CN106237376B - 壳聚糖季铵盐基复合膜改性的钛基医用生物材料及其制备方法 - Google Patents
壳聚糖季铵盐基复合膜改性的钛基医用生物材料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及壳聚糖季铵盐基复合膜改性的钛基医用生物材料及其制备方法，包括由利用层‑层共价键接枝法交替形成于钛基医用生物材料表面的生物活性大分子层和壳聚糖季铵盐层形成的壳聚糖季铵盐基复合膜，所述层‑层共价键接枝法包括交替循环进行的共价键固定至少一种生物大分子和共价键固定壳聚糖季铵盐。本发明工艺简单、效率高、可重复性好。本发明制备的壳聚糖季铵盐及复合膜改性钛基医用生物材料具有良好的结构稳定性，在酶的作用下能够缓慢释放壳聚糖季铵盐。本发明制备的壳聚糖季铵盐基复合膜改性钛基医用生物材料不仅具有抗菌性能，还能更好地促进干细胞的粘附、增殖和成骨分化。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖季铵盐基复合膜改性的钛基医用生物材料及其制备方法，具体说，是涉及一种采用层-层共价键固定法制备的，具有抗感染和促进骨整合的壳聚糖季铵盐基复合膜改性钛基医用生物材料。属于医用生物涂层技术领域。
背景技术
理想的硬组织植入材料应当同时具有良好的骨整合能力和抗感染性能。植入物感染是骨外科手术后最严重的并发症之一。术后感染不仅延长伤口的愈合时间，还损害植入物的骨整合及使用效果。赵(Zhao，Journal of biomedical materials research Part B,Applied biomaterials 2009,91(1):470-480)提出抗菌涂层是提高内植物感染的重要手段。Badea (Badea M,Influence of Ag content on the antibacterial properties ofSiC doped hydroxyapatite coatings.Ceramics International.2016,42(1):1801-1811.)将银掺杂在羟基磷灰石涂层中。Pishbin(Pishbin F.Electrophoretic Depositionof Gentamicin-Loaded Bioactive Glass/Chitosan Composite Coatings forOrthopaedic Implants.ACS Applied Materials&Interfaces.2014,6(11):8796-8806.)将庆大霉素负载在生物活性玻璃/壳聚糖复合涂层中。然而，银和庆大霉素均会影响干细胞的成骨分化，进而影响植入体的骨整合；庆大霉素等抗生素的长期使用还会引起耐药致病菌的产生，使得硬组织感染的治疗更加复杂，其结果可能是灾难性的。
Peng(Peng Z.Quaternised chitosan coating on titanium provides a self-protective surface that prevents bacterial colonisation and implant-associated infections.RSC Advances.2015,5:54304-54311.)将壳聚糖季铵盐用于钛植入体表面改性，获得良好的抗感染表面，而该植入体的骨整合能力有待提高。
层-层共价键固定法结合了层-层技术与共价键固定法，能够在材料表面制备结构稳定的复合膜涂层。敖海勇等(敖海勇等。一种构建I型胶原-透明质酸类细胞外基质的方法。专利号：201210431868.8)用该方法制备了I型胶原/透明质酸复合膜改性钛涂层，钛基植入体的骨整合能力得到显著提高。然而，该植入体的抗感染性能尚需改善。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种技能抗感染和又能促进骨整合的壳聚糖季铵盐基复合膜改性钛基医用生物材料及其制备方法。
为了解决上述问题，本发明提供了一种壳聚糖季铵盐基复合膜改性的钛基医用生物材料，包括由利用层-层共价键接枝法交替形成于钛基医用生物材料表面的生物活性大分子层和壳聚糖季铵盐层形成的壳聚糖季铵盐基复合膜，所述层-层共价键接枝法包括交替循环进行的共价键固定至少一种生物活性大分子和共价键固定壳聚糖季铵盐。
