CN106232621B

CN106232621B - 用于治疗癌症的168a-t2的多肽片段及包含其的组合物

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Publication number: CN106232621B
Application number: CN201580019758.2A
Authority: CN
Inventors: S·阿尔-玛穆德; S·科兰
Original assignee: Gene Signal International SA
Current assignee: Gene Signal International SA
Priority date: 2014-02-14
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2035-02-13
Also published as: EP2907823A1; US20170173106A1; JP2017506514A; AU2015216941B2; CN106232621A; JP6798886B2; EP3134428B1; WO2015121428A1; CA2939587A1; EP3134428A1; ES2744474T3; EP3546477A1; AU2015216941A1

Abstract

本发明涉及具有抗血管发生活性的特异性多肽及其用于治疗癌症的用途。

Description

用于治疗癌症的168A-T2的多肽片段及包含其的组合物

技术领域

本发明涉及与血管发生相关的疾病(angiogenesis-related disease)并且更特别地癌症和/或肿瘤的治疗领域。更特别地，本发明涉及用于治疗其中细胞表达CD9伴侣1(CD9partner 1，CD9P-1)的癌症和/或肿瘤的具有抗血管发生活性的多肽。

背景技术

血管发生相当于允许自先前存在的血管形成新血管的过程。血管发生以活化内皮细胞开始并且包括内皮细胞迁移、增殖和分化成毛细血管。尽管血管发生是生长、发育和伤口愈合中的正常且重要的过程，但是该过程还可在癌症和肿瘤的发展中起关键作用。实际上，肿瘤所释放的信号传导分子常常刺激新血管的形成，从而增强新形成的血管网络用于供应营养物质和氧并除去废产物。因此，肿瘤诱导的血管发生导致肿瘤生长并且可能导致其向远离部位转移。因此，开发抗血管发生化合物已变成癌症药物开发的主要焦点。数种靶向血管发生的化学治疗性分子已是市售可得的。其中，作为血管发生抑制剂公知的包括血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、干扰素、血小板因子4、催乳素16kDa片段、血小板反应蛋白(thrombospondin)、TIMP-1(金属蛋白酶-1的组织抑制剂)、TIMP-2和TIMP-3，以及诸如以下的其它药物：例如考布他汀A4(combrestatin A4)、EMD 121974、TNP-470、角鲨胺、沙利度胺(thalidomide)、干扰素-α、抗VEGF抗体。尽管如此，它们的效能仍然不足并且其使用常常伴随着有害的继发影响。因此，仍然需要效能提高、侵入性或毒性更低并且导致恢复速率提高的替代治疗。

WO 03/080105描述了参与调控血管发生的五种基因，并且更特别地描述了编码“168A蛋白”(还称为CD9伴侣1“CD9P-1”)的“168”基因。WO 03/080105特别地公开了168A蛋白参与血管发生的活化并且在经促血管发生因子(例如，如TNF-α)刺激的内皮细胞中表达。WO 03/080105还描述了抑制168基因的表达导致毛细血管的形成受到抑制。

WO 2008/138894公开了168A蛋白的多种截短形式，其中168A-T2蛋白对应于168A蛋白的细胞外结构域的片段。WO 2008/138894还公开了168A-T2蛋白(在下文中标识为SEQID NO:3)可以以剂量依赖性方式抑制体外人内皮细胞增殖和体外毛细血管形成二者。此外，该申请公开了168A-T2可以以剂量依赖性方式诱导抑制内皮细胞的体外迁移。根据WO2008/138894中公开的结果，168A-T2由此表现为一种高效的抗血管发生化合物，其效力是抗VEGF mAb(单克隆抗体)和/或VEGF受体(KDR)基的经鉴定肽的至少600倍多。最后，WO2008/138894公开了168A-T2蛋白具有强体内抗肿瘤活性和与其它化学治疗剂(例如，如顺铂)组合时的强协同活性。

此外，显示用GS-168AT2(168A-T2的经标记形式)处理经NCI-H460异种移植的裸鼠(Nude mice)导致急剧抑制肿瘤生长，并且导致肿瘤中CD9的体内下调(Guilmain等,2011,British Journal of Cancer,104:496-504)。

