CN106244716A - 水稻强耐盐高活力基因qSE3的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻强耐盐高活力基因qSE3的分子标记及其应用。利用本发明SSR标记的引物中的一对或多对对水稻基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的DNA片段，标志着控制水稻强耐盐高活力基因qSE3增效等位基因存在。通过本发明的与强耐盐高活力基因qSE3共分离和紧密连锁的分子标记方法，可预测水稻种子萌发期耐盐性水平，能快速筛选出水稻种子萌发期耐盐性品种。

Description

水稻强耐盐高活力基因qSE3的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于种子科学与技术应用领域，涉及水稻强耐盐高活力基因qSE3的分子标记及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国重要的粮食作物之一，属淡水沼泽植物，对盐较为敏感。由于长期灌溉和施肥不当导致土壤中盐分积累，我国盐碱稻作区面积约占水稻栽培总面积的20％。同时，我国现有沿海滩涂面积3,500多万亩，每年还以一定的速度淤长。近年来，随着经济的发展，农村劳动力日益短缺，直播、机插秧水稻轻简栽培变得越来越普遍，水稻萌发期的盐害显得尤为突出；同时，水稻强耐盐品种的培育对我国盐碱滩涂地土壤的利用具有重要现实意义。

目前，多位学者利用不同RILs、DH、F_2:3等水稻作图群体，已定位了多个贡献率大于20％水稻盐胁迫相关主效QTLs。迄今，仅有一个苗期主效QTL SKC1被成功克隆。但有关水稻种子萌发期耐盐性基因克隆，以及盐胁迫下种子萌发形成正常幼苗的分子机理还未见报道。高活力种子能够形成高、壮、整齐一致的幼苗，确保作物产量与质量。通过图位克隆法已成功克隆多个与种子萌发相关基因，如：qLTG3-1、Sdr4、OsVP1、OsGA20ox1、OsFbx352及GD1等，但水稻种子耐盐萌发相关基因仍鲜有报道。因此，挖掘与利用水稻强耐盐高活力基因，对水稻强耐盐品种的培育具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供水稻种子萌发期强耐盐性筛选的分子标记方法。通过检测与水稻强耐盐高活力基因位点连锁的分子标记，可以快速筛选出优异水稻品种，提高水稻种子萌发期耐盐性筛选的可靠性、有效性；可以确定有无水稻耐盐高活力基因导入到育种品系中，提高水稻耐盐性状的选择效率、加快育种进程。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明所述的水稻耐盐高活力基因qSE3的分子标记，所述的分子标记选自jm3、jm6、jm31和jm32中的任意一种；所述的分子标记jm3上游引物为jm3L：SEQ ID NO.1，下游引物为jm3R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为116bp；所述的分子标记jm6上游引物为jm6L：SEQID NO.3，下游引物为jm6R：SEQ ID NO.4，扩增产物大小为154bp；所述的分子标记jm31上游引物为jm31L：SEQ ID NO.5，下游引物为jm31R：SEQ ID NO.6，扩增产物大小为233bp；所述的分子标记jm32上游引物为jm32L：SEQ ID NO.7，下游引物为jm32R：SEQ ID NO.8，扩增产物大小为214bp。

本发明所述的水稻耐盐高活力基因qSE3的分子标记引物，所述的分子标记jm3上游引物为jm3L：SEQ ID NO.1，下游引物为jm3R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为116bp；所述的分子标记jm6上游引物为jm6L：SEQ ID NO.3，下游引物为jm6R：SEQ ID NO.4，扩增产物大小为154bp；所述的分子标记jm31上游引物为jm31L：SEQ ID NO.5，下游引物为jm31R：SEQID NO.6，扩增产物大小为233bp；所述的分子标记jm32上游引物为jm32L：SEQ ID NO.7，下游引物为jm32R：SEQ ID NO.8，扩增产物大小为214bp。