本发明发利用生物活性大分子与壳聚糖季铵盐的共价键聚合反应和层层叠加的方式构建医用钛基壳聚糖季铵盐基复合涂层。其中，壳聚糖季铵盐为壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵等季铵盐反应合成的壳聚糖衍生物，具有良好的水溶性、广谱抗菌性能和生物相容性。与壳聚糖相比，壳聚糖季铵盐的抗菌活性更高。中等取代度的壳聚糖季铵盐不仅有着理想的抗菌活性，同时对干细胞无明显的毒副作用。壳聚糖季铵盐保留了壳聚糖分子结构中大量的氨基，能够与生物活性大分子中的羧基发生缩合反应，形成共价键结合；而生物活性大分子上的羧基和氨基亦可以与经处理后的钛基材料表面的活性基团共价键结合，因此，分子层之间以及复合膜与基体之间均能够形成稳定的结合，使得复合膜具有长期效用。该复合膜又能在体内酶的作用下缓慢降解，能够缓慢释放抗菌剂壳聚糖季铵盐，对未粘附在材料表面的细菌亦有杀灭作用。
较佳地，所述生物活性大分子涂层为胶原蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、肝素和硫酸软骨素中的至少一种。
较佳地，所述壳聚糖季铵盐为壳聚糖和季铵盐反应合成的壳聚糖衍生物，所述季铵盐包括2,3-环氧丙基三甲基氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、氯丙胺三甲基氯化铵、羟丙基三甲基氯化铵。
较佳地，所述壳聚糖季铵盐基复合膜的厚度为100～400nm。
本发明中，所述钛基医用生物材料可为钛、钛其合金以及多孔钛基医用生物材料中的一种。
本发明还提供了一种壳聚糖季铵盐基复合膜改性的钛基医用生物材料的制备方法，包括：
(1)采用强碱溶液或强酸溶液对钛基医用生物材料表面进行活化处理；
(2)利用官能团化反应在步骤(1)所得活化处理后的钛基医用生物材料的表面引入反应性基团，所述反应性基团为氨基、羧基中的一种；
(3)利用层-层共价键接枝法在步骤(2)所得表面含有反应性基团的钛基医用生物材料的表面构建壳聚糖季铵盐基复合膜。
较佳地，所述活化处理为钛基医用生物材料超声清理后在5～10M的强碱溶液中，60～80℃下反应6～12小时；或者钛基医用生物材料超声清理后在的浓硫酸/双氧水混合处理液中，反应5～15分钟。
较佳地，利用官能团化反应为硅烷化引入氨基、多巴胺交联法引入氨基、或者丙烯酸接枝法引入羧基。
较佳地，所述层-层共价键接枝法包括：交替地将钛基医用生物材料浸泡在1～3mg/ml的生物活性大分子/乙酸溶液中以及5～10mg/ml的壳聚糖季铵盐/乙酸溶液中，每次浸泡15～45分钟；如此循环3～10次，将钛基医用生物材料去离子超声清洗并真空干燥后在钛基医用生物材料表面上得到所述壳聚糖季铵盐基复合膜。
又，较佳地，所述生物活性大分子/乙酸溶液中含有浓度为2～3.5mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和浓度为0.25～0.875mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺。
又，较佳地，所述壳聚糖季铵盐/乙酸溶液中含有浓度为2～3.5mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和浓度为0.25～0.875mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺。
本发明工艺简单、效率高、可重复性好。本发明制备的壳聚糖季铵盐及复合膜改性钛基医用生物材料具有良好的结构稳定性，在酶的作用下能够缓慢释放壳聚糖季铵盐。本发明制备的壳聚糖季铵盐基复合膜改性钛基医用生物材料不仅具有抗菌性能，还能更好地促进干细胞的粘附、增殖和成骨分化。
附图说明
图1示出多孔钛涂层(TC)、经碱处理的多孔钛涂层(TC-A)、经硅烷化处理的多孔钛涂层(TC-AA)、以及I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛涂层(TC-AA(C/H/H)6)的光电子能谱图；
图2示出复合膜改性钛的原子力显微镜拓扑结构照片；
图3示出I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛涂层的胶原酶随时间降解曲线图A及壳聚糖季铵盐随时间的释放曲线图B；
图4为I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性的钛基植入体的机械稳定性的拔出实验，其中图4a中c为复合膜改性钛棒，图4a中b为复合膜改性的钛涂层棒；