CD9是研究最多的四跨膜蛋白(tetraspanin)；已知其在多项细胞事件中发挥功能并且似乎在转移中具有关键作用，所述细胞事件包括膜融合、分化和细胞运动。临床观察结果表明CD9的下调与实体瘤的进展有关。四跨膜蛋白组成具有划定两个大小不相等的细胞外结构域的四个跨膜结构域的蛋白质的家族，所述四跨膜蛋白参与很多生理过程，包括血管发生、细胞迁移、细胞-细胞接触和融合。认为四跨膜蛋白的功能与其彼此作用以及与多种其它表面蛋白相互作用形成称为四跨膜蛋白网的分子相互作用网络的能力相关。CD9伴侣1(还称为“CD9P-1”、“FPRP”或“EWI-F”)与CD9、CD81和CD151相联系并且因此位于四跨膜蛋白网内。

还显示，CD9P-1表达是血管发生所必需的，并且GS-168AT2蛋白(CD9P-1的截短形式)剂量依赖性地抑制人内皮细胞(human endothelial cell，hEC)的增殖、迁移、体外和体外血管发生以及体内肿瘤生长。特别地提出，GS-168AT2通过下调细胞表面的CD9和CD151来发挥其在降低CD9P-1表达中的作用(Colin等,2011,British Journal of Cancer,105:1002-1011)。

显示，168A-T2在触发CD9、CD151和CD9P-1的降解中诱导跨膜蛋白网的强烈扰动。因此，有意提供特异性地仅靶向一种跨膜蛋白的治疗方案。

本发明人已令人吃惊地发现，168A-T2序列内包含的两种肽(下文中的P3和P4，其各自为SEQ ID NO:1和2)实际上各自具有抗血管发生活性。下文中提供的数据由此证明这些肽可作为主要抗肿瘤剂或者作为主要细胞毒剂的附加协同治疗用于治疗与血管发生相关的疾病，并且更特别地用于治疗癌症和/或肿瘤。令人吃惊的是，显示所述肽仅触发CD151的降解而使CD9和CD9P-1的细胞水平保持不变，从而限制由解构四跨膜蛋白网产生的有害影响(如用168A-T2所获得的)。此外，与现有技术的抗CD151抗体相反，所述肽有利地证明仅在细胞处于血管发生状态时(即，仅在细胞表达CD9P-1时)才发挥其抑制活性。因此，肽P3和P4构成迄今已知的癌症治疗的预期之外且有利的替代方案，因为其例如能够诱导内皮抑素(主要的血管发生抑制剂)的表达而无重组内皮抑素的缺点(难以大量产生、长期储存后生物活性丧失、向患者施用导致继发影响等)。

发明内容

因此，本发明涉及一种多肽，其特征在于，其包含选自在于以下的组的至少一种肽：

(i)序列GNYYCSVTPWVKS(SEQ ID NO:1)的肽；

(ii)序列IHSKPVFITVKMDVLNA(SEQ ID NO:2)的肽；以及

(iii)其功能性片段或变体或衍生物；

其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的少于50、优选少于40、优选少于30、优选少于20个连续氨基酸。

在一个实施方案中，本发明的多肽具有抗血管发生活性。

在一个具体实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:1的肽和SEQ ID NO:2的肽二者。在本发明的一个具体实施方案中，所述多肽在于SEQ ID NO:1的肽。在本发明的另一个具体实施方案中，所述多肽在于SEQ ID NO:2的肽。

在本发明的一个实施方案中，所述多肽通过添加诸如磷酸(phosphate)基团、乙酸(acetate)基团、脂质基团或碳水化合物基团的一个或更多个官能团和/或通过添加一个或更多个保护基被修饰。

在一个实施方案中，所述多肽还具有抗肿瘤活性。

本发明还涉及编码如上限定的多肽的多核苷酸。

本发明还涉及包含如上限定的多肽或多核苷酸的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物还包含至少一种药学可接受的赋形剂。

本发明还涉及包含如上限定的多肽或多核苷酸和至少一种药学可接受的赋形剂的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物还包含至少一种细胞毒剂、化学治疗剂或抗癌剂。在本发明的一个具体实施方案中，所述药物组合物还包含铂配合物，所述铂配合物选自由顺铂组成的组。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物还包含至少一种抗血管发生剂。