本发明所述的分子标记在水稻种子萌发期耐盐性分子筛选中的应用。

本发明所述的分子标记引物在水稻种子萌发期耐盐性分子筛选中的应用。

水稻种子萌发期耐盐性分子筛选方法，步骤如下：

(1)取水稻叶片，提取基因组DNA。

(2)利用表1中的任意1对或1对以上分子标记引物对所述的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的DNA片段，标志着qSE3增效等位基因存在。

表1

其中，所述的PCR反应体系：体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂1.5微升，4pmol/微升引物对2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5单位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升。反应程序为DNA 95℃预变性5min；95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

利用分子标记jm3的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者韭菜青与籼稻杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出116bp的扩增片段，则标志着qSE3的韭菜青增效等位基因存在，否则扩增出105bp，则表明增效等位基因没有导入。在3368个BC₅F₃分离群体中，用交换配子数计算，此标记与耐盐高活力基因qSE3共分离的，单标记选择效率达99.9％。

利用分子标记jm6的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者韭菜青与籼稻杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出154bp的扩增片段，则标志着qSE3的韭菜青增效等位基因存在，否则扩增出141bp，则表明增效等位基因没有导入。在3368个BC₅F₃分离群体中，用交换配子数计算，此标记与耐盐高活力基因qSE3共分离的，单标记选择效率达100％。

利用分子标记jm31的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者韭菜青与籼稻杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出233bp的扩增片段，则标志着qSE3的韭菜青增效等位基因存在，否则扩增出195bp，则表明增效等位基因没有导入。在3368个BC₅F₃分离群体中，用交换配子数计算，此标记与耐盐高活力基因qSE3共分离的，单标记选择效率达100％

利用分子标记jm32的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者韭菜青与籼稻杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出214bp的扩增片段，则标志着qSE3的韭菜青增效等位基因存在，否则扩增出203bp，则表明增效等位基因没有导入。在3368个BC₅F₃分离群体中，用交换配子数计算，此标记与耐盐高活力基因qSE3共分离的，单标记选择效率达99.8％。

上述4个分子标记对qSE3的选择效率在99％以上，其中SSR标记jm6、jm31与qSE3共分离，选择准确率高，达100％。上述4个标记可以择一使用，也可以任意选择2对或2个以上标记联合使用。4个标记中任意2个分子标记组合选择，选择效率也达到100％。

本发明所提供的水稻种子萌发期耐盐性筛选的分子标记方法，具有以下优点：

(1)通过本发明开发的分子标记首次从湖流域粳稻品种韭菜青中定位了位于3号染色体长臂上的耐盐高活力基因qSE3，并获得了共分离或高度紧密连锁的分子标记jm3、jm6、jm31和jm32。

(2)通过本发明分子标记定位的水稻耐盐高活力基因qSE3的位置明确、精细，鉴定方法快速简便，选择效率高。只需要检测这些标记的扩增条带特征，就可以判断强耐盐高活力基因qSE3是否存在，以此预测水稻种子萌发期的耐盐水平，可以快速、有目的性的筛选耐盐性强的品种或品系，用于改良水稻耐盐性。这些标记与强耐盐基因qSE3共分离或高度紧密连锁，单标记选择效率达99％-100％，任意双标记选择率达100％。

(3)分子辅助育种选择目标明确，节约成本，不受环境影响。在传统育种方法中，首先要收集耐盐亲本与骨干亲本进行一系列杂交，回交，而且要等到收获种子破除休眠后，对后代进行耐盐表型鉴定从而选择单株。传统育种方法受环境影响大，可靠性低。通过本发明与耐盐高活力基因qSE3共分离和紧密连锁的分子标记方法，可预测水稻萌发期耐盐性水平，可以在种子萌发期就鉴定出耐盐单株，淘汰其它植株，可以有效控制育种规模，提高育种效率，能快速筛选出水稻种子萌发期强耐盐性品种；同时，在水稻耐盐育种群体构建时，可以快速鉴定具有耐盐高活力基因qSE3单株，大大提高选择效率，缩短育种年限，为水稻耐盐品种改良和育种服务。

