CN106255509A - 用于在归因于线粒体氧化磷酸化的复合体i相关损伤的乳酸性酸中毒或药物诱导的副作用的治疗中应用的琥珀酸酯前药 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在乳酸性酸中毒的治疗或预防中应用的琥珀酸酯前药。

Description

用于在归因于线粒体氧化磷酸化的复合体I相关损伤的乳酸 性酸中毒或药物诱导的副作用的治疗中应用的琥珀酸酯前药

技术领域

本发明涉及琥珀酸酯(琥珀酸盐，succinate)前药用于治疗线粒体相关病症，特别是与呼吸链的复合体I相关的病症的应用。特别是，本发明涉及琥珀酸酯前药用于治疗乳酸性酸中毒的应用。

背景技术

由药物诱导的线粒体毒性可以是所期望的治疗效果的一部分(例如由癌症药物诱导的线粒体毒性)，但在大多数情况下，由药物诱导的线粒体毒性是不需要的效果。线粒体毒性可以显著增加糖酵解以补偿线粒体ATP形成的细胞损失(通过氧化磷酸化)。这可能导致增加的乳酸(乳酸盐，lactate)血浆水平，如果过多的话，其会导致乳酸性酸中毒，其可能是致命的。A型乳酸性酸中毒主要与组织缺氧关联，而B型有氧乳酸性酸中毒则与药物、毒素或全身性疾病如肝病、糖尿病、癌症和先天性代谢缺陷(例如线粒体基因缺陷)关联。

许多已知的药物不利地影响线粒体呼吸(例如抗精神病药、局部麻醉剂和抗糖尿病药物)，因此，有必要确定或开发这样的方式，其可以用来规避或减轻由应用这样的药物所诱导的消极的线粒体作用。

发明内容

本发明提供了用于预防或治疗乳酸性酸中毒和线粒体相关的药物诱导的副作用的琥珀酸酯前药。特别地，琥珀酸酯前药用于预防或治疗在复合体I处或在复合体I的上游、或以其他方式表达的线粒体相关的药物诱导的副作用，本发明提供了琥珀酸酯前药，其用于预防或治疗药物诱导的复合体I的直接抑制或任何药物诱导的效应，其限制将NADH供应到复合体I(如但不限于，对克雷布斯循环、糖酵解、β-氧化、丙酮酸代谢以及甚至影响葡萄糖或其他底物的运输或水平的药物的影响)。通过使用在WO 2014 053617中描述的方法可以确认与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，并且iii)与在复合体I的有氧代谢上游中的缺陷、抑制或功能障碍，线粒体的缺陷、功能障碍或功能失调相关的副作用。

如上所述，在用可能具有线粒体相关的副作用的药物加以治疗的患者中经常观测到增加的乳酸血浆水平。本发明是基于这样的实验结果，其表明，在有关二甲双胍中毒的浓度下，二甲双胍(用于2型糖尿病的一线治疗并且其已与乳酸性酸中毒关联，作为罕见的副作用)以时间和剂量依赖性方式抑制在复合体I处的人类外周血细胞的线粒体功能。随着时间的推移，二甲双胍进一步引起乳酸生产的显著增加(通过完整血小板)。在二甲双胍暴露的完整血小板中，琥珀酸酯前药的使用显著减少乳酸生产。外源性施用的琥珀酸酯(底物本身)并不降低二甲双胍诱导的乳酸的生产。

在另一项研究中，在鱼藤酮抑制的血小板中(即，其中复合体I的功能受损的一种病况)，在几个小时内观测到乳酸的生产。琥珀酸酯前药(但不是琥珀酸酯)的使用减弱了完整的人类血小板中的鱼藤酮诱导的乳酸生产。在人成纤维细胞和人心脏肌肉纤维中重复呼吸计量法实验(Respirometric experiments)，并且证实了在血细胞中看到的发现。

因此，本发明提供了琥珀酸酯前药，其用于预防或治疗乳酸性酸中毒。然而，因为本文中报告的结果是基于乳酸性酸中毒，其与复合体I的直接抑制相关或与在复合体I处或在复合体I的上游的缺陷关联，所以设想了琥珀酸酯前药适用于预防或治疗在复合体I处或在复合体I的上游的线粒体相关的药物诱导的副作用。琥珀酸酯前药还会抵消扰乱在复合体I的上游的代谢的药物效应(复合体I的间接抑制，其会涵盖任何药物效应，其限制将NADH供应到复合体I，例如对克雷布斯循环、糖酵解、β-氧化、丙酮酸代谢以及甚至药物的影响，其会影响葡萄糖或其他底物的水平)。

设想了琥珀酸酯前药还可以用于工业应用，例如体外减少或抑制乳酸的形成。实例包括在细胞培养中、在器官保存等中的应用。

琥珀酸酯前药

设想了根据本发明可以使用任何琥珀酸酯前药，只要它可以渗透通过细胞膜或以其他方式通过胞质膜进入。与术语“受保护的琥珀酸酯”同义地使用术语“琥珀酸酯前药”。在本上下文中，琥珀酸酯前药是琥珀酸的衍生物，在给予以后体内或在施用以后体外，通过水解、酶促降解或以其他方式，其可以释放琥珀酸酯(或琥珀酸)。前部分用来改变琥珀酸酯的特性：从不可渗透通过胞质膜到可渗透通过胞质膜，或用来产生以其他方式可用于线粒体的琥珀酸酯。通常，前药的前部分被认为是治疗上惰性部分。然而，在本上下文中，前部分可以是惰性的，或它可以具有一定活性，只要它是所期望的活性或对患者不会产生任何伤害的活性。

特别感兴趣的是根据式A的受保护的琥珀酸酯：

其中R₁和R₂是相同或不同的并且选自式(B)

并且其中药物诱导的线粒体副作用是直接或间接的复合体I抑制以及其中R₃选自H，或可选取代的C₁-C₃烷基如例如甲基、乙基、丙基或异丙基以及其中R₅是–OC(＝O)R_a，其中R_a是甲基或式(C)

在一个具体方面，R₁和R₂是相同或不同的并且选自式(II)，其中R₃是H或甲基并且R_a是甲基或式(C)。

受保护的琥珀酸酯用于治疗或预防药物诱导的线粒体相关的副作用。特别是，它们用于治疗或预防直接或间接的药物诱导的复合体I线粒体相关的副作用。特别是，它们用于治疗或预防乳酸性酸中毒，如由药物诱导的乳酸性酸中毒。

本发明还涉及受保护的琥珀酸酯和可能诱导线粒体相关的副作用的药物的结合，特别是通过药物的复合体I的直接或间接的损伤所引起的副作用。这样的组合可以用作线粒体相关的副作用的预防性预防，或在出现副作用的情况下，用于缓解和/或治疗线粒体l相关的副作用。

设想了如下所述的琥珀酸酯前药会有效地治疗或预防药物诱导的副作用，特别是与复合体I的直接或间接抑制相关的副作用。在以下项目清单中给出根据本发明使用的化合物的实例：

1.式(I)的受保护的琥珀酸酯

其中R₁是H、药用盐、可选取代的烷基或式(II)的基团，并且R₂独立地是根据式(II)的基团，其中式(II)是

其中R₃是H、可选取代的C₁-C₃烷基，或通过式COO(CR’R”)O的基团与R₅连接在一起以形成环，其中R’和R”独立地是H、可选取代的C₁-C₃烷基，或连接在一起以形成环；

R₄是H；

R₅是OCOR_a、OCOOR_b、OCONR_cR_d、SO₂R_e、OPO(OR_f)(OR_g)、CONR_cR_d或通过式COO(CR’R”)O的基团连接于R₃以形成环，其中R’和R”独立地是H、可选取代的C₁-C₃烷基，或连接在一起以形成环；其中

R_a是甲基、乙基、CH(CH₃)₂或C(CH₃)₃或环烷基；

R_b是甲基、乙基、CH(CH₃)₂或C(CH₃)₃或环烷基；

R_c和R_d独立地是H、甲基或乙基或连接在一起以形成环，其可以含有一个或多个另外的杂原子；

R_e是可选取代的烷基；并且

R_f和R_g独立地是H、甲基、乙基或连接在一起以形成环。

2.根据项目1的受保护的琥珀酸酯，其中R₁是C₁-C₃烷基或式(II)的基团并且R₂独立地是根据式(II)的基团，其中式(II)是

其中R₃是H、C₁-C₃烷基，或通过式COO(CR’R”)O的基团与R₅连接在一起以形成环，其中R’和R”独立地是可选取代的C₁-C₃烷基；

R₄是H；

R₅是OCOR_a、OCOOR_b、或CONR_cR_d

其中

R_a是甲基、乙基或^tBu；

R_b是甲基、乙基或^tBu；

R_c和R_d独立地是甲基或乙基。

3.根据项目1-2的受保护的琥珀酸酯，其中R₃是甲基或乙基。

4.根据项目1-2的受保护的琥珀酸酯，其中R₃是H。

5.根据项目1-2的受保护的琥珀酸酯，其中R₁是甲基。

6.根据项目1-2的受保护的琥珀酸酯，其中R₅是可选取代的甲基或乙基酯。

7.项目1-2的受保护的琥珀酸酯，由式IV表示

其中每个R₇独立地是H、甲基或乙基并且每个R₆独立地是H或甲基。

8.项目1-2的受保护的琥珀酸酯，其中R_c和R_d是甲基或乙基。

9.根据项目1-2的受保护的琥珀酸酯，其中R’和R”独立地是甲基或乙基。

10.根据项目1-2的受保护的琥珀酸酯，其中R₃和R₅通过式COO(CR’R”)O的基团连接在一起以形成式(V)的环

其中R₄是H并且R’和R”独立地是H、可选取代的C₁-C₃烷基，或连接在一起以形成环。

11.根据式(Va)的项目11的受保护的琥珀酸酯

12.式(XIII)的受保护的琥珀酸酯

其中每个R₇独立地是H、甲基或乙基，并且R₆独立地是H或甲基，并且R₈是H、甲基或根据式(XIV)的部分

其中R₇独立地是H、甲基或乙基并且R₆独立地是H或甲基。

13.式(XV)的受保护的二琥珀酸酯

其中每个R₇独立地是H、甲基或乙基并且每个R₆独立地是H或甲基。

14.根据前述项目中任一项的受保护的琥珀酸酯，其中化合物选自化合物号3、5、8、10、13、14、16、17或18。

15.根据前述项目中任一项的受保护的琥珀酸酯，其中化合物选自化合物号3、5、13、14、17或18。

16.如在项目1-15中任一项所定义的受保护的琥珀酸酯，用于刺激线粒体能量生产。

在以下清单A中给出另一类的琥珀酸酯类似物：

1A.根据本发明的化合物由式(I)给出

或其药用盐，其中在A和B之间的虚线键表示可选键以形成闭环结构，并且其中

Z选自–CH₂-CH₂-或>CH(CH₃)，

A选自-SR、-OR和NHR，并且R是

B选自-O-R’、-NHR”、-SR”’或-OH；并且R’选自以下式(II)至(IX)：

R’、R”和R”’独立地是不同的或相同的并且选自以下式(IV-VIII)：

R₁和R₃独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基、CH₂X-酰基、F、CH₂COOH、CH₂CO₂烷基，

X选自O、NH、NR₆、S，

R₂选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、C(O)CH₃、C(O)CH₂C(O)CH₃、C(O)CH₂CH(OH)CH₃，

p是整数并且是1或2

R₆选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、或式(II)、或式(VIII)

X₅选自–H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、-C(＝O)XR₆、CONR₁R₃或是式

X₇选自R₁、-NR₁R₃，

R₉选自H、Me、Et或O₂CCH₂CH₂COXR₈

R₁₀选自O酰基、NH烷基、NH酰基、或O₂CCH₂CH₂COX₆R₈

X₆选自O、NR₈、NR₆R₈，其中R₆和R₈独立地是不同的或相同的并且选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、或式(II)、或式(VIII)，

R₁₁和R₁₂独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X酰基，其中X是O、NR₆或S，

R_c和R_d独立地是不同的或相同的并且选自CH₂X烷基、CH₂X酰基，其中X＝O、NR₆或S，

R₁₃、R₁₄和R₁₅独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基；

R13和R14或R13和R15上的取代基可以桥接以形成环体系，

R_f、R_g和R_h独立地是不同的或相同的并且选自X酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X-酰基和R₉，

烷基选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基，

酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、苯甲酰基，

酰基和/或烷基可以是可选取代的，并且

当存在在A和B之间的虚线键时，根据式(I)的化合物是

其中X₄选自–COOH、-C(＝O)XR₆、

2A.根据项目1A的化合物，具有式(IA)

或其药用盐，其中

Z是–CH₂-CH₂-，

A选自-SR、-OR和NHR，并且R是

B选自-O-R’、-NHR”、-SR”’或-OH；并且

R’、R”和R”’独立地是不同的或相同的并且选自以下式之一：

R₁和R₃独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、O-Me、O-Et、O-丙基，

X选自O、NH、S，

p是整数并且是1，

R₆选自H、Me、Et，

X₅选自-H、Me、Et、-COOH、-C(＝O)XR₆、CONR₁R₃

X₇选自R₁、-NR₁R₃，

R₁₃、R₁₄和R₁₅独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基，其中烷基和酰基是如在本文中前面所定义的。

3A.根据项目1A或2A的化合物，具有式(IA)

或其药用盐，其中

Z是–CH₂-CH₂-，

A选自-SR、-OR和NHR，并且R是

B选自-O-R’、-NHR”、-SR”’或-OH；并且

R’、R”和R”’独立地是不同的或相同的并且选自以下式之一：

R₁和R₃独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、O-Me、O-Et、O-丙基，

X选自O、NH、S，

p是整数并且是1，

R₆选自H、Me、Et，

X₅选自-H、Me、Et、-COOH、-C(＝O)OR₆、CONR₁R₃，

X₇选自R₁、-NR₁R₃，

R₁₃、R₁₄和R₁₅独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、-COOH。

4A.根据前述项目中任一项的化合物，其中Z是-CH₂CH₂-并且A是-SR。

5A.根据前述项目中任一项的化合物，其中Z是-CH₂CH₂-，A是-SR，并且B是OH或SR”’。

6A.根据前述项目中任一项的化合物，其中Z是-CH₂CH₂-，A是-SR，B是OH或SR”’，其中R”’是

7A.根据前述项目中任一项的化合物，其中Z是-CH₂CH₂-，A是SR并且B是OH。

8A.根据项目1A-6A中任一项的化合物，其中Z是-CH₂CH₂-，A是SR，B是OH或SR”’，其中R”’是

9A.根据项目1A-3A中任一项的化合物，其中Z是-CH₂CH₂-，A是NR，B是OH并且R是

并且X是S。

10A.根据前述项目中任一项的化合物，其中R和/或R”’是

并且p＝1以及X₅是–H使得式(VII)是

11A.根据项目1A-9A中任一项的化合物，其中R和/或R”’是

并且p＝1以及X₅是COXR₆使得式(VII)是

12A.根据项目1A-9A中任一项的化合物，其中R和/或R”’是

并且p＝1以及X₅是CONR₁R₃使得式(VII)是

13A.根据前述项目中任一项的化合物，其中化合物选自：

其他合适的化合物见以下清单(B)

1.根据式(I)的化合物

或其药用盐，其中虚线键表示在A和B之间的可选键以形成环状结构，并且其中

Z选自–CH₂-CH₂-ak>CH(CH₃)，

A和B独立地是不同或相同的并且选自-OR、-O-R’、-NHR”、-SR”’或–OH，A和B都不是–OH，其中R是

R’选自以下式(II)、(V)或(IX)：

R’、R”和R”’独立地是不同的或相同的并且选自以下式(VII-VIII)：

R₁和R₃独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基、CH₂CH₂CH₂OC(＝O)CH₂CH₂COX₆R₈或

X选自O、NH、NR₆、S，

R₂选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、C(O)CH₃、C(O)CH₂C(O)CH₃、C(O)CH₂CH(OH)CH₃，

p是整数并且是1或2，

R₆选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、或式(II)、或式(VIII)

X₅选自-H、-COOH、-C(＝O)XR₆、CONR₁R₃或以下式之一

R₉选自H、Me、Et或O₂CCH₂CH₂COXR₈，

R₁₀选自O酰基、NH烷基、NH酰基、或O₂CCH₂CH₂CO X₆R₈，

X₆是O或NR₈，并且R₈选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、或式(II)、或式(VIII)，

R₁₁和R₁₂独立地是相同或不同的并且选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X酰基，其中X选自O、NR₆或S，

R₁₃、R₁₄和R₁₅独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基

R_c和R_d独立地是CH₂X烷基、CH₂X酰基，其中X＝O、NR₆或S，并且烷基是例如H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基，并且酰基是例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、苯甲酰基等。

R_f、Rg和Rh独立地选自X酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X-酰基和R₉，

烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、异戊基、己基、异己基、庚基、辛基、壬基或癸基，并且酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、苯甲酰基等，

R₂₀和R₂₁独立地是不同的或相同的并且选自H、低级烷基，即C₁-C₄烷基，或R₂₀和R₂₁可以一起形成C₄-C₇环烷基或芳族基团，其两者可以可选地被卤素、羟基或低级烷基取代，或

R₂₀和R₂₁可以是

或

CH₂X-酰基、F、CH₂COOH、CH₂CO₂烷基，并且

当在A和B之间存在环键时，上述化合物是

或

并且酰基和烷基可以是可选取代的。

2B.根据项目1B的化合物，其中Z选自–CH₂-CH₂-或>CH(CH₃)，A选自-O-R，其中R是

B选自-O-R’、-NHR”、-SR”’或-OH，其中R’选自上述式(II)、(V)或(IX)，R’、R”和R”’独立地是不同的或相同的并且选自上述式(VII)或(VIII)。

3B.根据项目1B或2B的化合物，其中Z是-CH₂CH₂-并且A是–OR。

4B.根据前述项目中任一项的化合物，其中A是–OR，并且B选自-OR’、-NHR”、-SR”’或-OH，并且R’、R’、R”和R”’是如上文所描述的。

5B.根据前述项目中任一项的化合物，其中A选自-O-R，其中R是

并且R₁或R₃是CH₂CH₂CH₂OC(＝O)CH₂CH₂COX₆R₈，并且B是–OR’或-OH。

6B.根据项目1B-4B中任一项的化合物，其中A是–OR，并且B是–OH或–OR’，并且其中R’选自如上述所定义的式(VII)或式(VIII)。

7B.根据项目1B-4B中任一项的化合物，其中A选自-O-R，其中R是

并且R₁或R₃是

并且B是–OR’或–OH。

8B.根据前述项目中任一项的化合物，其中Z是-CH₂CH₂-。

9B.根据前述项目中任一项的化合物，其中Z是-CH₂CH₂-，A是–OR并且B是–OH。

10B.根据前述项目中任一项的化合物，其中A是–OR并且R是式(II)：

11B.根据前述项目中任一项的化合物，其中式(VII)是

12B.根据前述项目中任一项的化合物，其中在式(IX)中的R_f、R_g、R_h的至少一种是–H或烷基，其中烷基是如本文所定义。

13B.根据前述项目中任一项的化合物，其中A是–OR并且R₁或R₃是

或者R₁或R₃是CH₂CH₂CH₂OC(＝O)CH₂CH₂COX₆R₈。

定义

冠词“一”和“一个“在本文中用来指一个或一个以上的(即至少一个)物品的语法对象。以举例的方式，“类似物”是指一个类似物或一个以上的类似物。

术语“琥珀酸酯前药”在本文中用来指这样的物质，其i)可以释放琥珀酸或琥珀酸酯，例如通过水解或酶促降解，或ii)可以被转化成琥珀酸酯，例如通过酶。术语“受保护的琥珀酸酯”和“琥珀酸酯的前体”与术语“琥珀酸酯前药”是同义词。如本文所说明的，细胞可渗透的琥珀酸酯前药是优选的。