在一个具体实施方案中，本发明的药物组合物包含：

-含有SEQ ID NO:1的肽和SEQ ID NO:2的肽的多肽；或者

-含有SEQ ID NO:1的肽的第一多肽和含有SEQ ID NO:2的肽的第二多肽。

在一个具体实施方案中，本发明的药物组合物包含在于SEQ ID NO:1的肽的多肽。在本发明的另一个具体实施方案中，本发明的药物组合物包含在于SEQ ID NO:2的肽的多肽。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物是适于局部、全身、经口、皮下、经皮、肌内或腹膜内施用的形式。

本发明还涉及根据本发明的多肽或药物组合物，其用于治疗与血管发生相关的疾病。

在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗人体或动物体中的癌症和/或肿瘤的根据本发明的多肽或药物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗其中癌细胞表达CD9P-1的癌症和/或肿瘤的根据本发明的多肽或药物组合物。

在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗有需要的对象中的其中癌细胞表达CD9P-1的癌症和/或肿瘤的多肽或药物组合物，其中在所述治疗之前，在包含所述对象的癌细胞和/或肿瘤细胞的样品中测试CD9-P1的表达。

具体实施方式

因此，本发明涉及这样的多肽，其特征在于，所述多肽包含或在于肽序列GNYYCSVTPWVKS(P3-SEQ ID NO:1)；IHSKPVFITVKMDVLNA(P4-SEQ ID NO:2)；或者是其功能性片段或变体或衍生物；并且其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的少于50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13个连续氨基酸。

在一个实施方案中，本发明的多肽具有抗血管发生活性。

本文中使用的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或者包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽的术语“功能性片段”指SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或者包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的多肽的与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有相同功能、优选地具有SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的相同抗血管发生活性的片段。

本文中使用的术语“多肽”意指由氨基酸并且至少10、15、20、25、50、75至100个氨基酸以限定顺序连接而形成的分子。根据本发明的“分离的”多肽指已从其天然环境移出的多肽，或者指已由本领域技术人员设计而成的多肽。

在一个实施方案中，根据本发明的多肽的长度为至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90或100个氨基酸。

在一个实施方案中，本发明的多肽包含(或在于)13至50个氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含13至40个氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含(或在于)13至30个氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含(或在于)13至25、24、23、22或21个氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含(或在于)13至20个氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含(或在于)13至19、18、17、16、15或14个氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含(或在于)13个氨基酸。

在另一个实施方案中，本发明的多肽包含(或在于)17至50个氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含(或在于)17至40个氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含(或在于)17至30个氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含(或在于)17至25、24、23、22或21个氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含(或在于)17至20、19或18个氨基酸。

在本发明的一个实施方案中，所述肽具有50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13个氨基酸的长度并且包含肽序列SEQ ID NO:1，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的少于50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13个连续氨基酸。

在本发明的另一个实施方案中，所述肽具有50、40、30、25、22、20、19、18、17个氨基酸的长度并且包含肽序列SEQ ID NO:2，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的少于50、45、40、35、30、25、20、19、18、17个连续氨基酸。

在一个实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:1以及C端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸和/或N端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。

本文中使用的“氨基酸”如本领域中公知的由其全名、其三字母代码或其单字母代码来表示。肽中的氨基酸残基缩写如下：苯丙氨酸是Phe或F；亮氨酸是Leu或L；异亮氨酸是Ile或I；甲硫氨酸是Met或M；缬氨酸是VaI或V；丝氨酸是Ser或S；脯氨酸是Pro或P；苏氨酸是Thr或T；丙氨酸是Ala或A；酪氨酸是Tyr或Y；组氨酸是His或H；谷氨酰胺是Gln或Q；天冬酰胺是Asn或N；赖氨酸是Lys或K；天冬氨酸是Asp或D；谷氨酸是Glu或E；半胱氨酸是Cys或C；色氨酸是Trp或W；精氨酸是Arg或R；以及甘氨酸是Gly或G。

本文中使用的术语“氨基酸”包括天然和合成氨基酸两种，以及D和L氨基酸两种。“标准氨基酸”或“天然存在氨基酸”意指常见于天然存在肽中的二十种标准L氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸残基”意指除标准氨基酸之外的任何氨基酸，不管其是合成制备的还是来源于天然来源。例如，可用萘基丙氨酸(naphtlylalanine)替换色氨酸以促进合成。可替换的其它合成氨基酸包括但不限于L-羟丙基、L-3,4-二羟基苯基丙氨酰基、α-氨基酸(例如L-α-羟基赖氨酰基和D-α-甲基丙氨酰基、L-α-甲基丙氨酰基)、β-氨基酸和异喹啉基。