图5为多孔钛涂层(TC)和I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛涂层(TC-AA(C/H/H)6)的细菌电镜照片(A为培养4小时，B为培养24小时)；
图6示出多孔钛涂层(TC)和I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛涂层(TC-AA(C/H/H)6)的细胞生物学性能，A为人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的粘附实验，B为hMSCs的增殖实验，C为hMSCs的碱性磷酸酶活性定量测定，D为hMSCs的碱性磷酸酶定性染色；
图7示出普通钛涂层组(TC+MRSA，注入MRSA，植入TC)、I型胶原/透明质酸复合膜改性钛涂层组(TC-AA(C/H)6+MRSA，注入MRSA，植入TC-AA(C/H)6)、I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛涂层组(TC-AA(C/H/H)6+MRSA，注入MRSA，植入TC-AA(C/H/H)6)以及阳性对照组(TC-AA(C/H/H)6+PBS，注入PBS，植入TC-AA(C/H/H)6)的体内抗感染性能，A为X光观察，B为Micro-CT三维重建；
图8为钛片(Ti)和透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛(Ti-(H/H)6)的抗菌性能。A为孵育6小时后的涂板计数，B为孵育24小时后的涂板计数；
图9为钛涂层(TC)和I型胶原/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛涂层(TC-(C/H)6)的抗菌性能，A为孵育6小时后的死活细菌染色激光共聚焦观察，B为孵育24小时后的死活细菌染色激光共聚焦观察。
具体实施方式
以下结合附图和实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
本发明以具有抗菌性能的壳聚糖季铵盐和具有成骨活性的生物活性大分子为原料，通过层层叠加并共价键聚合反应的方式，在钛基医用生物材料的表面构建复合膜。以下示例的说明本发明提供的壳聚糖季铵盐基复合膜改性的钛基医用生物材料的制备方法。
在钛基医用生物材料表面进行活化处理。钛基医用生物材料可为但不仅限于钛、钛其合金以及多孔钛基医用生物材料中的一种。所述活化处理可为钛基医用生物材料超声清理后在5～10M的强碱溶液中，60～80℃下反应6～12小时。或者活化处理还可为钛基医用生物材料超声清理后浓硫酸/双氧水混合处理液在(例如体积比为7：3的浓硫酸/双氧水混合处理液)中，反应5～15分钟。处理后的钛基医用生物材料种植体浸泡在超纯水中，40～60℃下水浴，以除去种植体表面的酸或碱，然后风干。
利用官能团化反应在活化处理后的钛基医用生物材料的表面引入反应性基团。利用官能团化反应可为但不局限于硅烷化引入氨基、多巴胺交联法引入氨基、或者丙烯酸接枝法引入羧基。其中，所述反应性基团包括但不局限于氨基、羧基等。反应性基团的来源包括但不局限于丙烯酸、多巴胺以及硅烷偶联剂。
上述引入反应基团的方法可为硅烷化，引入氨基。硅烷偶联剂包括但不局限于乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三叔丁基过氧硅烷、氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、乙烯基三异丙氧基硅烷等。作为一个示例，将活化的钛基植入体浸泡在浓度为5～10％的硅烷偶联剂/甲苯溶液中，溶液加热至沸腾，冷凝回流反应6～12小时。冷却后钛基植入物依次用酒精、去离子水超声清洗1～2次，每次5分钟，真空干燥。
上述引入反应基团的方法还可为多巴胺交联法，引入氨基。作为一个示例，将活化的钛基植入体浸入1～5mg/ml的多巴胺/Tris-HCl溶液中，pH值为8～9，常温下反应6～12小时。去离子水超声清洗，真空干燥。
上述引入反应基团的方法还可为丙烯酸接枝法，引入羧基。作为一个示例，配制40％丙烯酸水溶液，搅拌均匀，同时充入氩气10分钟。加入3％的硝酸铈铵酸溶液，搅拌均匀，继续充入氩气。2分钟后，将活化的钛基植入体浸泡在上述所得混合溶液中，室温下反应45分钟。反应结束后，去离子水超声清洗干净后，真空干燥。