附图说明

图1：两亲本韭菜青、IR26及NIL在高盐浓度胁迫下表型图

图2：qSE3在3号染色体上初定位图

图3：qSE3在3号染色体上精细定位图

图4：新开发的与qSE3紧密连锁的分子标记多态性电泳条带

具体实施方式

实施例1

(一)材料与方法：

1.材料：以强耐盐品种韭菜青为供体，盐敏感籼稻IR26为受体，通过回交和自交获取分离BC₂F₂分离群体，完成初定位；进一步构建高世代回交分离群体BC₅F₂，筛选交换株，再让交换株进行自交产生BC₅F₃群体，使其杂合片段变为纯合，结合表型进行精细定位，确定与qSE3连锁分子标记。

2.用CTAB法提取个体DNA。

3.多态标记筛选：选择1000对SSR引物，以韭菜青与IR26为模板，进行PCR扩增，筛选多态性标记。

4.PCR反应体系：体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升，4pmol/微升引物对2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5单位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升。反应程序为DNA 95℃预变性5min；95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。在biometre扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺胶(含100ml聚丙烯酰胺溶液中有7.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离。在1000对SSR引物中获得161对引物扩增产物在亲本间存在多态，用于连锁图谱构建和QTL检测。

5.种子萌发期强耐盐性QTL初位点：利用BC₂F₂分离群体种植于江浦，取样并收获成熟的种子，去杂，42℃烘干破除休眠，再保存于-20℃冰箱，以备长期使用；同时，使用上述筛选的标记与BC₂F₂分离群体构建水稻遗传图谱，鉴定每个株系在种子萌发期的耐盐性，结合软件分析进行水稻种子萌发期耐盐性QTL初步位点。

6.软件运算：所用软件为QTL IciMapping Version 4.0，最小LOD值设为2.5，步伐为1，获取连锁图谱，并进行QTL定位分析(图2)。

7.连锁标记验证与区间确定：对交换株BC₅F₃每个单株的后代进行耐盐性状鉴定，结合交换株基因型，验证连锁的分子标记，从而有效确定缩小定位区间。

(二)结果与分析

利用回交分离群体BC₂F₂的188个单株全部种植于江浦，取样，提取DNA，利用161个具有多态性标记构建遗传图谱；同时，收获成熟的种子，去杂，42℃烘干破除休眠，进行种子萌发期的耐盐性鉴定；结合表型和遗传图谱，利用软件分析在3号染色体定位一个耐盐高活力QTL qSE3，位于RM6832与RM135标记之间。

对BC₅F₂分离群体3368株分离个体表型鉴定与标记分析，在分子标记RM15456和jm3间获得14个交换株。通过目的区间纯合交换株后代种子萌发期耐盐性表型鉴定，结合其交换位点，将qSE3位点区间缩小在jm3与jm32标记之间(图3)。标记jm6和jm31与qSE3共分离，没有交换株，说明单标记对qSE3的选择效率达100％；标记jm3和jm32与qSE3交换率在1％以下，单标记对qSE3的选择效率达99％以上。

通过检测与水稻耐盐高活力基因qSE3连锁的分子标记，可以预测水稻种子萌发期耐盐性水平，可以确定有无耐盐高活力基因导入育种品系中，提高水稻耐盐性育种选择效率，加快育种进度。利用与qSE3共分离或紧密连锁的jm3、jm6、jm31和jm32进行单标记选择，选择效率可达到99％-100％，任何双标记组合选择效率均达到100％，可用于分子标记辅助选择育种。

实施例2

(一)材料与方法：

1.材料：水稻品种韭菜青与IR26。

2.用CTAB法提取个体DNA。

3.标记：jm3、jm6、jm31和jm32。

4.PCR反应体系：体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升，4pmol/微升引物对2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5单位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升。反应程序为DNA 95℃预变性5min；95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。在biometre扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺胶(含100ml聚丙烯酰胺溶液中有7.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离。