如在本文中所使用的，术语“生物利用率”是指在给予以后在生物活性的部位药物或其他物质被吸收或变为可用的程度或速率。这种性能取决于许多因素，包括化合物的溶解度，在肠道中的吸收速率，蛋白结合的程度和代谢等。在本文中描述了将是本领域的技术人员熟悉的针对生物利用率的各种测试(还见Trepanier et al,1998,Gallant-Haidneret al,2000)。

如在本文中所使用的，关于呼吸链的复合体I使用的术语“损伤”、“抑制”、“缺陷”旨在表示，给定药物对复合体I或对在复合体I的上游的线粒体代谢具有负面影响，其可以涵盖任何药物效应，其限制NADH供应到复合体I，例如对克雷布斯循环、糖酵解、β-氧化、丙酮酸代谢和甚至药物的影响，该药物影响葡萄糖或其他复合体I相关底物的运输或水平)。如本文所描述的，在受试者中过量的乳酸往往是对包括复合体I的有氧呼吸的负面影响的指示。

如在本文中所使用的，相对于呼吸链的复合体I的功能使用的术语“副作用”可以是与乳酸性酸中毒相关的副作用，或它可以是与特应性药物器官毒性相关的副作用，例如肝毒性、神经毒性、心脏毒性、肾毒性和肌肉毒性，包括但不限于，例如眼肌麻痹、肌病、感音神经性听力损伤、癫痫、中风、中风样事件、共济失调、上睑下垂、认知障碍、意识状态改变、神经病性疼痛、多神经病、神经性胃肠道问题(胃食管反流、便秘、肠假性梗阻)、近端肾小管功能障碍、心脏传导缺陷(心传导阻滞)、心肌病、低血糖症、糖异生缺陷、非酒精性肝衰竭、视神经病变、视力丧失、糖尿病和胰腺外分泌衰竭、疲劳、呼吸问题(包括间歇性缺氧)。

如在本文中所使用的，在广义上理解相对于术语“副作用”的术语“药物诱导的”。因此，它不仅包括药物，而且包括可能导致乳酸的不需要的存在的其他物质。实例是除草剂、毒蘑菇、浆果等。

琥珀酸酯前药的药用盐包括形成自药用无机或有机酸或碱的常规盐以及季铵酸加成盐。适宜的酸式盐的更具体的实例包括以下酸的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、硬脂酸、单宁酸等。其他酸如草酸，虽然本身不是药用的，在获得本发明的化合物和它们的药用盐中，可以用于制备可用作中间物的盐。适宜的碱式盐的更具体的实例包括钠盐、锂盐、钾盐、镁盐、铝盐、钙盐、锌盐、N,N'-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、胆碱盐、二乙醇胺盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐和普鲁卡因盐。

如在本文中所使用的，术语“烷基”是指仅由sp3碳原子组成的、用氢原子完全饱和的任何直链或支链，如例如针对直链烷基的–C_nH_2n+1，其中n可以是在1至10的范围内，如例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、异戊基、己基、异己基、庚基、辛基、壬基或癸基。如在本文中所使用的烷基可进一步被取代。

如在本文中所使用的，术语“环烷基”是指通式为–C_nH_2n-1的环状/环结构的碳链，其中n是在3-10之间，如例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基、双环[3.2.1]辛基、螺[4,5]癸基、降蒎烷基、降冰片基、降蒈烷基、金刚烷基等。

如在本文中所使用的，术语“烯烃”是指由碳和氢原子组成的直链或支链，其中通过双键来连接至少两个碳原子，如例如C_2-10链烯基不饱和烃链，其具有两个至十个碳原子和至少一个双键。C_2-6链烯基包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、异丙烯基、正丁烯基、正戊烯基、正己烯基等。

在本上下文中，术语"C_1-10烷氧基"是指单独使用或组合使用的基团-O-C-_1-6烷基，其中C_1-10烷基是如上述所定义。线性烷氧基的实例是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基和已氧基。分支烷氧基的实例是异丙氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、异戊氧基和异已氧基。环状烷氧基的实例是环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基和环己氧基。

如在本文中所使用的，术语"C_3-7杂环烷基"表示完全饱和的杂环的自由基，如在环中含有一个或多个杂原子的环烃，其中上述杂原子独立地选自氮、氧和硫。杂环的实例包括但不限于吡咯烷(1-吡咯烷、2-吡咯烷、3-吡咯烷、4-吡咯烷、5-吡咯烷)、吡唑烷(1-吡唑烷、2-吡唑烷、3-吡唑烷、4-吡唑烷、5-吡唑烷)、咪唑烷(1-咪唑烷、2-咪唑烷、3-咪唑烷、4-咪唑烷、5-咪唑烷)、噻唑烷(2-噻唑烷、3-噻唑烷、4-噻唑烷、5-噻唑烷)、哌啶(1-哌啶、2-哌啶、3-哌啶、4-哌啶、5-哌啶、6-哌啶)、哌嗪(1-哌嗪、2-哌嗪、3-哌嗪、4-哌嗪、5-哌嗪、6-哌嗪)、吗啉(2-吗啉、3-吗啉、4-吗啉、5-吗啉、6-吗啉)、硫代吗啉(2-硫代吗啉、3-硫代吗啉、4-硫代吗啉、5-硫代吗啉、6-硫代吗啉)、1,2-氧杂四氢噻吩(1,2-oxathiolane)(3-(1,2-氧杂四氢噻吩)、4-(1,2-氧杂四氢噻吩)、5-(1,2-氧杂四氢噻吩))、1,3-二氧戊环(2-(1,3-二氧戊环)、3-(1,3-二氧戊环)、4-(1,3-二氧戊环))、四氢吡喃(2-四氢吡喃、3-四氢吡喃、4-四氢吡喃、5-四氢吡喃、6-四氢吡喃)、六氢哒嗪(hexahydro pyradizine)，(1-(六氢哒嗪)、2-(六氢哒嗪)、3-(六氢哒嗪)、4-(六氢哒嗪)、5-(六氢哒嗪)、6-(六氢哒嗪))。

如在本文中所使用的，术语"C_1-10烷基-C_3-10环烷基"是指通过如上述所定义的具有指定数目的碳原子的烷基所连接的如上述所定义的环烷基。

如在本文中所使用的，术语"C_1-10烷基-C_3-7杂环烷基"是指通过如上述所定义的具有指定数目的碳原子的烷基所连接的如上述所定义的杂环烷基。

如在本文中所使用的，术语"芳基"旨在包括碳环芳族环体系。芳基还旨在包括以下列举的碳环体系的部分氢化衍生物。

如在本文中所使用的，术语"杂芳基"包括含有一个或多个杂原子的杂环不饱和环体系，其中上述杂原子选自氮、氧和硫，如呋喃基、噻吩基、吡咯基，并且还旨在包括以下列举的杂环体系的部分氢化衍生物。

如在本文中所使用的，术语"芳基"和"杂芳基"是指这样的芳基，其可以是可选未取代的或单、二或三取代的，或杂芳基，其可以是可选未取代的或单、二或三取代的。"芳基"和"杂芳基"的实例包括但不限于苯基、联苯基、茚基、萘基(1-萘基、2-萘基)、N-羟基四唑基、N-羟基三唑基、N-羟基咪唑基、蒽基(1-蒽基、2-蒽基、3-蒽基)、菲基、芴基、并环戊二烯基(pentalenyl)、薁基(azulenyl)、亚联苯基、苯硫基(1-噻吩基、2-噻吩基)、呋喃基(furyl)(1-呋喃基、2-呋喃基)、呋喃基(furanyl)、苯硫基、异噁唑基、异噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、吡喃基、哒嗪基、吡嗪基、1,2,3-三嗪基、1,2,4-三嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、四唑基、噻二嗪基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并苯硫基(硫杂茚基)、吲哚基、噁二唑基、异噁唑基、喹唑啉基、芴基、呫吨基、异茚满基、二苯甲基、吖啶基、苯并异恶唑基、嘌呤基、喹唑啉基、喹嗪基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、二氮杂萘基、蝶啶基、氮杂基、二氮杂基、吡咯基(2-吡咯基)、吡唑基(3-吡唑基)、5-噻吩-2-基-2H-吡唑-3-基、咪唑基(1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基)、三唑基(1,2,3-三唑-1-基、1,2,3-三唑-2-基、1,2,3-三唑-4-基、1,2,4-三唑-3-基)、噁唑基(2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、噻唑基(2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、吡啶基(2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、嘧啶基(2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基)、吡嗪基、哒嗪基(3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基)、异喹啉基(1-异喹啉基、3-异喹啉基、4-异喹啉基、5-异喹啉基、6-异喹啉基、7-异喹啉基、8-异喹啉基)、喹啉基(2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、苯并[b]呋喃基(2-苯并[b]呋喃基、3-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、2,3-二氢-苯并[b]呋喃基(2-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基)、3-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基)、4-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基)、5-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基)、6-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基)、7-(2,3-二氢-苯并[b]呋喃基))、苯并[b]苯硫基(2-苯并[b]苯硫基、3-苯并[b]苯硫基、4-苯并[b]苯硫基、5-苯并[b]苯硫基、6-苯并[b]苯硫基、7-苯并[b]苯硫基)、2,3-二氢-苯并[b]苯硫基(2-(2,3-二氢-苯并[b]苯硫基)、3-(2,3-二氢-苯并[b]苯硫基)、4-(2,3-二氢-苯并[b]苯硫基)、5-(2,3-二氢-苯并[b]苯硫基)、6-(2,3-二氢-苯并[b]苯硫基)、7-(2,3-二氢-苯并[b]苯硫基))、吲哚基(1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、吲唑基(1-吲唑基、2-吲唑基、3-吲唑基、4-吲唑基、5-吲唑基、6-吲唑基、7-吲唑基)、苯并咪唑基(1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基、6-苯并咪唑基、7-苯并咪唑基、8-苯并咪唑基)、苯并噁唑基(1-苯并噁唑基、2-苯并噁唑基)、苯并噻唑基(1-苯并噻唑基、2-苯并噻唑基、4-苯并噻唑基、5-苯并噻唑基、6-苯并噻唑基、7-苯并噻唑基)、咔唑基(1-咔唑基、2-咔唑基、3-咔唑基、4-咔唑基)。部分氢化的衍生物的非限制性实例是1,2,3,4-四氢萘基、1,4-二氢萘基、吡咯啉基、吡唑啉基、二氢吲哚基、噁唑烷基、噁唑啉基、氧杂吖庚因基(oxazepinyl)等。

如在本文中所使用的，术语“酰基”是指羰基–C(＝O)R，其中R基团是任何上述定义的基团。具体实例是甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、苯甲酰基等。

以下示出示例性化合物，作为编号1-18。在本文中的清单中给出其他示例性化合物：

已知引起复合体I缺陷、功能障碍或损伤和/或已知具有乳酸性酸中毒作为副作用的药物是：

镇痛药，包括对乙酰氨基酚、辣椒素

抗心绞痛药，包括胺碘酮、哌克昔林

抗生素，包括利奈唑胺、曲伐沙星、庆大霉素

抗癌药物，包括醌类，包括丝裂霉素C、阿霉素

抗惊厥药物，包括丙戊酸

抗糖尿病药物，包括二甲双胍、苯乙双胍、丁基双胍、曲格列酮和罗格列酮、吡格列酮

抗乙型肝炎，包括非阿尿苷

抗组胺药

抗帕金森病，包括托卡朋

抗精神病药：利培酮

抗精神分裂症：佐替平、氯氮平

抗菌剂：季铵化合物(QAC)

抗结核药，包括异烟肼

贝特类，包括氯贝特、环丙贝特、辛伐他汀

催眠药，包括丙泊酚

免疫抑制疾病-改进抗风湿药物(DMARD)：来氟米特

局部麻醉剂，包括布比卡因、双氯芬酸、吲哚美辛、和利多卡因

肌肉松弛药，包括丹曲林

精神安定药，包括抗精神病精神安定药如氯丙嗪、氟非那嗪和氟哌啶醇

NRTI(核苷酸逆转录酶抑制剂)，包括依法韦仑、替诺福韦、恩曲他滨、齐多夫定、拉米夫定、利匹韦林、阿巴卡韦、二脱氧肌苷

NSAID，包括尼美舒利、甲芬那酸、舒林酸

巴比妥酸

已知具有乳酸性酸中毒作为副作用的其他药物，包括β2-激动剂、肾上腺素、茶碱。酒精和可卡因也可能导致乳酸性酸中毒。

此外，设想了琥珀酸酯前药还可以有效地治疗或预防乳酸性酸中毒，即使它不与复合体I缺陷相关。

药物和琥珀酸酯前药的组合

本发明还涉及药物和琥珀酸酯前药的组合，用于治疗和/或预防药物诱导的副作用，其选自乳酸性酸中毒和与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，其中

i)药物用于治疗药物所适应的疾病，并且

ii)琥珀酸酯前药用于预防或减轻由药物诱导或可诱导的副作用，其中副作用选自乳酸性酸中毒和与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用。

这样的药物与任何琥珀酸酯前药的任何组合是在本发明的范围之内。因此，基于本文的披露内容，本领域技术人员会理解，本发明的要旨是琥珀酸酯前药避免或减少本文描述的副作用的有价值性能的发现。因此，根据本公开内容，连同具有或潜在具有本文描述的副作用的任何药物一起，能够进入细胞以及递送琥珀酸酯和可能的其他活性部分的琥珀酸酯前药的潜在用途是显而易见的。

本发明进一步涉及

i)包含药物和琥珀酸酯前药的组合物，其中药物具有潜在的药物诱导的副作用，其选自乳酸性酸中毒和与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，

ii)如在上文i)下描述的组合物，其中琥珀酸酯前药用于预防或减轻由药物诱导或可诱导的副作用，其中上述副作用选自乳酸性酸中毒和与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用。

上述组合物可以具有两个独立的包的形式：

第一包，含有药物或包含药物的组合物，以及

第二包，含有琥珀酸酯前药或包含琥珀酸酯前药的组合物。上述组合物还可以是包含药物和琥珀酸酯前药的单一组合物。

在组合物包含两个独立的包的情况下，可以通过不同的给予途径来给予药物和琥珀酸酯前药(例如，药物是通过口服给予而琥珀酸酯前药是通过肠胃道外或粘膜给予)和/或可以基本上同时给予它们或可以在琥珀酸酯前药以前给予药物(反之亦然)。

可以通过任何常规方法来给予琥珀酸酯前药、其组合或组合物，例如但不限于胃肠道外、口服地、局部(包括颊部、舌下或透皮)、经由医疗装置(例如支架)、通过吸入或通过注射(皮下或肌内)。治疗可以包括单剂量或在一段时间内的多剂量。

尽管有可能单独给予本发明的化合物，但优选的是，作为连同一种或多种可接受的载体一起的药物制剂，来提供它。在相容与本发明的化合物并且对其接受者没有害处的意义上，载体必须是“可接受的”。下文更详细地描述适宜的载体的实例。

可以以单位剂量形式来方便地提供并且可以通过在制药领域中众所周知的任何方法来制备组合物。这样的方法包括以下步骤：将活性组分(琥珀酸酯前药以及，可选的如本文所描述的药物)和载体结合，载体构成一种或多种辅助组分。通常，通过均匀且紧密地将活性组分和液体载体或细分的固体载体或两者结合来制备制剂，然后，如果有必要，使产物成形。

通常将静脉内、口服地或通过任何胃肠道外途径，以包含活性组分的药物制剂的形式，可选地以无毒的有机或无机酸、或碱、加成盐的形式，以药用剂型，来给予琥珀酸酯前药、其组合或组合物。取决于待治疗的病症和患者、以及给予途径，可以以不同的剂量来给予组合物。

适用于注射用的本发明的药物组合物包括无菌水溶液或分散体。此外，组合物可以具有无菌粉末的形式，用于上述无菌可注射溶液或分散体的临时制备。在所有情况下，最终可注射的形式必须是无菌的并且必须是有效的流体以易于注射。

药物组合物在制造和储存的条件下必须是稳定的，因此，优选地应加以保存以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油、以及它们的适宜的混合物。

例如，可以口服地、颊部或舌下地，以片剂、胶囊剂、珠粒(ovules)、酏剂、溶液剂或悬浮剂的形式来给予本发明的化合物，其可以含有增香剂或着色剂，用于立即释放、延迟释放或控制释放的应用。

适用于口服的本发明的化合物的溶液剂或悬浮剂还可以含有赋形剂例如N,N-二甲基乙酰胺，分散剂例如聚山梨酯80，表面活性剂以及增溶剂例如聚乙二醇、Phosal 50PG(其由磷脂酰胆碱、大豆脂肪酸、乙醇、甘油单酯/甘油二酯、丙二醇和抗坏血酸棕榈酸酯组成)。

上述片剂可以含有赋形剂如微晶纤维素、乳糖(例如，乳糖一水合物或无水乳糖)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸、丁基化羟基甲苯(E321)、交联聚乙烯吡咯烷酮、羟丙甲纤维素，崩解剂如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠、和某些复合硅酸盐，以及造粒粘结剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、聚乙二醇8000、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，可以包括润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石粉。羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯也可用作赋形剂。然而，此物质并不涵盖在本发明内，因为它似乎仅在高于体温的温度下才释放琥珀酸酯。

类似类型的固体组合物还可以用作在明胶胶囊中的填料。在这方面，优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于含水混悬剂和/或酏剂，本发明的化合物可以与各种甜味剂或增香剂、着色物质或染料组合，与乳化剂和/或悬浮剂组合以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油组合、以及它们的组合。

可以通过压制或模制、可选地连同一种或多种助剂来制作片剂。可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式如粉末或颗粒的活性组分，其可选地与以下各项混合来制备压制片剂：粘合剂(例如，聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉羟乙酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂。可以通过在合适的机器中模制湿润的粉状化合物和惰性液体稀释剂的混合物来制作模制片剂。片剂可以可选地进行包覆或刻上刻痕，并且可以配制片剂以提供其中的活性组分的缓慢或受控释放，其中利用，例如，不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所期望的释放曲线。

适用于口服给予的根据本发明的制剂可制成离散的单位如胶囊剂、扁囊剂或片剂，各自含有预定量的活性组分；制成粉末或颗粒；制成在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或制成水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。还可以将活性组分制成大丸剂、冲剂或糊剂。

适用于在口腔中局部给予的制剂包括锭剂，其包含在增香基质中的活性组分，上述基质通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶；软锭剂，其包含在惰性基质中的活性组分，上述基质是如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶；以及漱口剂，其包含在适宜的液体载体中的活性组分。