利用层-层共价键接枝法在表面含有反应性基团的钛基医用生物材料的表面构建壳聚糖季铵盐基复合膜。所述层-层共价键接枝法包括：交替地将钛基医用生物材料浸泡生物活性大分子溶液中以及壳聚糖季铵盐溶液中。例如先将表面含有反应性基团的钛基医用生物材料浸泡在生物活性大分子/乙酸溶液。再将所得钛基医用生物材料去离子水清洗后浸泡壳聚糖季铵盐/乙酸溶液中。然而应理解，浸泡顺序不限于此，也可以先浸泡在壳聚糖季铵盐溶液中在浸泡在生物活性大分子溶液。如此循环3～10次，将钛基医用生物材料去离子超声清洗并真空干燥后在钛基医用生物材料表面上得到所述壳聚糖季铵盐基复合膜。壳聚糖季铵盐的接枝量无法测标定他们之间的比例关系对复合膜的影响不大，但若考虑到抗菌效果，壳聚糖季铵盐的量尽量多些，因此可设定生物活性大分子溶液浓度为1-3mg/ml，壳聚糖季铵盐的浓度为5-10mg/ml。其中，生物活性大分子溶液中以及壳聚糖季铵盐溶液可事先配制有缩合剂，缩合剂可选用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺。例如，生物活性大分子/乙酸溶液中可含有浓度为2～3.5mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和浓度为0.25～0.875mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺。壳聚糖季铵盐/乙酸溶液中可含有浓度为2～3.5mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和浓度为0.25～0.875mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺。
作为一个详细的示例，先将表面含有反应性基团的钛基医用生物材料浸泡在1～3mg/ml的生物活性大分子/乙酸溶液中15～45分钟。再将所得钛基医用生物材料去离子水清洗后浸泡在5～10mg/ml的壳聚糖季铵盐/乙酸溶液中15～45分钟。如此循环10次，将钛基医用生物材料去离子超声清洗并真空干燥后在钛基医用生物材料表面上得到所述壳聚糖季铵盐基复合膜。
上述生物活性大分子可为但不仅限于胶原蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、肝素和硫酸软骨素中的至少一种。生物活性大分子赋予复合膜改性钛基医用生物材料良好的成骨活性。
上述聚糖季铵盐为壳聚糖和季铵盐反应合成的壳聚糖衍生物，所述季铵盐包括但不局限于2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，十二烷基二甲基苄基氯化铵、氯丙胺三甲基氯化铵、羟丙基三甲基氯化铵。
上述壳聚糖季铵盐基复合膜的厚度可为100～400nm。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1 本发明的I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛涂层的制备及表征将等离子体喷涂多孔钛涂层(TC)浸入10M NaOH溶液中，在80℃下水浴12h，去离子水超声清洗后，60℃下热水陈化3天，每天换一次水，风干。碱处理样品标记为TC-A。将干燥的碱处理样品浸泡在浓度为10％的氨丙基三乙氧基硅烷(APS)/甲苯溶液中，溶液加热至沸腾，冷凝回流，反应12h。冷却后用无水乙醇超声清洗1次，去离子水超声清洗2次，每次3分钟，真空干燥。硅烷化样品标记为TC-AA。配制1mg/ml I型胶原/5mM乙酸溶液、1mg/ml透明质酸/5mM乙酸溶液和10mg/ml壳聚糖季铵盐/5mM乙酸溶液。往上述溶液中滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液，使得EDC最终溶度为2.5mg/ml，NHS最终溶度为0.63mg/ml。将TC-AA浸泡在I型胶原溶液中，反应30min后取出，去离子水冲洗；然后浸泡在透明质酸溶液中，反应30min后取出，去离子水冲洗；接着浸泡在壳聚糖季铵盐溶液中，反应30min后取出，去离子水冲洗；再浸泡在I型胶原溶液中，如此循环6次。去离子水清洗后，真空干燥。样品标记为TC-AA(C/H/H)6。
用光电子能谱对所得材料进行表征。图1示出多孔钛涂层(TC)、经碱处理的多孔钛涂层(TC-A)、经硅烷化处理的多孔钛涂层(TC-AA)、以及I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛涂层(TC-AA(C/H/H)6)的光电子能谱图。从图中可以看出，TC-AA(C/H/H)6图中出现了Cl2p峰，这是因为壳聚糖季铵盐的分子结构中含有氯离子。
