示,IGT模型组肌抓力较NC对照组2明显下降,梓醇治疗4周明显改善HFD诱导的糖尿病早期的肌无力,但是二甲双胍并不能改善糖尿病引起的肌无力。
耗竭实验:给药第24天起对各组小鼠适应性跑台训练,速度为16m/min,连续训练3天,给药第27天进行耗竭实验,跑速开始为10m/min,每隔4分钟跑速增加2m/min,最大速度为36m/min,记录每只小鼠跑动的最大距离和跑动的时间。结果如表6所示。
表6、耗竭实验
分组 | 最大距离(m) | 时间(seconds) |
NC对照组1 | 1052±67.26 | 2850±138 |
IFG模型组 | 503.8±59.24 | 1728.7+167.7* |
梓醇治疗组1 | 751.4±41.15 | 2361±83.07# |
二甲双胍治疗组1 | 640±35.0 | 2147.4±71.2* |
NC对照组2 | 900.5±52.5 | 3346.7±201.3 |
IGT模型组 | 341.3±47,2 | 1347.5±118.6* |
梓醇治疗组2 | 490.8±41,2 | 1734.5±142.7*# |
二甲双胍治疗组2 | 306.5±107.7 | 1215.7±339.8* |
*P<0.01vs NC组;#P<0.01vs模型组
结果显示,高脂饮食能显著减少小鼠的运动距离和时间,而梓醇治疗4周后能在一定程度上恢复小鼠的体能,增加运动距离和运动时间,而二甲双胍并不能够有此疗效,因此梓醇能够改善HFD诱导的早期糖尿病引起的肌无力。
糖耐量和胰岛素耐量测定:糖耐量测定方案为给药第24天,隔夜禁食12h,腹腔注射葡萄糖(2g/kg,0.1ml/10kg),分别于0,30,60,90,120分钟测定血糖(威特曼生物科技南京有限公司)。胰岛素耐量方案为给药第26天,隔夜禁食12h,腹腔注射胰岛素(0.75U/kg,0.1ml/10kg),分别于0,15,30,60,120分钟测定血糖(威特曼生物科技南京有限公司)。糖耐量和胰岛素耐量结果如图6所示。
结果显示,梓醇和二甲双胍均能够显著改善糖耐量受损和胰岛素抵抗。
给药28天(4周)后,于第29天(隔夜禁食12h)20%乌拉坦麻醉处死小鼠,腹股沟静脉取血,2500rpm离心5min,取上层血清测定血糖。随后解剖后肢取腓肠肌和比目鱼肌称重,总骨骼肌快速液氮冷冻,第二天转移至负80冰箱备用。骨骼肌重量及空腹血糖含量结果如表7所示。
表7、腓肠肌,比目鱼肌重量以及空腹血糖含量
分组 | 空腹血糖(mmol) | 腓肠肌重量(mg) | 比目鱼肌重量(mg) |
NC对照组1 | 4.64±0.26 | 199.5±20.87 | 18.95±5.33 |
IFG模型组 | 6.18±0.78* | 156±24.24* | 19.75±1.67 |
梓醇治疗组1 | 5.45±0.78# | 192.25±27.98# | 21.78±6.06# |
二甲双胍治疗组1 | 5.94±0.59# | 132.25±19.05* | 19.71±1.38 |
NC对照组2 | 5.05±0.64 | 188.75±36.06 | 18.51±3.58 |
IGT模型组 | 6.21±0.99* | 157.85±37.53* | 16.72±2.99* |
梓醇治疗组2 | 3.05±1.02# | 242.23±51.26# | 20.85±3.36# |
二甲双胍治疗组2 | 4.09±0.64# | 178.85±20.39 | 14.4±2.59 |
*P<0.01vs NC组;#P<0.01vs模型组
结果显示,梓醇治疗4周降低空腹血糖作用比二甲双胍更明显,此外梓醇能够增加小鼠腓肠肌和比目鱼肌重量。
免疫组化标记骨骼肌I型肌纤维和II型肌纤维:骨骼肌切片用稀释的快收缩肌肌球蛋白抗体(MY-32,1∶500,Abcam公司,美国)4℃过夜,洗涤后用生物素化得鼠二抗室温孵育1h,染色洗涤后封片,于激光共聚焦下拍照。结果如图7所示。
结果表明,IFG模型组和IGT模型组小鼠骨骼肌I型肌纤维较NC组显著缺失,梓醇治疗后能显著逆转I型肌纤维的缺失,而二甲双胍无此疗效。
综上所述,本发明通过以国际公认的研究II型糖尿病的db/db转基因小鼠为模型小鼠以及高脂饮食喂养的C57小鼠为早期糖尿病模型,考察梓醇对糖尿病引起的肌无力和肌萎缩的治疗效果。从药效学、行为学和分子生物学等方面对梓醇对糖尿病引起的肌无力和肌萎缩的影响做了系统研究,结果显示:梓醇能有效改善糖尿病小鼠的高血糖,增加糖尿病鼠肌抓力,增加骨骼肌重量,改善其运动能力,为将梓醇开发治疗糖尿病引起的肌无力提供了理论研究基础。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (3)
1.梓醇在制备防治或延缓肌无力和/或肌萎缩的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的肌无力和/或肌萎缩是由糖尿病所引起的。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述的肌无力包括糖尿病早期和糖尿病晚期骨骼肌神经受损引起的肌无力;所述的肌萎缩包括糖尿病近端肌萎缩综合征(Bruns-Garland综合征)。
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