应当理解的是，除上述特别提到的组分之外，考虑到所考虑的制剂的类型，本发明的制剂还可以包括在本领域中的其他常规试剂，例如，那些适用于口服的制剂可以包括增香剂。

可以将适用于局部给予的药物组合物配制为软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、浸渍敷料、喷雾剂、气雾剂或油、透皮装置、扑粉等。可以通过常规方法来制备含有活性剂的这些组合物。因此，它们还可以包含相容的常规载体和添加剂，如防腐剂、用来帮助药物渗透的溶剂、在乳膏剂或软膏剂中的软化剂、以及用于洗剂的乙醇或油醇。这样的载体的存在量可以为组合物的约1％，高达约98％。更通常地，它们将形成组合物的高达约80％。仅作为说明，通过混合足量的亲水性材料和水来制备乳膏剂或软膏剂，按重量计，其含有约5-10％的化合物，以足量来产生具有所期望的稠度的乳膏剂或软膏剂。

适用于透皮给予的药物组合物可以呈现为离散贴剂，其旨在长时间保持与接受者的表皮紧密接触。例如，活性剂可以通过离子导入从贴剂递送。

为了应用于外部组织，例如口腔和皮肤，优选作为外用软膏剂或乳膏剂来施用组合物。当配制在软膏剂中时，可以借助于石蜡或水可混溶的软膏基质来使用活性剂。

可替换地，可以借助于水包油膏基或油包水基质，将活性剂配制在乳膏剂中。

对于胃肠道外给予，利用活性组分和无菌媒介物(vehicle)，例如但不限于水、醇、多元醇、甘油和植物油(其中水是优选的)，来制备流体单位剂型。取决于使使用的赋形剂和浓度，可以将活性组分悬浮或溶解在赋形剂中。在制备溶液剂时，可以将活性组分溶解于注射用水并在填入适宜的小瓶或安瓿并密封以前加以过滤灭菌。

上述组合物可以含有添加剂如粘度调节剂、pH调节剂、张力调节剂、稳定剂、防腐剂等。

有利地，可以将药剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶解于媒介物中。为了提高稳定性，可以在填入小瓶以后冷冻组合物，然后在真空下除去水。然后将干燥的冷冻干燥粉末密封在小瓶中并且可以提供注射用水的伴随小瓶以在使用前重构液体。

以和溶液剂基本上相同的方式来制备肠胃道外混悬剂，不同之处在于，将活性组分悬浮在媒介物中而不是加以溶解并且不可能通过过滤来完成灭菌。可以在悬浮在无菌媒介物中以前，通过暴露于环氧乙烷来灭菌活性组分。有利地，在组合物中包括表面活性剂或润湿剂以促进活性组分的均匀分布。

本领域的技术人员将认识到，将由待治疗的病症的性质和程度，给予的形式、途径和部位，以及待治疗的特定受试者的年龄和状况来确定本发明的化合物的单个剂量的最佳量和间隔，并且医师将最终确定待使用的适当剂量。可以酌情经常重复此剂量。如果副作用发展，则可以改变或降低剂量的量和/或频率(根据正常临床实践)。

试剂盒

本发明还提供了试剂盒，包括

i)第一容器，它包含药物，其具有潜在的药物诱导的副作用，其选自乳酸性酸中毒和与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，并且

ii)第二容器，它包含琥珀酸酯前药，其具有用于预防或减轻由药物诱导或可诱导的副作用的潜力，其中上述副作用选自乳酸性酸中毒和与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用。

用于治疗/预防的方法

本发明还涉及用于治疗遭受药物诱导的副作用的受试者的方法，其中上述副作用选自乳酸性酸中毒和与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，上述方法包括将有效量的琥珀酸酯前药给予受试者，并且涉及用于在受试者中预防或减轻药物诱导的副作用的方法，其中上述副作用选自乳酸性酸中毒和与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，其中上述受试者患有用药物加以治疗的疾病，其中上述药物潜在地诱导副作用，其选自乳酸性酸中毒和与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，上述方法包括在用所述药物加以治疗以前、期间或以后，将有效量的琥珀酸酯前药给予上述受试者。

针对本发明的一个方面所描述的细节及详情(已作必要的修正)适用于本发明的所有其他方面。

在下文中，通过使用药物二甲双胍和本文中的实施例来说明本发明。它并非意在以任何方式来限制本发明。

二甲双胍

二甲双胍是属于双胍类的抗糖尿病药物。它是用于2型糖尿病的一线治疗，在USA，其占约90％的糖尿病病例(Golan et al.,2012，Protti et al.,2012b)。抗糖尿病功效已被归因于：降低肝葡萄糖生产，通过在外周组织中增加的葡萄糖摄取来增加胰岛素的生物效应以及降低在肠中葡萄糖的摄取，但是尚未完全阐明作用的确切机制(Kirpichnikov etal.,2002，Golan et al.,2012)。尽管它的相对于其他抗糖尿病药物的优点，它已与乳酸性酸中毒(LA)作为副作用的罕见病例相关(Golan et al.,2012)。LA被定义为增加的阴离子间隙，高于5mM的动脉血乳酸水平以及pH≤7.35(Lalau,2010)。虽然仍然没有完全披露二甲双胍相关LA的确切的发病机制，但已提出糖原异生作用的抑制和导致的糖原异生作用的前体的累积，如丙氨酸、丙酮酸和乳酸(Salpeter et al.,2010)。然而，其他人提出药物干扰线粒体功能是关键因素：对于主要治疗性、葡萄糖降低效应(Owen et al.,2000，El-Mir,2000)以及对于二甲双胍相关LA的发展(Protti et al.,2012b，Dykens et al.,2008，Brunmair et al.,2004)。由于线粒体抑制，细胞将部分地从有氧代谢移动到无氧代谢，从而促进糖酵解并导致升高的乳酸水平(Owen et al.,2000)。在大多数国家中，由于LA的高发生率(4病例/10000治疗-年)，已经从市场上撤回苯乙双胍，另一种和二甲双胍相同药物类别的抗糖尿病药。相比之下，对于二甲双胍的LA的发生率是对于苯乙双胍的发生率的约十分之一，因此它被认为是比较安全的治疗剂(Sogame et al.,2009，Salpeter et al.,2010)。看到二甲双胍相关LA的大都是这样的患者，其具有影响心血管系统、肝或肾的另外的诱因性病况。在这些病况下，药物从身体内的清除率会受损，如果不及时发现，其会导致二甲双胍的不断上升的血液浓度(Lalau,2010，Kirpichnikov et al.,2002)。因为由于2型糖尿病的增加的患病率(Protti et al.,2012b)使得二甲双胍的使用预计会上升，所以对于二甲双胍诱导的线粒体毒性和LA的研究成为当前和紧迫的问题。对于二甲双胍的线粒体毒性的研究报告了不一致的结果。Kane et al.(2010)没有在来自大鼠的骨骼肌中检测由体内二甲双胍引起的基础呼吸和最大呼吸能力的抑制并且Larsen et al.(2012)也没有在经二甲双胍治疗的2型糖尿病患者的肌肉活检中检测由体内二甲双胍引起的基础呼吸和最大呼吸能力的抑制。相比之下，其他人已描述了在动物组织中二甲双胍和苯乙双胍对线粒体的毒性效应以及它与LA的关联(Owen et al.,2000，Brunmair et al.,2004，Carvalhoet al.,2008，El-Mir,2000,Dykens et al.，2008,Kane et al.,2010)。关于人类组织的数据是稀少的，特别是离体的或体内的。关于二甲双胍和LA的大多数人类数据是基于回顾性研究，这是由于难以获得人类组织样品。然而，Protti et al.(2010)报告了在患有双胍相关的LA的患者中降低的全身耗氧量以及Protti et al.(2012b)和Larsen et al.(2012)均描述了分别在人骨骼肌和血小板中，响应于≤10mM的二甲双胍暴露，体外线粒体功能障碍。Protti et al.(2012b)进一步报告了，在人类血小板中，响应于1mM的二甲双胍暴露，增加的乳酸释放Protti et al.(2012b)。虽然在治疗条件下并在此浓度下没有发现二甲双胍，但它已经表明，在中毒期间在血液中接近这些水平，并且已知的是，相比于血浆，在胃肠道、肾脏、肝脏、唾液腺、肺、脾、肌肉中累积7至10倍(Graham et al.,2011，Bailey,1992，Schulz and Schmoldt,2003，Al-Abri et al.,2013，Protti et al.,2012b，Scheen,1996)。

在本文报告的研究中，目的是利用高分辨率的呼吸计量法来评价在人血细胞中二甲双胍和苯乙双胍的线粒体毒性。包括苯乙双胍以比较两种类似结构的药物的活性以及研究在线粒体毒性和LA的发生率(在人患者中描述的)之间的关系。为了研究膜通透性和这些双胍类药物的毒性的具体目标，采用了用于测试药物毒性的模型，其中利用完整的和通透的血细胞，并顺序添加呼吸复合体特异性底物和抑制剂。

附图说明

图1在通透的人类外周血单核细胞(PBMC)和血小板中，二甲双胍对线粒体呼吸的影响。(a)通过顺序添加指定的呼吸复合体特异性底物和抑制剂所评价的经二甲双胍治疗的(1mM，黑色迹线)或经媒介物治疗的(H₂O，灰色迹线)通透的PBMC的同时测得的O₂消耗量的代表性迹线。迹线的稳定期、起因于腔的再氧合和复合体IV底物给予的干扰已被省略(虚线)。在迹线下方的框示出在给定底物、复合体I(CI)、复合体II(CII)或两者(CI+II)的氧化期间，用于呼吸的呼吸复合体，并且在方案的指示部分处的呼吸状态。示出在三种不同的呼吸状态和底物组合下对于PBMC(b)和血小板(c)的呼吸频率，其相对于对照(H₂O)和指示浓度的二甲双胍:氧化磷酸化能力，其得到复合体I底物(OXPHOS_CI)、在质子载体FCCP的滴定以后通过电子传递体系(ETS_CII)的复合体II依赖性最大流量、和复合体IV(CIV)能力的支持。数值被描述为平均值±SEM。*＝P<0.05，**＝P<0.01以及***＝P<0.001，其中利用单向ANOVA并借助于Holm Sidak的多重比较方法，n＝5。OXPHOS＝氧化磷酸化。ETS＝电子传递体系。ROX＝剩余氧浓度。

图2在通透的人类血小板中，在得到复合体I连接底物(OXPHOS_CI)的支持的氧化磷酸化期间，由二甲双胍和苯乙双胍对线粒体呼吸能力呈现的毒性的剂量反应比较。呼吸率表示为平均值±SEM以及应用标准非线性曲线拟合以获得对于二甲双胍和苯乙双胍的半最大抑制浓度(IC₅₀)值。*＝P<0.05。**＝P<0.01以及***＝P<0.001，与对照相比，其中利用单向ANOVA并借助于Holm Sidak的多重比较方法，n＝5。

图3在完整的人类血小板中，二甲双胍对线粒体呼吸的时间和剂量依赖性影响。(a)在指示浓度的二甲双胍或媒介物(H₂O)的60分钟孵育期间，监测血小板的常规呼吸，即，借助于它们的内源性底物供应和ATP需求的细胞的呼吸，其接着是(b)诱导的最大呼吸能力，其中通过质子载体FCCP的滴定以确定通过完整细胞的电子传递体系(ETS)的最大流量。数据表示为平均值±SEM，n＝5。*＝P<0.05，**＝P<0.01以及***＝P<0.001，其中利用单向ANOVA(b)和双向ANOVA(a)，并借助于Holm-Sidak的事后检验。

图4在完整的人类血小板的悬浮液中二甲双胍和苯乙双胍对乳酸生产和pH的影响。在含有葡萄糖(10mM)的磷酸盐缓冲盐水中，连同二甲双胍(10mM,1mM)、苯乙双胍(0.5mM)、复合体I抑制剂鱼藤酮(2μM)、或媒介物(DMSO，对照)一起，孵育血小板8小时。(a)每2小时确定乳酸水平(n＝5)，并且(b)每4小时测量pH(n＝4)。数据表示为平均值±SEM。*＝P<0.05，**＝P<0.01以及***＝P<0.001，其中利用双向ANOVA，并借助于Holm-Sidak的事后检验。

图5在含有10mM葡萄糖的PBS中孵育人完整凝血细胞(200·10⁶/ml)。(A)用琥珀酸酯或NV118(化合物3)，通过每30分钟连续添加250μM，来处理用10mM二甲双胍孵育的细胞。在时间0小时、在添加NV118之前，仅用二甲双胍或媒介物来孵育细胞1小时以建立相同的初始乳酸水平(数据未示出)。每30分钟，取样分析乳酸浓度。(B)借助于非线性拟合回归来计算乳酸生产并计算时间乳酸曲线的95％置信区间。用二甲双胍孵育的细胞具有比对照显著更高的乳酸生产，并且琥珀酸酯添加并不改变这种情况。当将NV118加入用二甲双胍孵育的细胞时，则显著降低乳酸生产。(C)通过重复添加NV118，可以类似地减弱由鱼藤酮诱导的乳酸生产。

图6在含有10mM葡萄糖的PBS中孵育人完整凝血细胞(200·10⁶/ml)。(A)在每30分钟连续添加250μM的情况下，用琥珀酸酯或NV189(化合物5)来处理用10mM二甲双胍孵育的细胞。在时间0小时、在添加NV189之前，仅用二甲双胍或媒介物来孵育细胞1小时以建立相同的初始乳酸水平(数据未示出)。每30分钟取样分析乳酸浓度。(B)借助于非线性拟合回归来计算乳酸生产并计算时间乳酸曲线的95％置信区间。用二甲双胍孵育的细胞具有比对照显著更高的乳酸生产，并且琥珀酸酯添加并不改变这种情况。当将NV189加入用二甲双胍孵育的细胞时，则显著降低乳酸生产。(C)通过重复添加NV189，可以类似地减弱由鱼藤酮诱导的乳酸生产。当还添加抗霉素时，通过抗霉素对复合体III的抑制效应，消除了NV189对复合体2的影响。

图7在含有10mM葡萄糖的PBS中孵育人完整凝血细胞(200·10⁶/ml)。(A)通过每30分钟连续添加250μM，用琥珀酸酯或NV241(化合物15)来处理用10mM二甲双胍孵育的细胞。在时间0小时、在添加NV241之前，仅用二甲双胍或媒介物来孵育细胞1小时以建立相同的初始乳酸水平(数据未示出)。每30分钟，取样并分析乳酸浓度。(B)借助于非线性拟合回归来计算乳酸生产并计算时间乳酸曲线的95％置信区间。用二甲双胍孵育的细胞具有比对照显著更高的乳酸生产，并且琥珀酸酯添加并不改变这种情况。当将NV241加入用二甲双胍孵育的细胞时，则显著降低乳酸生产。(C)通过重复添加NV241，可以类似地减弱由鱼藤酮诱导的乳酸生产。

图8在含有10mM葡萄糖的PBS中孵育凝血细胞(200·10⁶/ml)，并且每30分钟采样分析乳酸浓度。(A)在3小时孵育期间，监测用鱼藤酮(2μM)或它的媒介物加以处理的细胞：随着时间的推移，在介质中乳酸浓度的变化。此外，监测用鱼藤酮以及NV189孵育的细胞以及用鱼藤酮、NV189和复合体III抑制剂抗霉素(1μg/mL)孵育的细胞。在时间0小时、在添加NV189之前，仅用鱼藤酮或媒介物来孵育细胞1小时以建立相同的初始乳酸水平(数据未示出)。鱼藤酮增加细胞的乳酸生产，但通过用NV189的共孵育(通过每30分钟连续添加250μM)，这被带回正常(同样的曲线斜率)。当还存在抗霉素时，NV189不能对复合体II水平起作用，并且乳酸生产被再次增加到和仅存在鱼藤酮时的相同水平。(B)通过用10mM浓度的二甲双胍的孵育，可以诱导和鱼藤酮一样的乳酸生产的相似速率。

图9在猪急性代谢危机模型中的乳酸累积。在上述动物模型中，通过呼吸复合体I抑制剂鱼藤酮的输注来抑制线粒体功能。当细胞转移到糖酵解时，在体内累积乳酸。针对经鱼藤酮和媒介物处理的动物，在指定输注速率下，显示平均动脉乳酸浓度。在经鱼藤酮处理的动物中评价药物候选物以及乳酸累积的降低的速率表明线粒体ATP生产的恢复。

实验

材料和方法

除非另有说明，用于评价人PBMC和血小板的呼吸功能的方法是根据etal.(2013a，2013b)。

化学品和材料

Lymphoprep^TM购买自Axis-Shield PoC AS(Oslo,Norway)。所有其余化学品获自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。

样品获取和制备

经瑞典隆德大学区域伦理审查委员会的批准(伦理审查委员会许可证号2013/181)来进行上述研究。在获得书面知情同意书以后，根据临床标准程序，将来自18位健康成人(11位男性和7位女性)的静脉血抽取在K₂EDTA管(BDBrand Tube，具有EDTA二钾，BD,Plymouth,UK)中。对于血小板分离，在500g和室温(RT)下离心(Multifuge 1S-RHeraeus,Thermo Fisher Scientifics,Waltham,USA)全血10分钟。将富含血小板的血浆收集到15mL falcon管，然后在4600g和RT下离心8分钟。将得到的沉积物再悬浮在1-2mL的供者自身血浆中。利用Ficol梯度离心法(Boyum,1968)来分离PBMC。用等体积的生理盐水来洗涤在分离血小板以后剩下的血液并在3mL的Lymphoprep^TM上分层。在800g和RT(室温)下离心30分钟以后，收集PBMC层并用生理盐水加以洗涤。在250g和RT下离心10分钟以后，将PBMC的沉淀物再悬浮于两份的生理盐水和一份的供者自身血浆。利用自动血细胞计数器(SwelabAlfa,Boule Medical AB,Stockholm,Sweden)进行针对PBMC和血小板的细胞计数。

I.用于评价在完整细胞中的线粒体能量生产功能的增强和抑制的测定

高分辨率呼吸计量法–A–一般方法

在37℃的恒定温度下，用高分辨率测氧描记器(Oxygraph-2k,OroborosInstruments,Innsbruck,Austria)来进行线粒体呼吸的测量。在足以产生在介质中≥10pmol O₂s^-1mL^-1的氧耗量的浓度下，将分离的人类血小板、白细胞、成纤维细胞、人心脏肌肉纤维或含有活线粒体的其他细胞类型悬浮在2mL玻璃腔(容器，chamber)中。

高分辨率的呼吸计量法–B(用于乳酸研究)

利用高分辨率测氧描记器(Oxygraph-2k,Oroboros Instruments,Innsbruck,Austria)来进行实时呼吸测量。在测量过程中实验条件如下：37℃，2mL有效腔体积和750rpm搅拌速度。将O₂的腔浓度保持在200-50μM之间，并在实验中，视情况而定，对腔进行再氧合(et al.,2013a)。对于数据记录，使用DatLab软件版本4和5(OroborosInstruments,Innsbruck,Austria)。根据制造商的说明进行设置、日常校准和仪器背景校正。如在相应部分指出的，在含有0.5mM EGTA、3mM MgCl₂、60mM K-乳糖酸盐、20mM牛磺酸、10mM KH₂PO₄、20mM HEPES、110mM蔗糖和1g/L牛血清白蛋白(MiR05)的缓冲液或含有葡萄糖(5mM)和EGTA(5mM)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行呼吸测量。针对两种介质的氧溶解度系数(0.92)来校正呼吸值(Pesta and Gnaiger,2012)。在含有10mM葡萄糖的PBS中确定完整的人类血小板的乳酸生产。在200×10⁶个细胞/mL的血小板浓度下或在5×10⁶个细胞/mL的PBMC浓度下进行所有测量。