表1 不同样品的表面元素组成
从表1中可以看出，与TC-AA相比，样品TC-AA(C/H/H)6表面的Ti、O、Na和Si元素含量减少，而C和N元素含量增加，并出现氯元素。
实施例2 I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛的制备及表征
将干净钛片(Ti)浸入5M NaOH溶液中，在60℃下水浴10h，去离子水超声清洗后，60℃下热水陈化2天，每天换一次水，风干。碱处理样品标记为Ti-A。将干燥的碱处理样品浸泡在浓度为5％的氨丙基三乙氧基硅烷(APS)/甲苯溶液中，溶液加热至沸腾，冷凝回流，反应12h。冷却后用无水乙醇超声清洗1次，去离子水超声清洗2次，每次3分钟，真空干燥。硅烷化样品标记为Ti-AA。配制1mg/ml I型胶原/5mM乙酸溶液、1mg/ml透明质酸/5mM乙酸溶液和10mg/ml壳聚糖季铵盐/5mM乙酸溶液。往上述溶液中滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液，使得EDC最终溶度为2.5mg/ml，NHS最终溶度为0.63mg/ml。将Ti-AA浸泡在I型胶原溶液中，反应30min后取出，去离子水冲洗；然后浸泡在透明质酸溶液中，反应30min后取出，去离子水冲洗；接着浸泡在壳聚糖季铵盐溶液中，反应30min后取出，去离子水冲洗；再浸泡在I型胶原溶液中，如此循环6次。去离子水清洗后，真空干燥。样品标记为Ti-AA(C/H/H)6。用原子力显微镜观察材料表面拓扑结构并测定复合膜厚度。
图2为材料表面的原子力显微镜拓扑结构。从图中可以看出，碱处理后，钛片表面产生了较尖锐的针状结构；硅烷化后，针状结构变钝；复合膜覆盖后，针状结构消逝，由一层胶状物质代替。测量结果显示，该复合膜厚度为300±100nm。
实施例3 I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜涂层的稳定性
将若干复合膜改性钛涂层样品分别浸泡在Tris-HCl溶液(pH＝7.4)和1mg/ml I型胶原酶/Tris-HCl溶液中。规定时间后取出，利用天狼猩红染色法，考察两组样品表面残留的I型胶原量；用糖蒽酮-硫酸化学反应比色法测定溶液中壳聚糖季铵盐的含量。
为了考察复合膜涂层的耐磨性能，利用上述方法将复合膜构建在钛涂层棒和钛棒表面，进行插入拔出实验，电镜下观察涂层的磨损情况。
图3为复合膜涂层的稳定性分析。图3中A为在两种溶液中浸泡后，样品表面残留的I型胶原量；A中a为Tris-HCl溶液，b为1mg/ml胶原酶/Tris-HCl溶液；B为在两种溶液中浸泡后，复合膜中的壳聚糖季铵盐的累计释放量，其中c为Tris-HCl溶液，d为1mg/ml胶原酶/Tris-HCl溶液。从图中可以看出，18天内复合膜降解了55％左右，壳聚糖季铵盐累计释放量为1.7mg左右，因此壳聚糖季铵盐的接枝量为3mg左右。复合膜涂层具有良好的固定稳定性，在酶的作用下会缓慢降解，能够缓慢释放壳聚糖季铵盐。
图4为复合膜改性钛基植入体的插入拔出实验。图4a中b为复合膜改性钛涂层棒，c为植入的复合膜改性钛棒。图4b为钛涂层棒插入部位的局部放大图，图4b1为图4b中b1部位的放大图。图c为钛棒插入部位的局部放大图，图4c1为图4c中c1部位的局部放大图，图4c2为图4c中c2局部放大图。从图中可以看出经插入拔出后，复合膜改性钛的表面只有少数地方有磨损。在磨损最厉害的图4c中c2处，钛表面仍有生物活性大分子的残留。复合膜涂层具有良好的耐磨性能。
实施例5 I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜的抗菌性能
将钛涂层及上述制备的复合膜改性钛涂层与三种致病菌(金黄色葡萄球菌ATCC25923，耐药金黄色葡萄球菌ATCC 43300，耐药表皮葡萄球菌MRSE 287)在37℃培养箱中共同培养4小时及24小时。扫描电镜观察材料表面细菌粘附和生长情况。
图5材料细菌电镜照片。图5中A为材料与细菌一起孵育4小时后的扫描电镜照片，可以看到，4小时后，三种细菌在未改性钛涂层表面均粘附很多，而在复合膜改性钛涂层表面粘附的非常少，表明壳聚糖季铵盐复合膜改性钛涂层具有良好的抗细菌粘附性能。图5中B为材料与细菌一起孵育24小时后的扫描电镜照片。可以看到，24小时后，三种细菌均在未改性钛涂层表面形成了生物膜，而复合膜改性钛涂层表面未见生物膜形成，表明该复合膜涂层能够抑制细菌生物膜形成。