(二)结果与分析

用SSR分子标记jm3的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者IR26的基因组DNA，韭菜青能够扩增出116bp的扩增片段，标志着韭菜青中存在qSE3增效等位基因，IR26扩增出105bp，表明IR26中不存在qSE3增效等位基因。用SSR分子标记jm6的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者IR26的基因组DNA，韭菜青能够扩增出154bp的扩增片段，标志着韭菜青中存在qSE3增效等位基因，IR26扩增出141bp，标志着IR26中不存在qSE3增效等位基因。用SSR分子标记jm31的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者IR26的基因组DNA，韭菜青能够扩增出233bp的扩增片段，则标志着韭菜青中存在qSE3增效等位基因，IR26扩增出195bp，标志着IR26中不存在qSE3增效等位基因。用SSR分子标记jm32的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者IR26的基因组DNA，韭菜青能够扩增出214bp的扩增片段，标志着韭菜青中存在qSE3增效等位基因，IR26扩增出203bp，标志着IR26中不存在qSE3增效等位基因(图4，图中每种分子标记引物对应两条泳道，左边的泳道对应韭菜青，左边的泳道对应水稻品种IR26)。

Claims (9)

1.水稻强耐盐高活力基因qSE3的分子标记，其特征在于所述的分子标记选自jm3、jm6、jm31和jm32中的任意一种；所述的分子标记jm3的上游引物为jm3L：SEQ ID NO.1，下游引物为jm3R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为116bp；所述的分子标记jm6的上游引物为jm6L：SEQID NO.3，下游引物为jm6R：SEQ ID NO.4，扩增产物大小为154bp；所述的分子标记jm31的上游引物为jm31L：SEQ ID NO.5，下游引物为jm31R：SEQ ID NO.6，扩增产物大小为233bp；所述的分子标记jm32的上游引物为jm32L：SEQ ID NO.7，下游引物为jm31R：SEQ ID NO.8，扩增产物大小为214bp。

2.权利要求1所述的水稻强耐盐高活力基因qSE3的分子标记引物，其特征在于所述的分子标记jm3的上游引物为jm3L：SEQ ID NO.1，下游引物为jm3R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为116bp；所述的分子标记jm6的上游引物为jm6L：SEQ ID NO.3，下游引物为jm6R：SEQ IDNO.4，扩增产物大小为154bp；所述的分子标记jm31的上游引物为jm31L：SEQ ID NO.5，下游引物为jm31R：SEQ ID NO.6，扩增产物大小为233bp；所述的分子标记jm32的上游引物为jm32L：SEQ ID NO.7，下游引物为jm31R：SEQ ID NO.8，扩增产物大小为214bp。

3.权利要求1所述的分子标记在分子筛选种子萌发期耐盐的水稻品种中的应用。

4.权利要求2所述的分子标记引物在分子筛选种子萌发期耐盐的水稻品种中的应用。

5.筛选水稻耐盐高活力基因qSE3增效等位基因存在与否的方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)取水稻叶片，提取基因组DNA；

(2)利用权利要求2所述的分子标记引物中的任意一对、两对或三对对所述的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的DNA片段，标志着水稻耐盐高活力基因qSE3增效等位基因的存在。

6.根据权利要求5所述的水稻种子萌发期耐盐性分子筛选方法，其特征在于所述的PCR反应：体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升，4pmol/微升引物对2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5单位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升。反应程序为DNA 95℃预变性5min；95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

7.根据权利要求5所述的水稻种子萌发期耐盐性分子筛选方法，其特征在于利用分子标记jm3的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者韭菜青与籼稻杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出116bp的扩增片段，则标志着qSE3的韭菜青增效等位基因存在，否则扩增出105bp，则表明增效等位基因没有导入。

8.根据权利要求5所述的水稻种子萌发期耐盐性分子筛选方法，其特征在于利用分子标记jm6的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者韭菜青与籼稻杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出154bp的扩增片段，则标志着qSE3的韭菜青增效等位基因存在，否则扩增出141bp，则表明增效等位基因没有导入。

9.根据权利要求5所述的水稻种子萌发期耐盐性分子筛选方法，其特征在于利用分子标记jm31的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者韭菜青与籼稻杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出233bp的扩增片段，则标志着qSE3的韭菜青增效等位基因存在，否则扩增出195bp，则表明增效等位基因没有导入。