化合物的生物学评价(不用于乳酸研究)

采用了在完整细胞中的四种典型的评价方案。

(1)在具有抑制的呼吸复合体I的细胞中测定线粒体能量产生功能的增强

将细胞放入含有110mM蔗糖、20mM HEPES、20mM牛磺酸、60mM K-乳糖酸盐、3mMMgCl₂、10mM KH₂PO₄、0.5mM EGTA、1g/l BSA的缓冲液(pH 7.1)中。在建立具有内源性底物的基线呼吸以后，用2μM鱼藤酮来抑制复合体I。在10μM至10mM最终浓度的范围内，滴定溶解在DMSO中的化合物。随后，用毛地黄皂苷(1mg/1*10⁶plt)来通透细胞膜以允许细胞外释放的能量底物或细胞不可渗透的能量底物的进入。在稳定呼吸以后，添加10mM琥珀酸酯作为参比物以使复合体I的下游能够呼吸。在呼吸被稳定以后，通过添加最终浓度为1μg/mL的抗霉素来终止实验并测量任何剩余的非线粒体氧耗量。在描述的方案中呼吸率的增加紧密耦合于通过氧化磷酸化的ATP合成，除非细胞被解偶联(即，质子泄漏而没有ATP的产生)。在方案3中通过添加ATP合成酶抑制剂寡霉素(1-2μg mL^-1)来测试解偶联，其中解偶联的程度对应于在寡霉素添加以后的呼吸频率。

(2)在完整细胞中测定线粒体能量产生功能的增强和抑制

在第二方案中，使用如上所述的相同缓冲液。在建立基础呼吸以后，以2nM的浓度，添加线粒体解偶联剂FCCP以增加代谢需求。在几个步骤中，从10μM至10mM最终浓度，滴定溶解在DMSO中的化合物以评价呼吸的增强和/或抑制的浓度范围。通过添加2μM鱼藤酮来终止实验以抑制复合体I，从而揭示在上述呼吸复合体和1μg/mL的复合体III抑制剂抗霉素的下游的剩余的底物利用，进而测量非线粒体氧耗量。

(3)测定以评价在完整细胞中的解偶联

在第三方案中，使用如上所述的相同缓冲液。在建立基础呼吸以后，添加1mM的溶解在DMSO中的化合物。随后，添加ATP合成酶抑制剂寡霉素。呼吸的减少是耦合到ATP合成的氧耗量的多少的度量。没有减少或仅轻微的减少表明，上述化合物正诱导在线粒体内膜上的质子泄漏。然后滴定解偶联剂FCCP以诱导最大解偶联呼吸。然后添加鱼藤酮(2μM)以抑制复合体I，从而揭示上述呼吸复合体的下游的剩余的底物利用。通过添加1μg/mL的复合体III抑制剂抗霉素来终止实验以测量非线粒体氧耗量。

(4)在人血浆中在具有抑制的呼吸复合体I的细胞中测定线粒体能量产生功能的增强

在来自相同供体的血浆中孵育完整人血细胞。在建立具有内源性底物的基线呼吸以后，用2μM鱼藤酮来抑制复合体I。在10μM至10mM最终浓度的范围内，滴定溶解在DMSO中的化合物。通过添加最终浓度为1μg/mL的抗霉素来终止实验并测量任何剩余的非线粒体氧耗量。

在呼吸测定中所期望的化合物的性能

在描述的方案中在完整细胞中，理想的化合物在低浓度下刺激呼吸而没有对在方案1中在通透以后琥珀酸酯刺激的呼吸或在方案2中的内源性呼吸具有抑制效应。在最大刺激效应和抑制之间的浓度范围应应当尽可能宽。在用在复合体III处或在复合体III的下游处的线粒体毒素抑制呼吸以后，呼吸应当被终止。请参照图1和下面的清单。

化合物的所期望的性能；

·在低药物浓度下达到的最大值。

·a大幅度(substantially)大于a′

·a接近b′

·c接近c′

·d接近d′

在测定中，不可透过细胞膜的化合物被确定为：

·a接近a′

当如下条件时，确定由药物候选物诱导的非线粒体氧耗量

·d大于d′时。

II.在暴露于线粒体复合体I抑制剂的细胞中测定乳酸累积的预防

在含有10mM葡萄糖并含有复合体I抑制药物二甲双胍(10mM)、苯乙双胍(0.5mM)或鱼藤酮(2μM)的磷酸盐缓冲盐水中孵育完整的人类血小板、白细胞、成纤维细胞、或含有活线粒体的其他细胞类型8小时。通过这些化合物的氧化磷酸化所引起的线粒体ATP生产的抑制会增加通过糖酵解的乳酸累积。利用乳酸Pro^TM 2血液乳酸测试仪(Arkray,Alere AB,Sweden)或类似类型的测量，每30分钟确定乳酸水平。在37℃下进行孵育。在开始时，在孵育的4和8小时以后(或更频繁地)，利用标准pH计例如PHM210(Radiometer,Copenhagen,Denmark)来测量pH。从开始或在30-60分钟以后，在10μM–5mM的浓度下，将药物候选物加入测定。相对于仅使用化合物媒介物，通常为DMSO，的平行实验，来比较乳酸累积的预防。为了评价药物候选物的特异性，还连同呼吸的下游抑制剂如复合体III抑制剂抗霉素(1μg/mL)一起进行测试，其应摧毁药物候选物的效应并恢复乳酸的生产。因此，抗霉素的使用还控制药物候选物对在测定中使用的细胞的乳酸生产能力的不适当的影响(图5、6和7)。

在细胞乳酸累积测定中所期望的化合物的性能

(1)理想的化合物防止由复合体I抑制所诱导的乳酸累积，即，乳酸累积接近和在非复合体I抑制的细胞中的乳酸累积相似的速率。(2)下游呼吸抑制剂如抗霉素摧毁对乳酸累积的预防。

III.在猪的急性代谢危机模型中测定乳酸累积和能量抑制的预防

将以起因于在复合体I处的线粒体功能障碍的代谢危机的概念体内模型的证据来测试先导药物候选物。上述模型模拟在具有线粒体复合体I中的基因突变的孩子或用临床上使用的药物如二甲双胍(当累积在细胞和组织中时，其抑制复合体I)加以治疗和用药过量的患者中出现的严重病症。

雌性当地品种猪用于上述研究。它们被麻醉，采取手术治疗，其中放置导管用于输注和监视活性。通过在3小时期间以0.25mg/kg/小时、接着在1小时期间以0.5mg/kg/小时的速率输注线粒体复合体I抑制剂鱼藤酮来诱导代谢危机(媒介物，由25％NMP/4％聚山梨酯80/71％水组成)。通过放置在股动脉中的导管来连续测量心血管参数如动脉血压。通过热稀释法，每15分钟测量和记录心输出量(CO)，并且每15分钟记录肺动脉压(PA，收缩压和舒张压)、中心静脉压(CVP)、和SvO₂，以及每30分钟，记录来自Swan-Ganz导管的肺动脉楔压(PCWP)。例如借助于Quark RMR ICU option(Cosmed,Rome,Italy)设备来进行间接量热法。在收集自股动脉和Swan-Ganz导管的动脉和静脉血中确定血气和电解质并借助于ABL725血气分析仪(Radiometer Medical Aps,Denmark)加以分析。分析包括pH、BE、血红蛋白、HCO₃、pO₂、pCO₂、K⁺、Na⁺、葡萄糖和乳酸(图9)。

数据分析

利用Graph Pad PRISM软件(GraphPad软件版本6.03,La Jolla,California,USA)来进行统计分析。所有呼吸、乳酸和pH数据表示为平均值±SEM。比率被绘制为单个值和平均值。单向ANOVA用于三个或更多组(药物的浓度)的单因素比较以及双向混合模型ANOVA用于三个或更多组的两因素比较(时间和药物的浓度/治疗)。根据Holm-Sidak来进行用来补偿多重比较的事后检验。相关性表示为r²和P值。应用标准非线性曲线拟合来计算半最大抑制浓度(IC₅₀)值。对于P<0.05，结果被认为是统计上显著的。

在代谢危机的概念体内模型的证据中，所期望的化合物的性能

在患有由复合体I抑制诱导的代谢危机的猪中，理想的化合物应减少乳酸累积和pH值降低。在复合体I抑制以后的能量消耗减少应减弱。如通过血液和血流动力学分析所测量的，上述化合物不应诱导任何明显的负面影响。

代谢组学方法

通过标准方法来收集白细胞或血小板并悬浮于MiR05，一种缓冲液，其含有110mM蔗糖、20mM HEPES、20mM牛磺酸、60mM K-乳糖酸盐、3mM MgCl₂、10mM KH₂PO₄、0.5mM EGTA、1g/l BSA，并且有或没有5mM葡萄糖(pH 7.1)。在37℃的恒定温度下，借助于在高分辨率测氧描记器(Oxygraph-2k,Oroboros Instruments,Innsbruck,Austria)中的搅拌来孵育样品。

在10分钟以后，添加在DMSO中的鱼藤酮(2μM)并持续孵育。在另外5分钟以后，添加在DMSO中的测试化合物，可选地以后具有另外的测试化合物和另一时期的孵育。在孵育期间，实时测量O₂消耗量。

在孵育的最后，通过离心来收集细胞并在5％甘露醇溶液中洗涤，然后提取到甲醇中。添加含有内部标准物的水溶液，然后通过在具有过滤器的适宜的离心管中的离心来处理得到的溶液。

在CE-MS分析以前，在真空下干燥得到的滤液以通过Ooga等(2011)和Ohashi等(2008)的方法来量化各种初级代谢产物。

特别是，针对本发明的化合物的影响，评价在TCA循环和糖酵解中的代谢产物水平。

Ooga et al,Metabolomic anatomy of an animal model revealinghomeostatic imbalances in dyslipidaemia,Molecular Biosystems,2011,7,1217-1223

Ohashi et al,Molecular Biosystems,2008,4,135-147

实施例

二甲双胍研究

在二甲双胍研究中，使用以下化合物(以及在图中其被称为)

如在WO 2014/053857中所描述的来制备化合物。

在实施例1-2中报告的研究的目的

在外周血单核细胞和血小板中，通过特异性线粒体复合体I抑制，二甲双胍诱导乳酸生产

二甲双胍是广泛使用的与乳酸性酸中毒的罕见副作用关联的抗糖尿病药物，已提出其与药物诱导的线粒体功能障碍关联。利用呼吸计法，在实施例1-2中报告的研究的目的是，相对于苯乙双胍的线粒体毒性，评价二甲双胍对人血细胞的线粒体毒性，其中上述苯乙双胍是由于乳酸性酸中毒的高发生率在大多数国家中撤消的双胍类似物。

在实施例3中报告的研究的目的

上述目的是研究琥珀酸酯前药减轻或规避二甲双胍和苯乙双胍的不希望的作用的能力。

实施例1A

在通透的人类血小板中二甲双胍和苯乙双胍对线粒体呼吸的影响

为了研究双胍毒性的具体目标，利用血细胞的毛地黄皂苷通透并在MiR05介质中顺序添加呼吸复合体特异性底物和抑制剂来实施方案。在稳定常规呼吸，即借助于它们的内源性底物供应和ATP需求的细胞的呼吸以后，添加二甲双胍、苯乙双胍或其他媒介物(双去离子水)。施用广泛的浓度范围的药物：0.1、0.5、1、和10mM的二甲双胍以及25、100和500μM的苯乙双胍。在37℃下在用药物孵育10分钟以后，在先前确定的最优毛地黄皂苷浓度(1μg10^-6血小板)下，用毛地黄皂苷来通透血小板以诱导最大细胞膜通透而没有破坏线粒体功能并允许测量最大呼吸能力(et al.(2013a)。为了评价复合体I依赖性氧化磷酸化能力(OXPHOS_CI)，首先，顺序添加NADH连接底物丙酮酸盐和苹果酸盐(5mM)，然后是ADP(1mM)以及最后是另外的复合体I底物谷氨酸盐(5mM)。随后，给予FADH₂连接的底物琥珀酸酯(10mM)以确定趋同的复合体I和II依赖性OXPHOS能力(OXPHOS_CI+II)。通过添加ATP合成酶抑制剂寡霉素(1μg mL^-1)来评价LEAK_I+II状态，这是一种呼吸状态，其中氧耗量补偿质子穿过线粒体膜的回流(Gnaiger,2008)。通过用质子载体羰基-氰化物对(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)的随后滴定来评价由通过复合体I和II(ETS_CI+II)的趋同输入所支持的最大解偶联呼吸电子传递体系能力。复合体I抑制剂鱼藤酮(2μM)的加入揭示了复合体II依赖的最大解偶联呼吸(ETS_CII)。然后给予复合体III抑制剂抗霉素(1μg mL^-1)以揭示残余氧耗量(ROX)。最后，添加人工复合体IV底物N,N,N’,N’-四甲基-对苯二胺二盐酸盐(TMPD,0.5mM)并给予复合体IV抑制剂叠氮化钠(10mM)以分别测量复合体Ⅳ活性和化学背景。通过从TMPD值减去叠氮化钠值来计算复合体IV活性。除复合体IV活性之外，在稳态下测量所有呼吸状态并校正ROX。在ROX确定以后并且不在稳态下来测量复合体IV活性。在OXPHOS_CI+II期间，在媒介物、100mM二甲双胍或500μM苯乙双胍的存在下，通过添加细胞色素c(8μM)来检查线粒体外膜的完整性。

实施例1B

结果

在通透的人PBMC和血小板中，利用复合体I底物的呼吸被二甲双胍剂量依赖性地抑制(图1)。与在10mM下具有几乎完全抑制的对照相比，OXPHOS_CI能力随着二甲双胍的增加浓度而降低(-81.47％，P<0.001，在PBMC中，并且-92.04％，P<0.001，在血小板中)，从而导致对于PBMC的0.45mM的IC₅₀以及对于血小板的1.2mM的IC₅₀。类似于OXPHOS_CI，二甲双胍降低了利用复合体I和复合体II连接的底物，OXPHOS_CI+II和ETS_CI+II，的呼吸能力，如由经媒介物处理的和经1mM二甲双胍处理的通透的PBMC的同时测得的氧气消耗量的代表性迹线所说明的(图1a)。相比之下，与对照相比，在任一细胞类型中，在二甲双胍的存在下，ETS_CII能力和复合体IV活性没有显著改变(图1b、图1c)以及LEAK_I+II呼吸(其中氧耗量补偿质子穿过线粒体膜的回流量的呼吸状态，传统上表示在分离的线粒体中的状态4，数据未示出)也没有显著改变。在分别通过洗涤和通透细胞来细胞外和细胞内去除药物以后，由二甲双胍诱导的复合体I的线粒体抑制似乎不是可逆的。虽然通过除去会减弱复合体I抑制的损伤的严重性(可能归因于药物较短的暴露时间)，但血小板没有恢复与对照可比的常规和最大线粒体功能(数据未示出)。苯乙双胍同样抑制OXPHOS_CI(图2)、OXPHOS_CI+II和ETS_CI+II，但不抑制ETS_CII或对复合体IV特异性的呼吸(数据未示出)。与二甲双胍相比，在通透血小板中，苯乙双胍显示OXPHOS_CI的20倍更有效的抑制(IC₅₀分别为0.058mM和1.2mM)(图2)。在给予细胞色素c以后，二甲双胍和苯乙双胍并不诱导增加的呼吸，因此没有破坏线粒体外膜的完整性。

在MiR05介质中常规呼吸的稳定以后，添加媒介物(双去离子水)或1、10和100mM二甲双胍。在添加ATP合成酶抑制剂寡霉素(1μg mL^-1)以前，在37℃下，进行常规呼吸60分钟以评价LEAK呼吸。通过FCCP的滴定来达到由内源性底物(ETS)支持的最大解偶联呼吸电子传递体系能力。通过复合体I抑制剂鱼藤酮(2μM)、复合体III抑制剂抗霉素(1μg mL^-1)和复合体IV抑制剂叠氮化钠(10mM)来顺序阻断呼吸以评价ROX，其用来校正所有呼吸值。在另外的实验中，在分离血小板和分析呼吸之前，在K₂EDTA管中用不同的二甲双胍浓度(0.1、0.5和1mM)来孵育全血18小时。

结果

在完整的人类血小板中，二甲双胍以剂量和时间依赖性方式降低常规呼吸(图3a)。当暴露于二甲双胍或媒介物时，血小板呈现常规呼吸随着时间的推移的连续下降。在60分钟以后，与在添加以后的第一次测量相比，在对照中常规呼吸减少–14.1％(P<0.05)，在1mM二甲双胍下减少-17.27％(P<0.01)，在10mM二甲双胍下减少-28.61％(P<0.001)，并且在100mM二甲双胍下减少-81.78％(P<0.001)。与已暴露15分钟以后的对照相比，在100mM下的二甲双胍显著降低常规呼吸(-39.77％，P<0.01)。在60分钟孵育以后，10mM(-23.86％，P<0.05)和100mM(-56.86％，P<0.001)二甲双胍显著抑制血小板的最大解偶联呼吸(质子载体滴定的ETS能力)(图3b)。二甲双胍孵育没有显著改变在完整细胞中的LEAK呼吸(数据未示出)。当在1mM的二甲双胍浓度下孵育全血18小时时，完整的人类血小板的常规呼吸减少30.49％(P<0.05)。

实施例2

二甲双胍和苯乙双胍对完整的人类血小板的乳酸生产和pH的影响

用二甲双胍(1mM,10mM)、苯乙双胍(0.5mM)、鱼藤酮(2μM)、或用于鱼藤酮的媒介物(DMSO)孵育血小板8小时。利用Lactate Pro^TM 2血液乳酸测试仪(Arkray,Alere AB,Sweden)(Tanner et al.,2010)每2小时(n＝5)确定乳酸水平。在37℃下并在750rpm的搅拌速度下进行孵育，并利用PHM210标准pH计(Radiometer,Copenhagen,Denmark)在开始时、在孵育的4小时以后和8小时以后(n＝4)测量pH。

结果

响应于在人类血小板中用二甲双胍和苯乙双胍进行的孵育，乳酸生产以时间和剂量依赖性方式增加(图4a)。与对照相比，经8小时的处理，经二甲双胍(1和10mM)、苯乙双胍(0.5mM)、和鱼藤酮(2μM)处理的血小板均产生显著更多的乳酸。在1mM二甲双胍下，经8小时，乳酸从0.30±0.1增加至3.34±0.2以及在10mM二甲双胍下，乳酸从0.22±0.1增加至5.76±0.7mM。在两组中，对于1mM和10mM二甲双胍，相应的pH值从7.4±0.01分别下降至7.16±0.03和7.00±0.04。经苯乙双胍处理的血小板(0.5mM)产生和经10mM二甲双胍处理的样品类似水平的乳酸。对于所有治疗组，乳酸增加的水平与pH的降低相关。在经二甲双胍处理的完整血小板中增加的乳酸水平还与在经二甲双胍处理的通透血小板中看到的降低的绝对OXPHOS_CI呼吸值相关(r²＝0.60，P<0.001)。有限的一组实验进一步证明，在暴露于10mM二甲双胍以后，完整PBMC还显示增加的乳酸释放(数据未示出)。