本文中使用的“氨基酸”还涵盖经化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和替换物。本发明多肽中，特别是在羧基或氨基端包含的氨基酸可通过甲基化、酰胺化、乙酰化或用其它化学基团替换而进行修饰，所述其它化学基团可改变多肽的循环半衰期而对其活性无不利影响。另外地，本发明的多肽中可存在或者不存在二硫键。

本发明的多肽可包含天然的标准氨基酸或非标准氨基酸。多肽模拟物包括具有以下修饰的多肽：i)其中一个或更多个肽基-C(O)NR-连接(键)已被诸如-CH₂-氨基甲酸酯连接(-CH₂OC(O)NR-)、膦酸酯连接、-CH_2-磺胺(-CH₂-S(O)₂NR-)连接、脲(-NHC(O)NH-)连接、-CH₂-仲胺连接的非肽基连接取代，或者被烷基化肽基连接(-C(O)NR-)(其中R是C₁-C₄烷基)取代的多肽；ii)其中N端被衍生化成-NRR¹基团、-NRC(O)R基团、-NRC(O)OR基团、-NRS(O)2R基团、-NHC(O)NHR基团的多肽，其中R和R¹是氢或C₁-C₄烷基，前提是R和R¹不同时为氢；iii)其中C端被衍生化成其中R²选自由C₁-C₄烷氧基组成的组的-C(O)R²以及其中R³和R4独立地选自由氢和C₁-C₄烷基组成的组的-NR³R⁴的多肽。

在一个实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或者其变体。在一个实施方案中，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的变体具有抗血管发生活性，优选具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之一等效的抗血管发生活性。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列相比，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的变体分别包含保守的氨基酸替换。

本文中使用的术语“保守的氨基酸替换”在本文中定义为属于以下五组之一的氨基酸交换：

I.小的脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；

II.极性的带负电荷残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

III.极性的带正电荷残基：His、Arg、Lys；

IV.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val、Cys

V.大的芳族残基：Phe、Tyr、Trp。

在另一个实施方案中，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的变体分别是与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％、优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的多肽。

在另一个实施方案中，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的变体是这样的多肽，其中分别来自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列的1、2、3、4或5个氨基酸不存在或者被任意氨基酸替换，或者其中添加1、2、3、4或5个氨基酸(连续的或不连续的)。

术语“同一性”或“相同的”当用于两种或更多种多肽的序列之间的关系时指多肽之间的序列相关性程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的串之间的匹配数目确定的。“同一性”测量两条或更多条序列中较小者之间的相同匹配的百分比，其中通过特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)处理的空位比对(如果有的话)。相关多肽的同一性可容易地通过已知的方法来计算。这样的方法包括但不限于以下中所述的那些：ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.,编辑,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编辑,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑,M.Stockton Press,New York,1991；以及Carillo等,SIAMJ.Applied Math.48,1073(1988)。用于确定同一性的优选方法设计成提供所测试序列之间的最大匹配。确定同一性的方法描述于公开可获得的计算机程序中。用于确定两条序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，其包括GAP(Devereux等,Nucl.Acid.Res.\2,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等,J.MoI.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)及其它来源(BLAST Manual,Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul等,同上)公开获得。还可使用公知的Smith Waterman算法来确定同一性。

本文中所述的多肽可通过化学合成或酶促合成来合成产生，如本领域中公知的那样。或者，可将编码本发明多肽的核苷酸序列导入蛋白质表达载体中并在合适的宿主生物体(例如，细菌、昆虫细胞等)中产生，然后纯化。出于纯化或者鉴定或纯化多肽的目的可增加另外的多肽(“标签”)。蛋白质标签使得可例如使多肽以高亲和力吸附至基质，并且然后可使基质用合适的缓冲液严格洗涤而不会使复合物以任何显著的程度洗脱，并且使吸附的复合物随后可选择性地洗脱。技术人员已知的蛋白质标签的实例是(His)₆标签、Myc标签、FLAG标签、血凝素标签、谷胱甘肽转移酶(GST)标签、具有亲和力的内含肽(intein)、几丁质结合标签或麦芽糖结合蛋白(MBP)标签。这些蛋白质标签可定位于N端、C端和/或内部。

在本发明的一个实施方案中，上述多肽通过本领域中公知的方式例如通过添加诸如磷酸基团、乙酸基团、脂质基团或碳水化合物基团的一个或更多个官能团、和/或通过添加一个或更多个保护基被修饰。