实施例6 I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛涂层的细胞生物学
用人骨髓间充质干细胞(hMSCs)来考察新型改性钛涂层的生物学性能：用MTT法考察hMSCs在材料表面的粘附和增殖行为；用pNPP法对hMSCs的碱性磷酸酶(ALP)的活性进行定量测定。
图6为壳聚糖季铵盐基复合膜改性钛涂层的生物学性能。A为细胞的粘附行为；B为细胞的增殖行为；C为细胞的碱性磷酸酶活性定量测定；D为细胞的碱性磷酸酶定性染色。从图5中可知，与未改性的钛涂层相比，该复合膜改性钛涂层能够更好地促进干细胞的粘附、增殖和成骨分化。
实施例7 壳聚糖季铵盐基复合膜改性钛基植入体的动物体内抗感染性能研究
参照实施例1的方法，将壳聚糖季铵盐基复合膜固定在钛涂层棒表面，环氧乙烷灭菌。选取5月龄SD大鼠若干，麻醉、消毒以实施手术。用电钻从干骺端将动物后肢股骨扩髓后，注入104cfu的耐药金黄色葡萄球菌，而后立即植入钛基材料，并将伤口逐层严密缝合。饲养期间，定期X光观察。6周后处死动物，取出标本，经多聚甲醛处理后进行Micro-CT扫描。
图7示出普通钛涂层组(TC+MRSA，注入MSRA，植入TC)、I型胶原/透明质酸复合膜改性钛涂层组(TC-AA(C/H)6+MRSA，注入MRSA，植入TC-AA(C/H)6)、I型胶原/透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛涂层组(TC-AA(C/H/H)6+MRSA，注入MRSA，植入TC-AA(C/H/H)6)以及阳性对照组(TC-AA(C/H/H)6+PBS，注入PBS，植入TC-AA(C/H/H)6)的体内抗感染性能，A为X光观察、B为Micro-CT三维重建。从X光照片中可以看出(图7A)，植入3周时，普通钛涂层组(TC+MRSA)及不含壳聚糖季铵盐的复合膜改性钛涂层组(TC-AA(C/H)6+MRSA)均出现骨溶解及骨膜反应等感染症状，6周后还出现新骨和死骨的形成。而含有壳聚糖季铵盐的复合膜改性钛涂层组(TC-AA(C/H/H)6+MRSA)与阳性对照组(TC-AA(C/H/H)6+PBS)一样并无明显的骨感染影像学征象。Micro-CT(图7B)结果显示，两个阴性对照组(TC和TC-AA(C/H)6)的感兴趣区域均出现皮质骨被腐蚀的中空及毛刺，而实验组(TC-AA(C/H/H)6+MRSA)完好无损。表明壳聚糖季铵盐基复合膜改性钛基植入体具有良好的抗感染性能。
实施例8 本发明的透明质酸/壳聚糖季铵盐改性钛的制备及其抗菌性能
将干净的钛片(Ti)浸入浓硫酸/双氧水(体积比为7:3)混合处理液中，反应10分钟。处理后的钛片浸泡在超纯水中，60℃下水浴24小时，以除去种植体表面的酸，然后风干。将活化的钛片浸入3mg/ml的多巴胺/Tris-HCl溶液中，pH值为8，常温下反应6小时。去离子水超声清洗，真空干燥。将多巴胺改性的钛片的样品浸泡在1mg/ml透明质酸/乙酸(5mM)溶液中(含EDC 2mg/ml，NHS 0.25mg/ml)，反应25min后取出，去离子水冲洗；然后浸泡在10mg/ml壳聚糖季铵盐/乙酸(5mM)溶液中(含EDC 2mg/ml，NHS 0.25mg/ml)，反应25min后取出，去离子水冲洗；再浸泡在透明质酸溶液中，如此循环6次。反应结束后蒸馏水超声清洗，常温风干。用涂板计数法考察该改性钛(Ti-(H/H)6)的抗菌性能。经原子力显微镜检测后，可知本实施例的所得涂层的厚度为200±40nm。
图8为材料与三种细菌孵育6h(图8中A)及24h(图8中B)之后的涂板计数实验结果。如图所示，透明质酸/壳聚糖季铵盐复合膜改性钛对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、耐药金黄色葡萄球菌(ATCC43300)以及耐药表皮葡萄球菌(MRSE287)均有良好的抗细菌粘附性能，孵育6h时，抑菌率均在90％以上；孵育24g后，抑菌率能达到95％。
实施例9 本发明的I型胶原/壳聚糖季铵盐改性钛涂层的制备及其抗菌性能