来自实施例1-2的结果的讨论

这项研究表明，在人类血小板和PBMC中，在有关二甲双胍中毒的临床条件的浓度下，二甲双胍对对于复合体I具有特异性的线粒体的不可逆毒性效应。在血小板中，我们进一步表明在降低的复合体I呼吸和增加的乳酸生产之间的相关性。在完整细胞中，我们针对二甲双胍所观测到的线粒体毒性随着时间的推移而发展。苯乙双胍，一种在大多数国家中由于LA的高发生率现已撤消的结构相关化合物，在低得多的浓度下，通过复合体I特异性作用，在血小板中诱导乳酸释放和pH下降。

在本研究中，利用采用高分辨率的呼吸计量法的模型来评价人类血小板的整合线粒体功能，我们已经证明，二甲双胍和苯乙双胍的线粒体毒性均是专门针对呼吸复合体I以及在PBMC中也存在类似的特异性抑制。对于二甲双胍，与通透血小板相比，通透的PBMC的复合体I呼吸是2.6倍更加敏感的。然而，由于二甲双胍的时间依赖性毒性(见下文)，IC₅₀可能是低估的并且如果在较长暴露时间以后确定则可能更低。这些发现进一步强调了二甲双胍的线粒体毒性并不限于特定组织(如先前由其他人所说明的)，而是在亚细胞水平上的一般化的效应(Kane et al.,2010，Larsen et al.,2012，Owen et al.,2000，Dykens et al.,2008，Brunmair et al.,2004，Protti et al.,2012a)。在本研究中或在利用分离的牛线粒体的Dykens et al.(2008)的较早的研究中并没有证实由(Protti et al.,2012a，Prottiet al.,2012b)报告的在血小板中二甲双胍诱导的复合体IV抑制。而且，二甲双胍和苯乙双胍并不通过线粒体内或外膜的任何非特异性通透性改变来诱导呼吸抑制，因为没有证据表明在药物的存在下在细胞色素c添加以后解偶联或刺激反应的。高分辨率的呼吸计量法是高灵敏度的方法并且允许在皮摩尔范围内的O₂测量。当应用于离体人血细胞时，它允许评价在完整细胞中在完全整合状态下的呼吸，并允许在通透细胞中外源性供应和控制底物到完整线粒体。这是与酶促光度法测定相反，其主要是用于例如由Dykens et al.(2008)和Owen et al.(2000)进行的对二甲双胍的线粒体毒性的研究。这些测定测量单一复合体的独立的、非整合功能，因而，是较少生理性的，其可能有助于在我们的研究之间的结果的差异。

本研究的结果表明了在8-18小时以后在中毒相关的浓度下已经出现由二甲双胍引起的在完整血小板悬浮液中的显著的呼吸抑制、乳酸增加和pH值降低。线粒体呼吸的时间依赖性抑制连同在胞外缓冲液的交换和通过细胞的通透稀释可溶性二甲双胍的细胞内含量指向逆转的缺乏指向线粒体内累积，在药物诱导的线粒体功能障碍相关LA的发展中，线粒体内累积是关键因素，如已由其他人(Chan et al.,2005,Lalau,2010)提出的。

先前已显示苯乙双胍的线粒体毒性，例如对HepG2细胞、肝癌细胞系、以及大鼠和奶牛的分离的线粒体(Dykens et al.,2008)。在这里，还利用人血细胞，我们已经证明了特异性线粒体毒性。与二甲双胍相比，苯乙双胍具有对人类血小板的更强的线粒体毒性效力(IC₅₀分别为1.2mM和0.058mM)。苯乙双胍和二甲双胍显示在临床剂量方面10至15倍差异(Scheen,1996,Davidson and Peters,1997,Kwong and Brubacher,1998,Sogame et al.,2009)以及在治疗性血浆浓度方面显示3至10倍差异(Regenthal et al.,1999,Schulz andSchmoldt,2003)。在本研究中，我们观测到在苯乙双胍和二甲双胍之间在抑制复合体I的潜力方面的20倍差异。如果转换到患者，相对于临床剂量，在线粒体毒性方面的这种差异可能潜在地解释苯乙双胍的文件证明的苯乙双胍相关LA的更高发生率。

二甲双胍的标准治疗性血浆浓度是在0.6至6.0μM的范围内而毒性浓度是在60μM和1mM之间(Schulz and Schmoldt,2003,Protti et al.,2012b)。在非自愿二甲双胍中毒的病例报告中，报告了在血液透析之前，超过2mM的二甲双胍的血清水平(Al-Abri et al.,2013)。组织分布研究已经进一步证明，在稳态下，二甲双胍浓度在血浆/血清中比在其他器官中更低。已经表明，相比于血浆水平，它以7至10倍更高浓度累积在胃肠道中，并在肾、肝、唾液腺、肺、脾和肌肉中具有较少但仍然显著较高的量(Graham et al.,2011,Bailey,1992,Scheen,1996)。在其中二甲双胍的清除率受损如影响心血管系统、肝或肾的诱因性病况的情况下，最终可以达到毒性水平。因此，在本研究中看到的二甲双胍的毒性浓度(1mM)与在二甲双胍中毒患者的血液中发现的浓度可比。虽然二甲双胍对是血细胞有毒的，如在本研究中所显示的，但不可能的是，血小板和PBMC是对LA的发展的主要贡献者。因为二甲双胍累积在其他器官中并且另外地这些器官是代谢上更为活性的，所以增加的乳酸生产可能首先在其他组织中被看到。因此，我们的结果加强了其他人已提出的设想(Brunmair etal.,2004,Protti et al.,2012b,Dykens et al.,2008)，全身性线粒体抑制是二甲双胍诱导的LA的原因。

基于先前的研究和本发现，有趣的是猜测以下可能性：二甲双胍的抗糖尿病功效可能与有氧呼吸的抑制相关。在经二甲双胍治疗的糖尿病患者中，在肝脏中降低的葡萄糖水平以及在小肠中降低的葡萄糖到血液的摄取(Kirpichnikov et al.,2002)可能是由于部分复合体I抑制。复合体I抑制引起ATP的降低的生产、增加的AMP量、酶AMP活化蛋白激酶(AMPK)的激活、和通过增加的糖酵解的加速的葡萄糖周转，从而试图补偿减少的ATP产生(Brunmair et al.,2004,Owen et al.,2000)。

到目前为止，用于二甲双胍相关LA的治疗措施包括血液透析和血液过滤以除去毒素，校正酸中毒以及增加肾血流量(Lalau,2010)。

实施例3

用细胞可渗透的琥珀酸酯前药来干扰二甲双胍诱导的乳酸生产的增加

在含有10mM葡萄糖的PBS中，在完整的人类血小板中，用新开发和合成的细胞可渗透的琥珀酸酯前药来干涉二甲双胍诱导的乳酸生产的增加。将血小板暴露于单独的鱼藤酮(2μM)、鱼藤酮(2μM)和抗霉素(1μg/mL，仅对于用NV 189处理的细胞)、或10mM二甲双胍，然后在60分钟以后，每30分钟，以250μM的浓度，添加媒介物(dmso，对照)、细胞可渗透的琥珀酸酯前药(NV118、NV189和NV241)、或琥珀酸酯。自实验的开始，以30分钟的间隔，测量乳酸水平。另外，在首次添加媒介物(dmso，对照)、不同的细胞可渗透的琥珀酸酯前药(NV 118、NV 189、NV241)或琥珀酸酯之前以及在实验的最后，测量pH。借助于具有乳酸-时间曲线斜率的95％置信区间(CI)的非线性拟合来计算乳酸生产的速率(图5、6、7和8)。

与实施例3相关的结果是基于本文描述的测定

通过添加细胞可渗透的琥珀酸酯前药减弱在凝血细胞中起因于鱼藤酮和二甲双胍孵育的乳酸生产

在用2μM鱼藤酮孵育的凝血细胞中乳酸生产的速率是0.86mmol乳酸(200·10⁶trc·h)^-1(95％置信区间[CI]0.76-0,96)，其被以下各项减弱：NV118(0.25mmol[95％CI0.18-0.33])、NV189(0.42mmol[95％CI 0.34-0.51])和NV241(0.34mmol[95％CI 0.17-0.52])，其并不显著不同于不接受鱼藤酮的细胞(0.35[95％CI 0.14-0.55])(图5、6和7)。用除鱼藤酮和NV189之外的抗霉素加以孵育的细胞具有与经鱼藤酮处理的细胞可比的乳酸生产(0.89mmol[0.81-0.97])，表明细胞可渗透的琥珀酸酯前药的特异性线粒体效应(图6)。

相比于在经媒介物(水)处理的细胞中的0.22mmol(95％CI 0.14-0.30)，用10mM二甲双胍孵育的细胞以0.86mmol乳酸(200·10⁹trc·h)^-1(95％CI0.69-1.04)的速率产生乳酸(图8)。用三种琥珀酸酯前药的任何一种进行的共孵育会减弱二甲双胍效应，从而导致对于NV118为0.43mmol生产(95％CI 0.33-0.54)(图5)、对于NV189为0.55mmol(95％CI 0.44-0.65)(图6)、以及对于NV241为0.43mmol(95％CI 0.31-0-54)(图7)。

实施例4

生物实验的结果

对在下表中给出的化合物进行在标题I下提及的测定(1)-(4)。进行测定以评价在完整细胞中线粒体能量产生功能的增强和抑制。在以下表中示出结果，其表明所有测试的化合物具有适宜的性能。重要的是，所有化合物显示如从筛选方案1和4所看到的对CII相关的呼吸的特异性作用，以及如在测定2中看到的收敛效应，其中CI底物是可用的。

来自筛选方案1-4的结果

化合物NV

收敛的(常规)

收敛的(FCCP)

CII(血浆)

CII

解偶联

毒性

01-193

(++)

+

(+)

+

+

5mM

01-188

+++

+++

+

+

(+)

5mM

01-185

(+)

+

+

+

(+)

2mM

01-205

+++

++

+

+

(+)

5mM

01-114

+++

++

+

++

(+)

10mM

01-041

+

+++

+

++

(+)

5mM

01-108

++

++

(+)

(++)

+

10mM

01-150

+++

+

(+)

++

(+)

2mM

01-134

++

(+)

(+)

(+)

(+)

10mM

图例：收敛的(常规)–在筛选测定3中描述的条件下，由化合物诱导的线粒体氧耗量的增加；收敛的(FCCP)–在筛选测定2中描述的条件(解偶联条件)下，由化合物诱导的线粒体氧耗量的增加；收敛的(血浆)–在含有在人血浆中孵育的抑制的复合体I的细胞中由化合物诱导的线粒体氧耗量的增加，如在筛选测定4中描述的；CII–在含有抑制的复合体I的细胞中，由化合物诱导的线粒体氧耗量的增加，如在筛选测定1中描述的；解偶联–在添加寡霉素以后的氧耗量水平，如在筛选测定3中描述的。在每个参数中的响应被分级为+、++或+++(以效力的增加的顺序)。括号[()]表明中间效果，即(+++)是在++和+++之间。毒性–在化合物滴定期间的最低浓度，在其下看到氧耗量的降低，如在筛选测定2中描述的。

琥珀酸酯前药/受保护的琥珀酸酯的制备

本领域技术人员将认识到，可以以已知的方式、以各种方式来制备本发明的受保护的琥珀酸酯。以下路线仅用来说明一些方法，其可以用于式(I)的化合物的合成。

本发明进一步提供了用于制备式(I)的化合物的方法，该方法包括使琥珀酸和式(VI)的化合物反应

其中Hal表示卤素(例如F、Cl、Br或I)并且R₃、R₄和R₅是如在式(I)中所定义的。

可以在溶剂如二氯甲烷、丙酮、乙腈或N,N-二甲基甲酰胺中并借助于适宜的碱如三乙胺、二异丙基乙胺或碳酸铯，在例如-10℃至80℃的温度下，特别是在室温下，方便地进行琥珀酸和式(VI)的化合物的反应。可以借助于可选的添加剂如碘化钠或四烷基卤化铵(例如四丁基碘化铵)来进行上述反应。

对于其中R₁和R₂是式(II)的不同基团的式(I)的化合物，可以通过在上文概述的条件下使式(VII)的基团

其中PG₁是保护基如叔丁基、苄基或4-甲氧基苄基，与式(VI)的基团在如上所列出的条件下反应，接着是在适当的条件下(如在溶剂如二氯甲烷中的三氟乙酸或盐酸)或通过氢化(芳基)的保护基团的脱保护，接着是在上文概述的条件下将获得的具有式(VI)的不同基团的化合物与脱保护的羧酸酯反应，来制备式(I)的化合物。

对于其中R₁是可选取代的烷基并且R₂是式(II)的基团的式(I)的化合物，可以通过在上文概述的条件下使式(VIII)的基团

与式(VI)的基团反应来制备式(I)的化合物。

可以在上文概述的条件下，通过式(IX)的基团

与式(VI)的基团的反应来方便地制备受保护的二琥珀酸酯化合物。可以通过式(VII)的化合物与二氯甲烷在适宜的溶剂如二氯甲烷中并借助于适宜的添加剂如四丁基硫酸氢的反应来方便地制备式(IX)的化合物。可以通过在溶剂如二氯甲烷中用酸如三氟乙酸或盐酸的处理来随后水解得到的双酯以提供式(IX)的化合物。

式(VII)和(VIII)的化合物是市售的或可以通过文献方法如那些在Journal ofOrganic Chemistry,72(19),7253-7259；2007中概述的方法加以方便地制备。

以下式(VI)的化合物

是市售的或可以通过文献方法如那些在Journal of the American ChemicalSociety,43,660-7；1921或Journal of medicinal chemistry(1992),35(4),687-94中概述的方法加以方便地制备。

制备实施例

为了说明用于制备受保护的琥珀酸酯的方法，给出以下制备实施例，其中，除非另有说明：

(i)当给出时，用Bruker Avance 300(300MHz)或Bruker Avance400(400MHz)来记录¹H NMR谱。氯仿-d(CDCl₃；δ_H 7.27ppm)、二甲亚砜-d₆(d₆-DMSO；δ_H 2.50ppm)或甲醇-d₄(CD₃OD；δ_H 3.31ppm)，或四甲基硅烷的内部标准物(TMS；δ_H 0.00ppm)的中央峰用作参考。

(ii)根据分析性HPLC，用Agilent MSD(+ve和–ve电雾化)或Fisons InstrumentVG Platform来记录质谱。在给定m/z值的情况下，通常仅报告指示母体质量的离子，并且引述的质量离子是正和负质量离子：[M+H]⁺或[M-H]^-；

(iii)实施例的标题和副标题化合物以及制备物是用AutoNom命名的。

(iv)除非另有说明，起始材料是市售的。所有溶剂和商业试剂具有实验室等级并按来样使用。在环境温度下，即在16至28℃的范围内，并且，在适当情况下，在惰性气体如氮气的气氛下进行所有操作。

(v)使用以下缩略语：

实施例1：琥珀酸二(2,2-二甲基-丙酰氧基甲基)酯

将琥珀酸(1.2g，10mmol)和新戊酸氯甲酯(5.8mL，40mmol)加入丙酮(4mL)，然后在冰中冷却混合物。分批添加三乙胺(3.3mL，24mmol)并在室温下搅拌溶液过夜。

浓缩混合物，然后在水和乙酸乙酯之间加以分配。用水然后用碳酸氢钠溶液来洗涤乙酸乙酯溶液。用脱色炭来处理它，经碳酸钾干燥，然后浓缩至油。

通过MPLC色谱(碱性氧化铝，10％乙酸乙酯/90％环已烷)的纯化提供0.18g琥珀酸二(2,2-二甲基-丙酰氧基甲基)酯，作为油。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ1.23(s,18H),2.71(s,4H),5.77(s,4H).

实施例2：琥珀酸2,2-二甲基-丙酰氧基甲酯甲酯

将琥珀酸甲酯(1.3g，10mmol)和新戊酸氯甲酯(2.9mL，20mmol)加入丙酮(2mL)，然后在冰中冷却混合物。分批添加三乙胺(2.0mL，14mmol)并在室温下搅拌溶液过夜。

浓缩混合物，然后在水和乙酸乙酯之间加以分配。用水然后用碳酸氢钠溶液来洗涤乙酸乙酯溶液，经碳酸钾干燥并浓缩以得到2.4g琥珀酸2,2-二甲基-丙酰氧基甲酯甲酯，作为油。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ1.23(s,9H),2.68(m,4H),3.71(s,3H),5.78(s,2H).

实施例3：琥珀酸二乙酰氧基甲酯

将琥珀酸(58.6g，0.496摩尔)加入二氯甲烷(2L)并将混合物冷却至0℃。在20分钟期间添加二异丙基乙胺(201mL，1.154摩尔)，接着在30分钟添加乙酸溴甲酯(159.4g，1.042摩尔)，然后在氮气气氛下搅拌溶液过夜。

将溶液冷却至0℃，然后用1L冷1％盐酸、0.6％盐酸和水(x3)依次洗涤。用脱色炭来处理溶液，用硫酸镁干燥并浓缩至油，其结晶自乙醚(200mL)/异己烷(10mL)以提供92g琥珀酸二乙酰氧基甲酯，作为白色固体。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ2.13(s,6H),2.72(s,4H),5.76(s,4H).

另外8g纯物质获自上述液体的浓缩。

实施例4：琥珀酸乙酰氧基甲基酯甲酯

将琥珀酸甲酯(2.0g，15.1mmol)溶解于乙腈(200mL)并添加乙酸溴甲酯(1.65mL，16.8mmol)。在冷水中冷却溶液并添加二异丙基乙胺(3.16mL，18.2mmol)。允许溶液升温并在室温下搅拌70分钟。

将溶液倒入冰/水(400mL)并用乙酸乙酯提取。用水、1％盐酸、碳酸氢钠溶液和盐水来洗涤上述乙酸乙酯溶液。它用硫酸镁加以干燥并浓缩至油。

通过MPLC(SiO₂，异己烷→20％乙酸乙酯/80％异己烷)纯化产生0.91g琥珀酸乙酰氧基甲基酯甲酯。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ2.13(s,3H),2.69(m,4H),3.71(s,3H),5.77(s,2H).

实施例5：琥珀酸二(1-乙酰氧基-乙基)酯

将琥珀酸(58.6g，0.496摩尔)加入二氯甲烷(2L)并将混合物冷却至0℃。在20分钟期间添加二异丙基乙胺(201mL，1.154摩尔)，接着在30分钟期间添加乙酸-1-溴乙酯(159.4g，1.042摩尔)，然后在氮气气氛下搅拌溶液过夜。

将溶液冷却至0℃，然后依次用冷(1.5L量)水、1％盐酸(两次)、碳酸氢钠溶液和水加以洗涤。用硫酸镁来干燥溶液并浓缩至油，其结晶自叔丁基甲基醚以提供41g琥珀酸二乙酰氧基甲酯，作为白色固体。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ1.48(d,J＝5.4Hz,6H),2.07(s,6H),2.66(m,4H),6.87(q,J＝5.5Hz,1H).