例如，可通过添加诸如磷酸基团、乙酸基团或多种脂质基团和碳水化合物的一个或更多个官能团来对所述多肽进行修饰。本发明的多肽还可作为多肽衍生物存在。术语“多肽衍生物”指具有氨基(--NH--)更具体地肽键的化合物。可将多肽视为经取代的酰胺。与酰胺基团类似，肽键也显示出高共振稳定度。肽连接中的C--N单键通常具有约40％的双键特征，并且C＝O双键具有约40％的单键特征。“保护基”是防止涉及未经保护官能团的不期望反应(例如蛋白水解)的那些基团。氨基保护基的具体实例包括：甲酰基；三氟乙酰基；苄氧基羰基；经取代的苄氧基羰基，例如(邻-或对-)氯苄氧基羰基和(邻-或对-)溴苄氧基羰基；以及脂族氧基羰基，例如叔丁氧基羰基和叔阿米氧基羰基(t-amiloxycarbonyl)。氨基酸的羧基可通过转化成酯基来进行保护。酯基包括苄基酯、经取代的苄基酯，例如甲氧基苄基酯；烷基酯，例如环己基酯、环庚基酯或叔丁基酯。胍基可通过硝基或芳基磺酰基(例如甲苯磺酰基、甲氧基苯磺酰基或均三甲苯磺酰基)来进行保护，即使其不需要保护基。咪唑的保护基包括甲苯磺酰基、苄基和二硝基苯基。色氨酸的吲哚基可通过甲酰基来进行保护或者可不保护。

多肽的修饰特别地旨在提高其体内寿命。一种类型的修饰是向多肽的N或C端添加聚乙二醇(PEG)。本领域技术人员知晓PEG具有很多使得其成为多肽的理想载体的特性，例如高水溶解度、溶液中的高迁移率和低免疫原性。这种修饰还保护多肽免受外肽酶，并且由此提高其整体的体内稳定性。

用于防止多肽被内肽酶或外肽酶降解的其它修饰包括N端修饰，例如乙酰化或糖基化；C端修饰，例如酰胺化；以及在多肽内的特定位点使用非天然氨基酸(β-氨基和α-三氟甲基氨基酸)。

增加多肽分子大小的另一替代方案是多肽与人γ免疫球蛋白的Fc结构域的遗传融合或者多肽与白蛋白的融合。

在一个具体实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO:1的肽和SEQ ID NO:2的肽二者。在一个实施方案中，本发明的多肽包含与SEQ ID NO:2的肽融合的SEQ ID NO:1的肽。在一个实施方案中，本发明的多肽包含或在于通过接头隔开的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，所述接头对应于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸的氨基酸序列。在一个实施方案中，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2以相同的方向存在于本发明的多肽中。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2以相反方向存在于本发明的多肽中。

在本发明的另一个具体实施方案中，所述多肽在于SEQ ID NO:1。在本发明的另一个具体实施方案中，所述多肽在于SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，本发明的多肽在于SEQ ID NO:1或2的肽，并且是聚乙二醇化的。

本发明的另一个目的是包含本发明的至少一种多肽的组合物。

本发明的另一个目的是包含与药学可接受的赋形剂组合的上述至少一种多肽的药物组合物。

本发明的另一个目的是包含本发明的至少一种多肽的药物。

术语“药学可接受的”指可施用于哺乳动物而无过度毒性的化合物和组合物。因此，“药学可接受的赋形剂”指当施用于动物(优选人)时不会产生不良反应、变态反应或其它不利反应的赋形剂。所述赋形剂包括任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。对于人施用，制剂应满足监管部门(例如，如FDA Office或EMA)所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。

合适的赋形剂包括水、盐水、林格溶液(Ringer’s solution)、右旋糖溶液以及乙醇、葡萄糖、蔗糖、右旋糖酐、甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇、聚乙二醇(PEG)、磷酸酯/盐、乙酸酯/盐、明胶、胶原、

植物油等的溶液。可另外地包括合适的防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、抗微生物剂和缓冲剂，例如，如BHA、BHT、柠檬酸、抗坏血酸、四环素等。