将等离子体喷涂钛涂层浸入5M NaOH溶液中，在60℃下水浴12h，去离子水超声清洗后，60℃下热水陈化2天，每天换一次水，风干。配制40％丙烯酸水溶液，搅拌均匀，同时充入氩气10分钟；加入3％的硝酸铈铵酸溶液，搅拌均匀，继续充入氩气。2分钟后，将活化的钛涂层浸泡在上述所得混合溶液中，室温下反应45分钟。反应结束后，去离子水超声清洗干净后，真空干燥。将丙烯酸处理的样品浸泡在1mg/ml I型胶原/乙酸(5mM)溶液中(含EDC 3mg/ml，NHS 0.3mg/ml)，反应25min后取出，去离子水冲洗；然后浸泡在7.5mg/ml壳聚糖季铵盐/乙酸(5mM)溶液中(含EDC 3mg/ml，NHS 0.3mg/ml)，反应25min后取出，去离子水冲洗；再浸泡在I型胶原溶液中，如此循环6次。反应结束后蒸馏水超声清洗，常温风干。经原子力显微镜检测后，可知本实施例的所得涂层的厚度为150±50nm。用死活细菌染色法考察该改性钛(TC-(C/H)6)的抗菌性能。
死活细菌染色结果如图9所示。图9中A为材料与细菌共孵育6小时后死活细菌染色的激光共聚焦照片，B为材料与细菌共孵育24小时后，死活细菌染色的激光共聚焦照片。6h时(图9A)，钛涂层表面已有大量细菌定植，而粘附在复合膜改性钛涂层表面的细菌基本死亡；24h时(图9B)，三种细菌在钛涂层表面已形成生物膜，钛涂层表面的细菌大量死亡，并没有生物膜出现。结果表明I型胶原/透明质酸复合膜改性钛涂层具有良好的抗菌性能。
Claims (8)
1.一种壳聚糖季铵盐基复合膜改性的钛基医用生物材料，其特征在于，包括由利用层-层共价键接枝法交替形成于钛基医用生物材料表面的生物活性大分子层和壳聚糖季铵盐层形成的壳聚糖季铵盐基复合膜，所述层-层共价键接枝法包括交替循环进行的共价键固定至少一种生物大分子和共价键固定壳聚糖季铵盐；所述生物活性大分子为胶原蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、肝素和硫酸软骨素中的至少一种；所述壳聚糖季铵盐为壳聚糖和季铵盐反应合成的壳聚糖衍生物，所述季铵盐为2,3-环氧丙基三甲基氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、氯丙胺三甲基氯化铵、羟丙基三甲基氯化铵中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖季铵盐基复合膜改性的钛基医用生物材料，其特征在于，所述壳聚糖季铵盐基复合膜的厚度为100～400 nm。
3.一种如权利要求1或2所述壳聚糖季铵盐基复合膜改性的钛基医用生物材料的制备方法，其特征在于，包括：
（1）采用强碱溶液或强酸溶液对钛基医用生物材料表面进行活化处理；
（2）利用官能团化反应在步骤（1）所得活化处理后的钛基医用生物材料的表面引入反应性基团，所述反应性基团为氨基、羧基中的一种；
（3）利用层-层共价键接枝法在步骤（2）所得表面含有反应性基团的钛基医用生物材料的表面构建壳聚糖季铵盐基复合膜。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述活化处理为钛基医用生物材料超声清理后在5～10M的强碱溶液中，60～80℃下反应6～12小时；或者钛基医用生物材料超声清理后在浓硫酸/双氧水混合处理液中，反应5～15分钟。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，利用官能团化反应为硅烷化引入氨基、多巴胺交联法引入氨基、或者丙烯酸接枝法引入羧基。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述层-层共价键接枝法包括：
交替地将钛基医用生物材料浸泡在1～3mg/ml的生物大分子/乙酸溶液中以及5～10mg/ml的壳聚糖季铵盐/乙酸溶液中，每次浸泡15～45分钟；如此循环3～10次，将钛基医用生物材料去离子超声清洗并真空干燥后在钛基医用生物材料表面上得到所述壳聚糖季铵盐基复合膜。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述生物大分子/乙酸溶液中含有浓度为2～3.5mg/ml 的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和浓度为0.25～0.875mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖季铵盐/乙酸溶液中含有浓度为2～3.5mg/ml 的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和浓度为0.25～0.875mg/ml 的N-羟基琥珀酰亚胺。
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