实施例6：琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯甲酯

将琥珀酸甲酯(2.46g，18.6mmol)溶解于乙腈(350mL)并将溶液冷却至-5℃。添加乙酸1-溴乙酯(3.3g，19.8mmol)，然后添加二异丙基乙胺(4.0mL，23.3mmol)。允许溶液升温并在室温下搅拌3天。

冷却溶液并在冷水和乙酸乙酯之间加以分配。用1％盐酸、碳酸氢钠溶液，然后两次用水来洗涤上述乙酸乙酯溶液。用硫酸镁来干燥溶液并浓缩至油。

通过MPLC(SiO₂，异己烷→10％乙酸乙酯/90％异己烷)纯化产生1.9g琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯甲酯，作为油。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ1.48(d,J＝5.3Hz,3H),2.07(s,3H),2.65(m,4H),3.70(s,3H),6.86(q,J＝5.3Hz,1H).

实施例7：琥珀酸二(1-乙酰氧基-丙基)酯

将琥珀酸(2.0g，16.9mmol)溶解于乙腈(350mL)并将溶液冷却至-5℃。添加乙酸1-溴丙酯(6.7g，37.0mmol)，然后添加二异丙基乙胺(7.3mL，41.9mmol)。在室温下搅拌溶液3天。

冷却溶液并在冷水和乙酸乙酯之间加以分配。用冷1％盐酸、碳酸氢钠溶液，然后用水，来洗涤上述乙酸乙酯溶液。它用硫酸镁加以干燥并浓缩至油。

通过MPLC(SiO₂，异己烷→10％乙酸乙酯/90％异己烷)纯化产生0.85g琥珀酸二(1-乙酰氧基-丙基)酯，作为油。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ0.97(t,J＝7.6Hz,6H),1.81(m,4H),2.09(s,6H),2.68(m,4H),6.77(t,J＝5.6Hz,2H).

实施例8：琥珀酸二(1-丙酰氧基-乙基)酯

将琥珀酸(2.0g，37.0mmol)溶解于乙腈(350mL)并将溶液冷却至-5℃。添加丙酸-1-溴乙酯(6.7g，37.0mmol)，然后添加二异丙基乙胺(7.3mL，41.9mmol)。允许溶液升温并在室温下搅拌过夜。

冷却溶液并在冷水和乙酸乙酯之间加以分配。用冷1％盐酸、碳酸氢钠溶液，然后两次用水，来洗涤上述乙酸乙酯溶液。它用硫酸镁加以干燥并浓缩至油。

通过MPLC(SiO₂，异己烷→10％乙酸乙酯/90％异己烷)纯化产生3.1g琥珀酸二(1-丙酰氧基-乙基)酯，作为油。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ1.15(t,J＝7.5Hz,6H),1.49(d,J＝5.4Hz,6H),2.36(q,J＝7.6Hz,4H),2.66(m,4H),6.90(t,J＝5.4Hz,2H).

实施例9：1,3,5,7-四氧杂-环十一烷-8,11-二酮

将丙酰溴(8mL，89mmol)溶解于二氯甲烷(20mL)并将溶液冷却至-5℃。添加氯化锌(35mg，0.26mmol)，接着在30分钟期间分批添加三氧杂环己烷(2.67g，29.7mmol)。在0℃下搅拌溶液1小时，然后在室温下搅拌另外1小时。用冷水洗涤溶液三次，用硫酸镁加以干燥，然后浓缩至油。

将来自此反应的粗产物(7.0g)加入琥珀酸(2.34g，19.8mmol)和二异丙基乙胺(8.3mL，43.7mmol)在冷却至-5℃的二氯甲烷(350mL)中的混合物。在室温下搅拌溶液过夜，然后用冷1％盐酸、碳酸氢钠溶液，接着三次用水，加以洗涤。它用硫酸镁加以干燥并浓缩至油。用乙醚进行研制以提供0.24g的1,3,5,7-四氧杂-环十一烷-8,11-二酮，作为白色固体。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ2.66(s,4H),5.00(s,2H),5.43(s,4H)。

实施例10：琥珀酸乙酰氧基甲酯二乙基氨基甲酰甲酯

i)2-氯-N,N-二乙基-乙酰胺

在二氯甲烷(30mL)中稀释二乙胺(10.0mL，97mmol)和三乙胺(13.5mL，97mmol)，将溶液冷却至0℃，并在10分钟期间添加在DCM(10ml)中的氯乙酰氯(7.7mL，97mmol)，然后允许溶液升温到室温并在氮气气氛下搅拌过夜。用水(2x10mL)洗涤溶液。合并有机物并真空除去挥发物。通过硅胶色谱法并借助于连续梯度的1:0至1:1的异己烷/乙酸乙酯，来纯化残余物以提供标题化合物(12.3g)，作为透明油。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.11(t,J＝7.1Hz,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,3H),3.35(quint,J＝6.9Hz,4H),4.03(s,2H).

LCMS(m/z)150.1–152.1[M+H]⁺.

ii)琥珀酸叔丁基酯二乙基氨基甲酰甲酯

将2-氯-N,N-二乙基-乙酰胺(实施例10，步骤(i)，1.71g，11.48mmol)、琥珀酸单叔丁基酯(2.00g，11.48mmol)、碳酸铯(2.67g，13.78mmol)、和碘化钠(171mg，1.14mmol)悬浮在DMF(20mL)中，然后在氮气气氛和80℃下搅拌悬浮液3小时。将悬浮液冷却至室温，用乙酸乙酯(40mL)稀释并用水(3x10mL)洗涤。合并有机物并真空除去挥发物。通过硅胶色谱法并借助于1:0至0:1的异己烷/乙酸乙酯的连续梯度来纯化残余物以提供标题化合物(3.29g)，作为透明油。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.13(t,J＝7.1Hz,3H),1.22(t,J＝7.1Hz,3H),1.44(s,9H),2.55-2.77(m,4H),3.24(q,J＝7.1Hz,2H),3.38(q,J＝7.1Hz,2H),4.73(s,2H).

LCMS(m/z)288.1[M+H],Tr＝2.07分钟。

iii)琥珀酸单二乙基氨基甲酰甲酯

将琥珀酸叔丁基酯二乙基氨基甲酰甲酯(实施例10，步骤(ii)，3.29g，11.48mmol)溶解于DCM(15mL)，将溶液冷却至0℃，然后添加三氟乙酸(5mL)。允许溶液升温到室温并在氮气气氛下搅拌过夜。真空除去挥发物，然后和甲苯(3x20mL)一起共沸残余物以提供标题化合物(3.19g)，作为透明油。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.16(t,J＝7.1Hz,3H),1.26(t,J＝7.1Hz,3H),2.65-2.85(m,4H),3.30(q,J＝7.1Hz,2H),3.42(q,J＝7.1Hz,2H),4.79(s,2H),10.43(br,1H).

LCMS(m/z)232.1[M+H]⁺,230.1[M-H]^-.

实施例10：琥珀酸乙酰氧基甲酯二乙基氨基甲酰甲酯

将琥珀酸单二乙基氨基甲酰甲酯(实施例10，步骤(iii)，850mg，3.68mmol)、乙酸溴甲酯(671mg，4.42mmol)、碳酸铯(1.78g，9.20mmol)悬浮在DMF(10mL)中，然后在氮气气氛和80℃下搅拌悬浮液2小时。将悬浮液冷却至室温，用乙酸乙酯(30mL)稀释并用水(3x5mL)洗涤。合并有机物并真空除去挥发物。通过硅胶色谱法并借助于1:0至0:1的异己烷/乙酸乙酯的连续梯度来纯化残余物以提供标题化合物(334mg)，作为白色固体。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.14(t,J＝7.1Hz,3H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H),2.12(s,3H),2.67-2.87(m,4H),3.25(q,J＝7.1Hz,2H),3.39(q,J＝7.1Hz,2H),4.75(s,2H),5.76(s,2H).

LCMS(m/z)304.0[M+H]⁺.

实施例11：琥珀酸二乙基氨基甲酰甲酯1-乙氧基羰氧基乙酯

将琥珀酸单二乙基氨基甲酰甲酯(500mg，2.16mmol)、碳酸1-氯-乙酯乙酯(395mg，2.60mmol)、碳酸铯(625mg，3.24mmol)、碘化钠(32mg，0.21mmol)悬浮于DMF(10mL)，然后在氮气气氛和80℃下搅拌悬浮液3小时。将悬浮液冷却至室温，用乙酸乙酯(30mL)稀释并用水(3x5mL)洗涤。合并有机物并真空除去挥发物。通过硅胶色谱法并借助于1:0至0:1的异己烷/乙酸乙酯的连续梯度来纯化残余物以提供标题化合物(585mg)，作为透明油。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.14(t,J＝7.1Hz,3H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H),1.53(d,J＝5.5Hz 3H),2.67-2.87(m,4H),3.25(q,J＝7.1Hz,2H),3.39(q,J＝7.1Hz,2H),4.22(q,J＝7.1Hz,2H),4.74(d,J＝8.03Hz,2H),6.77(q,J＝5.5Hz,1H).

LCMS(m/z)348.0[M+H]⁺.

实施例12：琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯二乙基氨基甲酰甲酯

将琥珀酸单二乙基氨基甲酰甲酯(500mg，2.16mmol)、乙酸1-溴-乙酯(434mg，2.60mmol)、碳酸铯(625mg，3.24mmol)悬浮于DMF(10mL)并在氮气气氛和70℃下搅拌悬浮液2小时。将悬浮液冷却至室温，用乙酸乙酯(30mL)稀释并用水(3x5mL)洗涤。合并有机物并真空除去挥发物。通过硅胶色谱法并借助于1:0至0:1的异己烷/乙酸乙酯的连续梯度来纯化残余物以提供标题化合物(352mg)，作为透明油。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.14(t,J＝7.1Hz,3H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H),1.48(d,J＝5.5Hz,3H),2.07(s,3H),2.66-2.85(m,4H),3.25(q,J＝7.1Hz,2H),3.39(q,J＝7.1Hz,2H),4.74(d,J＝5.1Hz,2H),6.87(q,J＝5.5Hz,1H).

LCMS(m/z)318.1[M+H]⁺.

实施例13：琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯乙酰氧基甲酯

i)琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯叔丁基酯

将琥珀酸单叔丁基酯(2.0g，11.48mmol)、乙酸1-溴-乙酯(1.9g，11.48mmol)、碳酸铯(2.6g，13.41mmol)悬浮于DMF(20mL)，然后在氮气气氛和60℃下搅拌悬浮液2小时。将悬浮液冷却至室温，用乙酸乙酯(50mL)稀释并用水(3x10mL)洗涤。合并有机物并真空除去挥发物。通过硅胶色谱法并借助于1:0至0:1的异己烷/乙酸乙酯的连续梯度来纯化残余物以提供标题化合物(2.21g)，作为透明油。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.45(s,9H),1.48(d,J＝5.5Hz,3H),2.07(s,3H),2.50-2.65(m,4H),6.88(q,J＝5.5Hz,1H).

ii)琥珀酸单(1-乙酰氧基-乙基)酯

将琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯叔丁基酯(实施例13，步骤(i)，2.21g，8.49mmol)溶解于DCM(10mL)，将溶液冷却至0℃并添加三氟乙酸(2mL)。允许溶液升温至室温并在氮气气氛下搅拌3小时。真空除去挥发物，连同甲苯(3x20mL)一起来共沸残余物以提供标题化合物(1.52g)，作为透明油。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.40(d,J＝5.5Hz,3H),2.03(s,3H),2.40-2.60(m,4H),6.73(q,J＝5.5Hz,1H),10-14(br,1H).

实施例13：琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯乙酰氧基甲酯

将琥珀酸单(1-乙酰氧基-乙基)酯(实施例13，步骤(ii)，500mg，2.45mmol)、乙酸溴甲酯(450mg，2.93mmol)、碳酸铯(712mg，3.67mmol)悬浮于DMF(10mL)并在氮气气氛和60℃下搅拌悬浮液3小时。将悬浮液冷却至室温，用乙酸乙酯(30mL)稀释并用水(3x5mL)洗涤。合并有机物并真空除去挥发物。通过硅胶色谱法并借助于1:0至0:1的异己烷/乙酸乙酯的连续梯度来纯化残余物以提供标题化合物(267mg)，作为透明油。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.49(d,J＝5.5Hz,3H),2.08(s,3H),2.13(s,3H),2.60-2.77(m,4H),5.76(s,2H),6.87(q,J＝5.5Hz,1H).

LCMS(m/z)377.0[M+H]⁺.

实施例14：琥珀酸二(2,2-二甲基-5-氧代-[1,3]二氧戊环-4-基)酯

在氮气气氛下和在冰浴中冷却的情况下，向在乙腈中的琥珀酸(2.36g，20mmol)和二异丙基乙胺(8.1mL，46.5mmol)添加5-溴-2,2-二甲基-[1,3]二氧戊环-4-酮(8.27g，42.4mmol)。允许混合物经18小时升温至室温。在冰浴中再冷却溶液，用乙酸乙酯稀释，然后用1M HCl、水、碳酸氢钠水溶液和水加以洗涤。经硫酸镁来干燥有机相并浓缩以提供标题化合物(3.4g)，作为白色固体。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.15(m,12H),2.41(m,4),5.77(m,2H).

实施例15：琥珀酸二(甲氧基-甲氧基羰基-甲基)酯

通过根据实施例14的方法来制备标题化合物。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ2.83(4H,m),3.47(6H s),3.59(6H,s),5.97(2H,s).

实施例16：琥珀酸1-乙酰氧基-乙酯1-乙氧基羰氧基-乙酯

将琥珀酸单(1-乙酰氧基-乙基)酯(实施例13，步骤(ii)，1g，4.90mmol)、碳酸1-氯乙基乙酯(895mg，5.88mmol)、碳酸铯(1.4g，7.35mmol)和碘化钠(73mg，0.49mmol)溶解于DMF(15mL)并加热混合物至80℃持续3小时。允许混合物冷却至室温，然后在水和乙酸乙酯之间加以分配。经硫酸镁来干燥有机层并浓缩以提供粗残余物，其是通过硅胶色谱法并借助于1:0至0:1的异己烷/乙酸乙酯的连续梯度加以纯化以提供标题化合物(118mg)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.31(t,J＝7.1Hz,3H),1.46(d,J＝5.4Hz,3H),1.51(d,J＝5.4Hz,3H),2.06(s,3H),2.56-2.74(m,4H),4.21(q,J＝7.1Hz,2H),6.76(q,J＝5.4Hz,1H),6.85(q,J＝5.4Hz,1H).

实施例17：琥珀酸3-(1-乙酰氧基-乙氧基羰基)-丙酰氧基甲基酯1-乙酰氧基-乙酯

i)琥珀酸3-叔丁氧基羰基-丙酰氧基甲基酯叔丁基酯

向琥珀酸叔丁酯(8.7g，50mmol)添加氢氧化钠水溶液(50mL，2M)，然后搅拌混合物10分钟。添加硫酸氢四丁基铵(17g)并搅拌混合物另外30分钟。用二氯甲烷(4x 100mL)来提取溶液并经硫酸镁来干燥合并的提取物。然后在40℃下加热二氯甲烷溶液5天。允许溶液冷却至室温，并用硫酸(1M)、水和碳酸氢钠溶液，接着用水，加以洗涤。然后干燥有机相并浓缩以提供标题化合物，作为粗产物(5.7g)。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ1.45(s,18H),2.53-2.67(m,8H),5.79(m,2H).

ii)琥珀酸单(3-羧基-丙酰氧基甲基)酯

将琥珀酸3-叔丁氧基羰基-丙酰氧基甲基酯叔丁基酯(1.8g，5mmol)溶解于二氯甲烷(27mL)，然后在氮气下冷却混合物至-78℃。添加三氟乙酸(0.77mL，10mmol)并允许混合物升温至4℃，其后将它保持在4℃下18小时。蒸发混合物并连同甲苯一起加以共沸。分析显示不完全反应，所以使粗混合物经受相同的反应条件另外4天。蒸发混合物并连同甲苯一起加以共沸，然后，作为粗产物(1.3g)，用于以下步骤。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ2.52-2.64(m,8H),5.71(s,2H).

实施例17：琥珀酸3-(1-乙酰氧基-乙氧基羰基)-丙酰氧基甲基酯1-乙酰氧基-乙酯

通过实施例6的方法并利用琥珀酸单(3-羧基-丙酰氧基甲基)酯(实施例17ii，1.3g)和乙酸1-溴乙酯(1.8g)来制备标题化合物以在纯化以后提供240mg产物。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ1.50(d,6H),2.09(s,6H),2.60-2.75(m,8H),5.78(s,2H),6.90(q,2H).

实施例18：琥珀酸3-乙酰氧基甲氧基羰基-丙酰氧基甲基酯乙酰氧基甲酯

通过实施例6的方法并利用琥珀酸单(3-羧基-丙酰氧基甲基)酯(实施例17ii，1.0g，4.0mmol)和1-乙酸溴甲酯(1.3g，8.5mmol)来制备标题化合物以在纯化后提供1.4g产物。

¹H NMR(CDCl₃,ppm)δ2.15(s,6H),2.73(s,8H),5.72-5.82(m,6H).

实施例19

将琥珀酰氯(0.1mol)和三乙胺(0.4mol)溶解于DCM并添加半胱氨酸。在室温下搅拌反应。将反应加入含水稀盐酸，然后用水和盐水加以洗涤。经硫酸镁来干燥有机层并在真空下减少。通过硅胶色谱法来纯化目标化合物。

实施例20：S,S-二(2-丙酰胺基乙基)丁烷二(硫代酸酯)(NV038,01-038)的合成

向盐酸半胱胺(5.0g，44mmol)在CH₃OH(50mL)中的溶液加入Et₃N(4.4g，44mmol)，接着加入(Boc)₂O(10.5g，48.4mmol)，然后在室温下搅拌混合物1小时。真空浓缩反应混合物。将获得的残余物溶解于CH₂Cl₂，用2M HCl水溶液和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发以产生2-巯基乙基氨基甲酸叔丁酯，作为无色油，其用于下一步骤而没有进一步的纯化。

将2-巯基乙基氨基甲酸叔丁酯(9.8g，55.0mmol)和Et₃N(5.6g，55.0mmol)溶解于CH₂Cl₂(100mL)，将混合物冷却至0℃，逐滴添加琥珀酰氯(2.1g，13.8mmol)。然后在室温下搅拌混合物2小时。浓缩反应混合物并通过柱色谱(石油醚/EtOAc＝1/10至1/1)来纯化残余物。获得S,S-二(2-(叔丁氧基羰基氨基)乙基)丁烷二(硫代酸酯)，作为白色固体。

在室温下搅拌S,S-二(2-(叔丁氧基羰基氨基)乙基)丁烷二(硫代酸酯)(2.0g，4.58mmol)和TFA(10mL)在CH₂Cl₂(10mL)中的混合物4小时。浓缩反应混合物以产生S,S-二(2-氨基乙基)丁烷二(硫代酸酯)，作为黄色油，其用于下一步骤而没有进一步的纯化。

将S,S-二(2-氨基乙基)丁烷二(硫代酸酯)(1.1g，4.58mmol)和Et₃N(1.4g，13.74mmol)溶解于CH₂Cl₂(15mL)，将混合物冷却至0℃，滴加丙酰氯(0.9g，10.07mmol)。然后在室温下搅拌混合物3小时。浓缩反应混合物并通过制备性TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝15/1)来纯化残余物。获得S,S-二(2-丙酰胺基乙基)丁烷二(硫代酸酯)，作为白色固体。

实施例21：(R)-4-(2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧代丁酸(NV-041,01-041)的合成

向L-半胱氨酸(2.00g，16.5mmol)在THF/H₂O(8mL/2mL)中的混合物添加NaOAc(2.70g，33.0mmol)。在室温下搅拌混合物20分钟。在逐滴添加丙酸酐(2.30g，17.6mmol)以前，将反应冷却至5℃。在室温下搅拌反应混合物过夜，然后加热至回流4小时。冷却反应混合物并通过添加4N HCl来酸化至pH 5。在减压下蒸发得到的溶液以除去THF。通过制备性HPLC(用H₂O(0.05％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化残余物以产生1.00g的(R)-3-巯基-2-丙酰胺基丙酸，作为无色油。

在回流下加热(R)-3-巯基-2-丙酰胺基丙酸(1.00g，5.65mmol)、琥珀酸酐(565mg，5.65mmol)和Et₃N(572mg，5.65mmol)的10mL的THF中的溶液过夜。浓缩反应混合物并通过制备性HPLC(用H₂O(0.05％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化残余物以产生(R)-4-(2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧代丁酸，作为无色油。

实施例22

步骤1

将三乙胺(0.24mol)加入N-乙酰基半胱胺(0.2mol)在DCM中的溶液。逐滴添加4-氯-4-氧代丁酸(0.1mol)，并在室温下搅拌反应混合物。将混合物加入含水稀盐酸并用乙酸乙酯提取，然后用水和盐水加以洗涤。经硫酸镁来干燥有机层并在真空下减少。

步骤2

将步骤3的产物(0.1mol)、乙酸-1-溴乙酯(0.1mol)和碳酸铯(0.12mol)悬浮于DMF并在惰性气氛和60℃下搅拌。允许悬浮液冷却至室温并添加乙酸乙酯，然后依次用含水稀盐酸和水加以洗涤。经硫酸镁来干燥有机物并在真空下减少。通过柱色谱来纯化残余物。

实施例23

步骤1

将三乙胺(0.24mol)加入N-乙酰基半胱胺(0.2mol)在DCM中的溶液。逐滴添加4-氯-4-氧代丁酸(0.1mol)，然后在室温下搅拌反应混合物。将混合物加入含水稀盐酸并用乙酸乙酯提取，然后用水和盐水加以洗涤。经硫酸镁来干燥有机层并在真空下减少。

步骤2

在二氯甲烷中稀释二甲胺(0.1mol)和三乙胺(0.1mol)，将溶液冷却至0℃并添加在DCM中的2-氯丙酰氯(0.1mol)，然后允许溶液升温至室温并在惰性气氛下保持搅拌。用水洗涤溶液。合并有机物并真空除去挥发物。通过硅胶色谱法来纯化残余物。

步骤3

将2-氯-N,N-二甲基-丙酰胺(0.1mol)、步骤1的产物(0.1mol)、碳酸铯(0.1mol)、和碘化钠(0.01mol)悬浮于DMF，并在惰性气氛和80℃下搅拌悬浮液。将悬浮液冷却至室温，用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。在真空下减少有机物。通过硅胶色谱法来纯化残余物以产生目标化合物。

实施例24：4-氧代-4-(2-丙酰胺基乙硫基)丁酸(NV114,01-114)的合成

将丙酸酐(11.7g，89.7mmol)和含水KOH(8M，以保持pH＝8)逐滴添加入盐酸半胱胺(3.40g，30.0mmol)在24mL水中的搅拌溶液。通过添加2N HCl来中和混合物并在室温下搅拌1小时。用冰浴来冷却溶液并缓慢添加固体KOH(6.00g，105mmol)。在室温下搅拌混合物50分钟。在用NaCl饱和并用6N HCl中和以后，用CH₂Cl₂(4×30mL)来提取混合物。干燥(Na₂SO₄)合并的CH₂Cl₂提取物并真空浓缩以产生N-(2-巯基乙基)丙酰胺，作为无色油，其用于下一步骤而没有进一步的纯化。

在回流下加热N-(2-巯基乙基)丙酰胺(2.00g，15.0mmol)、琥珀酸酐(1.50g，15.0mmol)和Et₃N(1.50g，15.0mmol)在20mL的THF中的溶液过夜。浓缩反应混合物并通过制备性HPLC(用H₂O(0.05％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化残余物以产生4-氧代-4-(2-丙酰胺基乙硫基)丁酸，作为无色油。

实施例25：4-(2-乙酰氨基乙硫基)-4-氧代丁酸(NV108,01-108)的合成

将乙酸酐(8.48mL，90.0mmol)和含水KOH(8M以保持pH＝8)逐滴添加入盐酸半胱胺(3.40g，30.0mmol)在24mL水中的搅拌溶液。然后借助于添加2N HCl将pH调节为7。在室温下搅拌混合物1小时，然后借助于冰浴来冷却溶液。向上述溶液缓慢添加固体KOH(6.0g，105mmol)，然后在室温下搅拌产生的混合物50分钟。在用NaCl饱和并用6N HCl中和以后，用CH₂Cl₂(4×30mL)来提取混合物。干燥(Na₂SO₄)合并的CH₂Cl₂提取物并真空浓缩以产生N-(2-巯基乙基)乙酰胺，作为无色油，其用于下一步骤而没有进一步的纯化。

在回流下加热N-(2-巯基乙基)乙酰胺(1.50g，12.7mmol)、琥珀酸酐(1.3g，12.7mmol)和Et₃N(1.3g，12.7mmol)在20mL的THF中的溶液过夜。浓缩反应混合物并通过制备性HPLC(用H₂O(0.05％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化残余物以产生4-(2-乙酰氨基乙硫基)-4-氧代丁酸，作为无色油。

实施例26：(R)-3-(4-((R)-2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸(NV099,01-099)的合成

向N-羟基琥珀酰亚胺(3.00g，26.1mmol)和Et₃N(3.20g，31.3mmol)在CH₂Cl₂(60mL)中的混合物逐滴添加琥珀酰氯(2.00g，13.0mmol)。在用水(60mL)稀释以前，在室温下搅拌混合物3小时。过滤导致的悬浮液，用水和CH₂Cl₂洗涤。收集滤饼并干燥以产生二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)琥珀酸酯，作为灰色固体。

在室温下搅拌N-(2-巯基乙基)丙酰胺(400mg，2.26mmol)、二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)琥珀酸酯(353mg，1.13mmol)和TEA(286mg，2.83mmol)在3.0mL的CH₃CN中的混合物2小时。直接通过制备性HPLC(用H₂O(0.05％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化清晰的反应溶液以产生(R)-3-(4-((R)-2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸，作为无色油。

实施例27：(R)-4-(1-羧基-2-(丙酰硫基)乙基氨基)-4-氧代丁酸(NV122,01-122)的合成

向(R)-3-巯基-2-丙酰胺基丙酸(1.00g，8.25mmol)和丙酸(1.0mL)在CHCl₃(10mL)中的混合物逐滴添加丙酸酐(1.13g，8.67mmol)。加热反应混合物至回流过夜。冷却反应混合物并添加琥珀酸酐(1.00g，9.99mmol)。在减压下浓缩以前回流混合物过夜。通过制备性HPLC(用H₂O(0.05％TFA)和CH3CN洗脱)来纯化残余物以产生(R)-4-(1-羧基-2-(丙酰硫基)乙基氨基)-4-氧代丁酸，作为灰白色固体。

实施例28：4-(1-乙酰氨基-2-甲基丙烷-2-硫基)-4-氧代丁酸(NV188,01-188)的合成

向盐酸半胱胺(2.00g，14.1mmol)在15mL水中的搅拌溶液逐滴添加乙酸酐(4.30g，42.4mmol)和含水KOH(8M以保持pH＝8)。然后通过添加2N HCl来中和混合物，并在室温下搅拌1小时。向用冰浴冷却的溶液缓慢添加固体KOH(2.80g，49.4mmol)并在室温下搅拌混合物50分钟。在用NaCl饱和并用6N HCl中和以后，用CH₂Cl₂来提取混合物两次。干燥(Na₂SO₄)合并的CH₂Cl₂提取物并真空浓缩以产生N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺，作为白色固体，其用于下一步骤而没有进一步的纯化。

在过夜下，加热N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺(400mg，2.72mmol)、琥珀酸酐(326mg，3.26mmol)和Et₃N(330mg，3.26mmol)在6mL的THF中的溶液。浓缩反应混合物并通过制备性HPLC(用H₂O(0.05％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化残余物以产生4-(1-乙酰氨基-2-甲基丙烷-2-硫基)-4-氧代丁酸，作为黄色油。

实施例29：S,S-二((R)-3-(二乙基氨基)-3-氧代-2-丙酰胺基丙基)丁烷二(硫代酸酯)(NV185,01-185)的合成

在0℃下，向(R)-3-巯基-2-丙酰胺基丙酸(5.00g，28.0mmol)在DMF(50mL)中的溶液添加三苯基氯甲烷(8.70g，31.0mmol)。在0℃下搅拌混合物30分钟，然后升温至室温过夜。用水处理混合物，然后用EtOAc提取两次。用盐水洗涤合并的有机层，经Na₂SO₄干燥并在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱(CH₂Cl₂/MeOH＝80/1～50/1)来纯化残余物以产生(R)-2-丙酰胺基-3-(三苯甲硫基)丙酸，作为白色固体。

在室温下，向(R)-2-丙酰胺基-3-(三苯甲硫基)丙酸(1.7g，4.0mmol)在CH₂Cl₂(50mL)中的搅拌溶液添加DCC(1.7g，8.0mmol)和HOBT(0.50g，4.0mmol)。在室温下搅拌混合物1小时，然后添加二乙胺(0.80g，8.0mmol)。在室温下搅拌混合物过夜。用水洗涤混合物，经Na₂SO₄干燥并在减压下浓缩以产生粗产物，其通过硅胶柱色谱(EtOAc/石油醚＝1/6～1/1)加以纯化以产生(R)-N,N-二乙基-3-巯基-2-丙酰胺基丙酰胺，作为黄色油。

在0℃下，向(R)-N,N-二乙基-3-巯基-2-丙酰胺基丙酰胺(400mg，0.800mmol)在CH₂Cl₂(10mL)中的溶液添加TFA(1mL)和i-Pr3SiH(253mg，1.60mmol)。将混合物升温至室温并搅拌2小时。在减压下蒸发溶液。通过制备性HPLC(用H₂O(0.5％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化残余物以产生(R)-N,N-二乙基-3-巯基-2-丙酰胺基丙酰胺，作为黄色油。

在室温下搅拌(R)-N,N-二乙基-3-巯基-2-丙酰胺基丙酰胺(150mg，0.600mmol)、Et₃N(242mg，2.40mmol)和二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)琥珀酸酯(94mg，0.30mmol)在CH₃CN(100mL)中的混合物过夜。在减压下蒸发混合物。通过制备性HPLC(用H₂O(0.5％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化残余物以产生S,S-二((R)-3-(二乙基氨基)-3-氧代-2-丙酰胺基丙基)丁烷二(硫代酸酯)(产率为36％)，作为黄色固体。

实施例30：4-(2-(2-(二乙基氨基)-2-氧乙氧基)乙硫基)-4-氧代丁酸(NV193,01-193)的合成

在0℃下，向2-溴乙酰溴(4.00g，20.0mmol)和DIPEA(2.60g，20mmol)在CH₂Cl₂(50mL)中的溶液逐滴添加二乙胺(1.60g，20.0mmol)。在0℃下搅拌混合物30分钟。在减压下蒸发溶液以除去CH₂Cl₂。通过硅胶柱色谱(EtOAc/石油醚＝1/5～1/2)来纯化残余物以产生2-溴-N,N-二乙基乙酰胺，作为黄色油。

在回流下加热2-巯基乙醇(2.50g，32.0mmol)、三苯基氯甲烷(10.7g，38.4mmol)在100mL的THF中的溶液过夜。浓缩反应混合物并通过硅胶柱色谱(EtOAc/石油醚＝1/5～1/1)来纯化残余物以产生2-(2,2,2-三苯基乙硫基)乙醇，作为白色固体。

在0℃下，向2-(2,2,2-三苯基乙硫基)乙醇(3.50g，10.9mmol)在THF(30mL)中的溶液分批添加NaH(0.500g，13.0mmol，60％，在油中)。在0℃下搅拌反应混合物1小时。然后逐滴添加2-溴-N,N-二乙基乙酰胺(2.1g，10.9mmol)在THF(5mL)中的溶液。经2小时，将产生的混合物升温至室温。用水骤冷混合物并用EtOAc提取两次。用盐水洗涤合并的有机层，经Na₂SO₄干燥并在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱(EtOAc/石油醚＝1/5～1/2)来纯化残余物以产生N,N-二乙基-2-(2-(三苯甲硫基)乙氧基)乙酰胺，作为白色固体。

在0℃下，向N,N-二乙基-2-(2-(三苯甲硫基)乙氧基)乙酰胺(2.70g，6.30mmol)在CH₂Cl₂(20mL)中的溶液添加TFA(2mL)和i-Pr₃SiH(2.00g，12.6mmol)。将混合物升温至室温并搅拌2小时。在减压下蒸发溶液以除去CH₂Cl₂。通过硅胶柱色谱(EtOAc/石油醚＝1/5～1/1)来纯化残余物以产生N,N-二乙基-2-(2-巯基乙氧基)乙酰胺，作为无色油。

在回流下，搅拌N,N-二乙基-2-(2-巯基乙氧基)乙酰胺(356mg，1.90mmol)、琥珀酸酐(200mg，2.10mmol)和Et₃N(300mg，2.90mmol)在10mL的THF中的溶液过夜。真空浓缩反应混合物并通过制备性HPLC(用H₂O(0.5％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化残余物以产生4-(2-(2-(二乙基氨基)-2-氧乙氧基)乙硫基)-4-氧代丁酸，作为无色油。

实施例31：(R)-甲基3-(4-((R)-3-甲氧基-3-氧代-2-丙酰胺基丙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸酯(NV205,01-205)的合成

在室温下搅拌(R)-3-(4-((R)-2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸(300mg，0.69mmol)、CH₃I(293mg，2.06mmol)和K₂CO₃(475mg，3.44mmol)在4.0mL的DMF中的混合物过夜。过滤反应混合物并直接通过制备性HPLC(用H₂O(0.05％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化滤液以产生(R)-甲基3-(4-((R)-3-甲氧基-3-氧代-2-丙酰胺基丙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸酯，作为灰白色固体。

实施例32：NV189的合成

在室温下搅拌N-(2-巯基-2-甲基丙基)乙酰胺(400mg，2.72mmol)、二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)琥珀酸酯(339mg，1.09mmol)和Et₃N(550mg，5.44mmol)在6mL的CH₃CN中的混合物过夜。浓缩反应混合物并通过制备性HPLC(用H₂O(0.05％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化残余物以产生NV189，作为灰白色固体。

实施例33：S,S-二(2-(2-(二乙基氨基)-2-氧乙氧基)乙基)丁烷二(硫代酸酯)(NV195,01-195)的合成

向N,N-二乙基-2-(2-巯基乙氧基)乙酰胺(438mg，2.3mmol)在CH₃CN(10mL)中的溶液添加二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)琥珀酸酯(374mg，1.2mmol)和Et₃N(232mg，2.3mmol)。在室温下搅拌混合物过夜。真空浓缩反应混合物并通过制备性HPLC(用H₂O(0.5％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化残余物以产生S,S-二(2-(2-(二乙基氨基)-2-氧乙氧基)乙基)丁烷二(硫代酸酯)，作为无色油。

实施例34：NV206的合成

在室温下搅拌(R)-3-(4-((R)-2-羧基-2-丙酰胺基乙硫基)-4-氧丁酰硫基)-2-丙酰胺基丙酸(400mg，0.916mmol)、CH₃I(156mg，1.1mmol)和K₂CO₃(190mg，1.37mmol)在4mL的DMF中的混合物6小时。过滤反应混合物并直接通过制备性HPLC(用H₂O(0.05％TFA)和CH₃CN洗脱)来纯化滤液以产生NV206，作为无色胶状物。

实施例35：NV134(01-134)的合成

在室温下搅拌4-氯丁-1-醇(8.00g，73.7mmol)和PCC(23.8g，110.5mmol)在CH₂Cl₂(200mL)中的溶液3小时。然后用醚稀释混合物，并通过硅藻土和中性氧化铝的垫加以过滤。在醚中研制黑色胶。浓缩滤液以得到5.70g的4-氯丁醛，作为浅黄色液体，其用于下一步骤而没有进一步的纯化。

在-5℃和氮气下，向ZnCl₂(120mg，0.9mmol)和乙酰氯(3.50g，44.1mmol)的混合物逐滴添加4-氯丁醛(4.70g，44.1mmol)在CH₂Cl₂(7mL)中的溶液。在-5℃下搅拌混合物1小时，然后在室温下搅拌混合物1小时。用水稀释混合物并用CH₂Cl₂提取两次。用水洗涤合并的CH₂Cl₂提取物，干燥(Na₂SO₄)并浓缩以产生乙酸-1,4-二氯丁酯，作为黄色油，其用于下一步骤而没有进一步的纯化。

向乙酸1,4-二氯丁酯(1.2g，6.48mmol)和琥珀酸单苄酯(1.35g，6.48mmol)在CH₃CN(15mL)中的溶液添加K₂CO₃(0.98g，7.08mmol)和NaI(0.09g，0.59mmol)。在75℃下搅拌产生的混合物过夜。用水稀释混合物并用EtOAc提取两次。干燥(Na₂SO₄)和浓缩合并的有机提取物。通过硅胶柱色谱(EtOAc/石油醚＝1/10～1/5)来纯化残余物以产生NV-133，作为无色油。

在室温下，在氢气氛下(球表瓶)，搅拌NV-133(450mg，0.85mmol)和Pd/C(10％，200mg)在EtOH(20mL)中的混合物3小时。过滤反应混合物并在减压下浓缩以产生NV-134，作为无色油。

实施例36：4-(1-乙酰氧基-4-(1,3-二氧异吲哚啉-2-基)丁氧基)-4-氧代丁酸(NV150,01-150)的合成

在-5℃和氮气下，向ZnCl₂(26.0mg，0.190mmol)和乙酰溴(1.15g，9.40mmol)的混合物逐滴添加4-氯丁醛(1.0g，9.4mmol)在CH₂Cl₂(1.5mL)中的溶液。在-5℃下搅拌混合物1小时，然后在室温下搅拌混合物1小时。用水稀释混合物并用CH₂Cl₂提取两次。用水洗涤合并的CH₂Cl₂提取物，干燥(Na₂SO₄)并在减压下浓缩以产生乙酸-1-溴-4-氯丁酯，作为黄色油，其用于下一步骤而没有进一步的纯化。

向乙酸1-溴-4-氯丁酯(1.3g，5.6mmol)和琥珀酸单苄酯(1.1g，5.1mmol)在CH₃CN(15mL)中的溶液添加K₂CO₃(0.85g，6.1mmol)。在室温下搅拌混合物过夜。用水稀释混合物并用EtOAc提取两次。干燥(Na₂SO₄)合并的有机提取物并浓缩。通过硅胶柱色谱(EtOAc/石油醚＝1/10～1/5)来纯化残余物以产生1-乙酰氧基-4-氯丁基苄基琥珀酸酯，作为无色油。

向化合物1-乙酰氧基-4-氯丁基苄基琥珀酸酯(900mg，2.50mmol)和邻苯邻二甲酰亚胺(371mg，2.50mmol)在DMF(20mL)中的溶液添加K₂CO₃(522mg，3.80mmol)。在80℃下搅拌混合物过夜。用水稀释混合物并用EtOAc提取两次。干燥(Na₂SO₄)合并的有机提取物并浓缩。通过硅胶柱色谱(EtOAc/石油醚＝1/10～1/3)来纯化残余物以产生1-乙酰氧基-4-(1,3-二氧异吲哚啉-2-基)丁基苄基琥珀酸酯(550mg，产率为46％)，作为微黄色固体。

参考文献

Al-Abri,S.A.,Hayashi,S.,Thoren,K.L.&Olson,K.R.2013.Metforminoverdose-induced hypoglycemia in the absence of other antidiabetic drugs.ClinToxicol(Phila),51,444-7.

Bailey,C.J.1992.Biguanides and NIDDM.Diabetes Care,15,755-72.

Boyum,A.1968.Isolation of mononuclear cells and granulocytes fromhuman blood.Isolation of monuclear cells by one centrifugation,and ofgranulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.Scand JClin Lab Invest Suppl,97,77-89.

Brunmair,B.,Staniek,K.,Gras,F.,Scharf,N.,Althaym,A.,Clara,R.,Roden,M.,Gnaiger,E.,Nohl,H.,Waldhausl,W.&Furnsinn,C.2004.Thiazolidinediones,likemetformin,inhibit respiratory complex I:a common mechanism contributing totheir antidiabetic actions？Diabetes,53,1052-9.

Carvalho,C.,Correia,S.,Santos,M.S.,Seica,R.,Oliveira,C.R.&Moreira,P.I.2008.Metformin promotes isolated rat liver mitochondria impairment.MolCell Biochem,308,75-83.

Chan,K.,Truong,D.,Shangari,N.&O'Brien,P.J.2005.Drug-inducedmitochondrial toxicity.Expert Opin Drug Metab Toxicol,1,655-69.

Davidson,M.B.&Peters,A.L.1997.An overview of metformin in thetreatment of type 2 diabetes mellitus.Am J Med,102,99-110.

Dykens,J.A.,Jamieson,J.,Marroquin,L.,Nadanaciva,S.,Billis,P.A.&Will,Y.2008.Biguanide-induced mitochondrial dysfunction yields increased lactateproduction and cytotoxicity of aerobically-poised HepG2 cells and humanhepatocytes in vitro.Toxicol Appl Pharmacol,233,203-10.

Dykens,J.A.&Will,Y.2007.The significance of mitochondrial toxicitytesting in drug development.Drug Discov Today,12,777-85.

El-Mir,M.Y.2000.Dimethylbiguanide Inhibits Cell Respiration via anIndirect Effect Targeted on the Respiratory Chain Complex I.J Biol Chem,275,223-228.

Farina,J.A.,Celotto,A.C.,da Silva,M.F.&Evora,P.R.B.2012.Guanylatecyclase inhibition by methylene blue as an option in the treatment ofvasoplegia after a severe burn.A medical hypothesis.Medical Science Monitor,18,Hy13-Hy17.

Fisher,J.,Taori,G.,Braitberg,G.&Graudins,A.2014.Methylene blue usedin the treatment of refractory shock resulting from drug poisoning.ClinToxicol(Phila),52,63-5.

Gnaiger,E.2008.Polarographic oxygen sensors,the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function.In:DYKENS,J.A.,WILL,Y.(Ed.)Mitochondrial Dysfunction in Drug-Induced Toxicity.John Wiley&Sons,Inc.

Golan,D.E.,Tashjian,A.H.,Armstrong,E.J.&Armstrong,A.W.2012.Principlesof pharmacology:the pathophysiologic basis of drug therapy/David E.Golan,Philadelphia:Wolters Kluwer/Lippincott Williams&Wilkins,cop.2012.

Graham,G.G.,Punt,J.,Arora,M.,Day,R.O.,Doogue,M.P.,Duong,J.K.,Furlong,T.J.,Greenfield,J.R.,Greenup,L.C.,Kirkpatrick,C.M.,Ray,J.E.,Timmins,P.&Williams,K.M.2011.Clinical pharmacokinetics of metformin.Clin Pharmacokinet,50,81-98.

Hinke,S.A.,Martens,G.A.,Cai,Y.,Finsi,J.,Heimberg,H.,Pipeleers,D.&Vande Casteele,M.2007.Methyl succinate antagonises biguanide-induced AMPK-activation and death of pancreatic beta-cells through restoration ofmitochondrial electron transfer.Br J Pharmacol,150,1031-43.

Kane,D.A.,Anderson,E.J.,Price Iii,J.W.,Woodlief,T.L.,Lin,C.-T.,Bikman,B.T.,Cortright,R.N.&Neufer,P.D.2010.Metformin selectively attenuatesmitochondrial H2O2 emission without affecting respiratory capacity inskeletal muscle of obese rats.Free Radical Bio Med,49,1082-1087.

Kirpichnikov,D.,McFarlane,S.I.&Sowers,J.R.2002.Metformin:AnUpdate.Ann Intern Med,137,25-33.

Kwong,S.C.&Brubacher,J.1998.Phenformin and lactic acidosis:a casereport and review.J Emerg Med,16,881-6.

Lalau,J.D.2010.Lactic acidosis induced by metformin:incidence,management and prevention.Drug Saf,33,727-40.

Larsen,S.,R.,Hansen,C.N.,Madsbad,S.,Helge,J.W.&Dela,F.2012.Metformin-treated patients with type 2 diabetes have normalmitochondrial complex I respiration.Diabetologia,55,443-449.

Livshits,Z.,Nelson,L.S.,Hernandez,S.H.,Smith,S.W.,Howland,M.A.&Hoffman,R.S.2010.Severe Metformin Toxicity:Role of Methylene Blue and CVVHDas Therapeutic Adjuncts.Clin Toxicol,48,611-612.

Owen,M.R.,Doran,E.&Halestrap,A.P.2000.Evidence that metformin exertsits anti-diabetic effects through inhibition of complex 1 of themitochondrial respiratory chain.Biochem J,348 Pt 3,607-14.

Pesta,D.&Gnaiger,E.2012.High-resolution respirometry:OXPHOS protocolsfor human cells and permeabilized fibers from small biopsies of humanmuscle.Methods Mol Biol,810,25-58.

Plumb,B.,Parker,A.&Wong,P.2013.Feeling blue with metformin-associatedlactic acidosis.BMJ Case Rep,2013.

Protti,A.,Fortunato,F.,Monti,M.,Vecchio,S.,Gatti,S.,Comi,G.P.,DeGiuseppe,R.&Gattinoni,L.2012a.Metformin overdose,but not lactic acidosis perse,inhibits oxygen consumption in pigs.Crit Care,16,R75.

Protti,A.,Lecchi,A.,Fortunato,F.,Artoni,A.,Greppi,N.,Vecchio,S.,Fagiolari,G.,Moggio,M.,Comi,G.P.,Mistraletti,G.,Lanticina,B.,Faraldi,L.&Gattinoni,L.2012b.Metformin overdose causes platelet mitochondrialdysfunction in humans.Crit Care,16,R180.

Protti,A.,Russo,R.,Tagliabue,P.,Vecchio,S.,Singer,M.,Rudiger,A.,Foti,G.,Rossi,A.,Mistraletti,G.&Gattinoni,L.2010.Oxygen consumption is depressedin patients with lactic acidosis due to biguanide intoxication.Crit Care,14,R22.

Regenthal,R.,Krueger,M.,Koeppel,C.&Preiss,R.1999.Drug Levels:Therapeutic and Toxic Serum/Plasma Concentrations of Common Drugs.J ClinMonit Comput,15,529-544.

Salpeter,S.R.,Greyber,E.,Pasternak,G.A.&Salpeter,E.E.2010.Risk offatal and nonfatal lactic acidosis with metformin use in type 2 diabetesmellitus.Cochrane Database Syst Rev,CD002967.

Scheen,A.J.1996.Clinical pharmacokinetics of metformin.ClinPharmacokinet,30,359-71.

Schulz,M.&Schmoldt,A.2003.Therapeutic and toxic blood concentrationsof more than 800 drugs and other xenobiotics.Pharmazie,58,447-74.

F.,Ehinger,J.K.,Marelsson,S.E.,Morota,S.,Frostner,E.A.,Uchino,H.,Lundgren,J.,Arnbjornsson,E.,Hansson,M.J.,Fellman,V.&Elmer,E.2013a.Mitochondrial respiration in human viable platelets--methodology andinfluence of gender,age and storage.Mitochondrion,13,7-14.

F.,Morota,S.,Persson,J.,Hansson,M.J.&Elmer,E.2013b.Patientswith sepsis exhibit increased mitochondrial respiratory capacity inperipheral blood immune cells.Crit Care,17,R152.

Sogame,Y.,Kitamura,A.,Yabuki,M.&Komuro,S.2009.A comparison of uptakeof metformin and phenformin mediated by hOCT1 in human hepatocytes.BiopharmDrug Dispos,30,476-84.

Tanner,R.K.,Fuller,K.L.&Ross,M.L.2010.Evaluation of three portableblood lactate analysers:Lactate Pro,Lactate Scout and Lactate Plus.Eur J ApplPhysiol,109,551-9.

Wen,Y.,Li,W.J.,Poteet,E.C.,Xie,L.K.,Tan,C.,Yan,L.J.,Ju,X.H.,Liu,R.,Qian,H.,Marvin,M.A.,Goldberg,M.S.,She,H.,Mao,Z.X.,Simpkins,J.W.&Yang,S.H.2011.Alternative Mitochondrial Electron Transfer as a Novel Strategy forNeuroprotection.J biol chem,286.

Claims (29)

1.一种用于在乳酸性酸中毒的治疗或预防中应用的琥珀酸酯前药。

2.一种用于在药物诱导的副作用的治疗或预防中应用的琥珀酸酯前药，所述药物诱导的副作用选自乳酸性酸中毒和与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用。

3.一种用于在药物诱导的副作用的治疗或预防中应用的琥珀酸酯前药，所述药物诱导的副作用选自乳酸性酸中毒和与在复合体I的有氧代谢上游中的缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用。

4.用于根据权利要求1-3中任一项所述应用的琥珀酸酯前药，其中，化合物具有式(A)或(A1)

其中R₁和R₂是相同或不同的并且选自式(B)

并且其中所述药物诱导的线粒体副作用是复合体I抑制以及其中R₃选自H、或可选取代的C₁-C₃烷基如例如甲基、乙基、丙基或异丙基以及其中R₅是–OC(＝O)R_a，其中R_a是甲基或式(C)

5.用于根据权利要求4所述应用的琥珀酸酯前药，其中R₁和R₂是相同或不同的并且选自式(B)，其中R₃是H或甲基并且R_a是甲基或式(C)。

6.一种用于根据权利要求1-4中任一项所述应用的受保护的琥珀酸酯前药，其中，化合物由式(I)给出

或其药用盐，其中在A和B之间的虚线键表示可选键从而形成闭环结构，并且其中

Z选自–CH₂-CH₂-或>CH(CH₃)，

A选自-SR、-OR和NHR，并且R是

B选自-O-R’、-NHR”、-SR”’或-OH；并且R’选自以下式(II)至(IX)：

R’、R”和R”’独立地是不同的或相同的并且选自以下式(IV-VIII)：

R₁和R₃独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基、CH₂X-酰基、F、CH₂COOH、CH₂CO₂烷基，

X选自O、NH、NR₆、S，

R₂选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、C(O)CH₃、C(O)CH₂C(O)CH₃、C(O)CH₂CH(OH)CH₃，

p是整数并且是1或2

R₆选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、或式(II)、或式(VIII)

X₅选自-H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、-C(＝O)XR₆、CONR₁R₃，或是以下式

X₇选自R₁、-NR₁R₃，

R₉选自H、Me、Et或O₂CCH₂CH₂COXR₈

R₁₀选自O酰基、NH烷基、NH酰基、或O₂CCH₂CH₂COX₆R₈

X₆选自O、NR₈、NR₆R₈，其中R₆和R₈独立地是不同的或相同的并且选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、或式(II)、或式(VIII)，

R₁₁和R₁₂独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X酰基，其中X是O、NR₆或S，

R_c和R_d独立地是不同的或相同的并且选自CH₂X烷基、CH₂X酰基，其中X＝O、NR₆或S，

R₁₃、R₁₄和R₁₅独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基；

在R13和R14或R13和R15上的取代基可以桥接以形成环体系，

R_f、R_g和R_h独立地是不同的或相同的并且选自X酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X-酰基和R₉，

烷基选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基，

酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、苯甲酰基，

酰基和/或烷基可以是可选取代的，并且

当在A和B之间存在虚线键时，根据式(I)的化合物是

其中X₄选自–COOH、-C(＝O)XR₆、

7.用于根据权利要求1-3中任一项所述应用的化合物，具有式(I)

或其药用盐，其中虚线键表示在A和B之间的可选键以形成环状结构，并且其中

Z选自–CH₂-CH₂-或>CH(CH₃)，

A和B独立地是不同或相同的并且选自-OR、-O-R’、-NHR”、-SR”’或–OH，A和B都不是–OH，其中R是

R’选自以下式(II)、(V)或(IX)：

R’、R”和R”’独立地是不同的或相同的并且选自以下式(VII)-式(VIII)：

R₁和R₃独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基、CH₂CH₂CH₂OC(＝O)CH₂CH₂COX₆R₈或

X选自O、NH、NR₆、S，

R₂选自Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、C(O)CH₃、C(O)CH₂C(O)CH₃、C(O)CH₂CH(OH)CH₃，

p是整数并且是1或2，

R₆选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、或式(II)、或式(VIII)

X₅选自-H、-COOH、-C(＝O)XR₆、CONR₁R₃或以下式之一

R₉选自H、Me、Et或O₂CCH₂CH₂COXR₈，

R₁₀选自O酰基、NH烷基、NH酰基、或O₂CCH₂CH₂COX₆R₈，

X₆是O或NR₈，并且R₈选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、或式(II)、或式(VIII)，

R₁₁和R₁₂独立地是相同或不同的并且选自H、烷基、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、乙酰基、酰基、丙酰基、苯甲酰基、酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X酰基，其中X选自O、NR₆或S，

R₁₃、R₁₄和R₁₅独立地是不同的或相同的并且选自H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、-COOH、O-酰基、O-烷基、N-酰基、N-烷基、X酰基、CH₂X烷基

R_c和R_d独立地是CH₂X烷基、CH₂X酰基，其中X＝O、NR₆或S，并且烷基是例如H、Me、Et、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基，并且酰基是例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、苯甲酰基等，

R_f、Rg和Rh独立地选自X酰基、-CH₂X烷基、-CH₂X-酰基和R₉，

烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、异戊基、己基、异己基、庚基、辛基、壬基或癸基，并且酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、苯甲酰基等，

R₂₀和R₂₁独立地是不同的或相同的并且选自H、低级烷基，即C₁-C₄烷基，或R₂₀和R₂₁可以一起形成C₄-C₇环烷基或芳族基团，上述两者均可以可选地被卤素、羟基或低级烷基取代，或

R₂₀和R₂₁可以是

CH₂X-酰基、F、CH₂COOH、CH₂CO₂烷基，并且

当在A和B之间存在环键时，所述化合物是

并且酰基和烷基可以是可选取代的。

8.一种药物和用于在药物诱导的副作用的治疗和/或预防中应用的琥珀酸酯前药的组合，所述药物诱导的副作用选自i)乳酸性酸中毒，ii)与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，和iii)与在复合体I的有氧代谢上游中的缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，其中

i)所述药物用于在所述药物所适应的疾病的治疗中使用，并且

ii)所述琥珀酸酯前药用于在由所述药物诱导或可诱导的副作用的预防或减轻中使用，其中所述副作用选自乳酸性酸中毒和与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用。

9.根据权利要求8所述的组合，其中，所述琥珀酸酯前药具有如在权利要求4-7中任一项所定义的式。

10.根据权利要求8或9所述的组合，其中，所述药物是如在本文中所定义的。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的组合，其中，所述药物是抗糖尿病物质。

12.根据权利要求8-11中任一项所述的组合，其中，所述抗糖尿病物质是二甲双胍。

13.一种包含药物和琥珀酸酯前药的组合物，其中，所述药物具有潜在的药物诱导的副作用，所述药物诱导的副作用选自i)乳酸性酸中毒，ii)与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，和iii)与在复合体I的有氧代谢上游中的缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中，所述琥珀酸酯前药用于预防或减轻由所述药物诱导或可诱导的副作用，其中所述副作用选自i)乳酸性酸中毒，ii)与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，和iii)与在复合体I的有氧代谢上游中的缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用。

15.根据权利要求13或14所述的组合物，其中，所述琥珀酸酯前药具有如在权利要求4或5中所定义的式。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的组合物，其中，所述药物是如在本文中所定义的。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的组合物，其中，所述药物是抗糖尿病物质。

18.根据权利要求13-17中任一项所述的组合物，其中，所述抗糖尿病物质是二甲双胍。

19.一种试剂盒，包括

i)包含药物的第一容器，所述药物具有潜在的药物诱导的副作用，所述药物诱导的副作用选自i)乳酸性酸中毒，ii)与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，和iii)与在复合体I的有氧代谢上游中的缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，和

ii)包含琥珀酸酯前药的第二容器，所述琥珀酸酯前药具有用于预防或减轻由所述药物诱导或可诱导的副作用的潜力，其中所述副作用选自i)乳酸性酸中毒，ii)与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，并且iii)与在复合体I的有氧代谢上游中的缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用。

20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中，所述琥珀酸酯前药具有如在权利要求4-7中任一项所定义的式。

21.根据权利要求19或20所述的试剂盒，其中，所述药物是如在本文中所定义的。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的试剂盒，其中，所述药物是抗糖尿病物质。

23.根据权利要求19-22中任一项所述的试剂盒，其中，所述抗糖尿病物质是二甲双胍。

24.一种用于治疗患有药物诱导的副作用的受试者的方法，所述药物诱导的副作用选自i)乳酸性酸中毒，ii)与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，和iii)与在复合体I的有氧代谢上游中的缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，

所述方法包括将有效量的琥珀酸酯前药给予所述受试者。

25.一种用于在受试者中预防或减轻药物诱导的副作用的方法，所述药物诱导的副作用选自i)乳酸性酸中毒，ii)与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，和iii)与在复合体I的有氧代谢上游中的缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，所述受试者患有用药物来治疗的疾病，所述药物潜在地诱导副作用，所述副作用选自i)乳酸性酸中毒，ii)与复合体I缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，和iii)与在复合体I的有氧代谢上游中的缺陷、抑制或功能障碍相关的副作用，如在克雷布斯循环的脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和脂肪酸代谢中，

所述方法包括在用所述药物进行治疗以前、期间或以后，将有效量的琥珀酸酯前药给予所述受试者。

26.根据权利要求24或25所述的方法，其中，所述琥珀酸酯前药具有如在权利要求4-7中任一项所定义的式。

27.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中，所述药物是如在本文中所定义的。

28.根据权利要求24-27中任一项所述的方法，其中，所述药物是抗糖尿病物质。

29.根据权利要求24-28中任一项所述的方法，其中，所述抗糖尿病物质是二甲双胍。