可用于本发明组合物的药学可接受的赋形剂的其它实例包括但不限于离子交换剂；氧化铝；硬脂酸铝；卵磷脂；血清蛋白，例如人血清白蛋白；缓冲物质，例如磷酸盐；甘氨酸、抗坏血酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫酸精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸脂、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物可包含一些赋形剂，例如，如表面活性剂(例如羟丙基纤维素)；合适的载体，例如，如包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适混合物和植物油(例如，如花生油和芝麻油)的溶剂和分散介质；等张剂，例如，如糖或氯化钠；包衣剂，例如，如卵磷脂；吸收延迟剂，例如，如单硬脂酸铝和明胶；防腐剂，例如，如苯扎氯胺、苄索氯铵、氯丁醇、硫柳汞等；缓冲剂，例如，如硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠和碳酸钾、乙酸钠、磷酸二氢钠等；张度剂，例如，如右旋糖酐40、右旋糖酐70、右旋糖、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠；抗氧化剂和稳定剂，例如，如亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代亚硫酸钠、硫脲等；非离子润湿剂或澄清剂，例如，如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆282和泰洛沙泊；黏度调节剂，例如，如右旋糖酐40、右旋糖酐70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、凡士林、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素；等。

在一个实施方案中，所述组合物、药物组合物或药物可包含所述多肽的药学可接受的盐。

药学可接受的盐的实例包括与无机碱的盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性或酸性氨基酸的盐等。与无机碱的盐的实例包括碱金属盐，例如钠盐和钾盐；碱土金属盐，例如钙盐和镁盐；铝盐；以及铵盐。与有机碱的盐的实例包括与三甲胺、三乙胺、吡啶、皮考啉、2,6-卢剔啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己胺和N,N’-二苄乙烯二胺的盐。与无机酸的盐的实例包括与盐酸、硼酸、硝酸、硫酸和磷酸的盐。与有机酸的盐的实例包括与甲酸、乙酸、三氟乙酸、酞酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸的盐。与碱性氨基酸的盐的实例包括与精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸的盐。与酸性氨基酸的盐的实例包括与天冬氨酸和谷氨酸的盐。合适盐的列表公开在Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,第1418页,1985中，其全部公开内容通过引用并入本文。

在一个实施方案中，所述药物、组合物或药物组合物中存在的多肽的量有效地治疗与血管发生相关的疾病，优选治疗癌症和/或肿瘤和/或易感性癌症和/或易感性肿瘤。优选地，所述多肽以按重量计0.01％至90％、优选按重量计0.1％至10％、更优选按重量计1％至5％的量存在于所述药物中或所述组合物中。这些量常规地可由本领域中能够选择向患者施用以实现恢复的最佳量的人员进行改变。

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物包含至少10mg、优选至少20mg、更优选至少50mg的上述多肽。在一个优选实施方案中，所述组合物、药物组合物或药物包含10mg至3000mg、优选50mg至2000mg、更优选100mg至1500mg的本发明多肽。

在一个具体实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物包含在于SEQ IDNO:1的肽的多肽。在本发明的另一个具体实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物包含在于SEQ ID NO:2的肽的多肽。在本发明的另一个具体实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物包含在于SEQ ID NO:1或2的肽的多肽，所述肽是聚乙二醇化的。

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物包含上述多肽，其中所述多肽包含两种肽，即SEQ ID NO:1的肽和SEQ ID NO:2的肽。

在另一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物包含两种多肽，即包含SEQ ID NO:1的肽的第一多肽和包含SEQ ID NO:2的肽的第二多肽。在另一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物包含两种多肽，即由SEQ ID NO:1的肽组成的第一多肽和由SEQ ID NO:2的肽组成的第二多肽。

在一个实施方案中，本发明的多肽是本发明的组合物、药物组合物或药物中包含的唯一活性成分。

在另一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物还包含其它活性成分，并且因此相对于所述其它活性成分，本发明的多肽可以是一种附加治疗剂。

在本发明的一个具体实施方案中，所述组合物、药物组合物或药物还包含细胞毒剂、化学治疗剂或抗癌剂。

抗癌剂的实例包括但不限于烷化剂或具有烷化作用的药剂，例如，如环磷酰胺(CTX；例如

)、苯丁酸氮芥(CHL；例如

)、顺铂(CisP；例如

)、奥沙利铂(例如ELOXATIN^TM)、白消安(例如

)、美法仑、卡氮芥(BCNU)、链脲菌素、三乙撑蜜胺(TEM)、丝裂霉素C等；抗代谢物，例如，如甲氨蝶呤(MTX)、依托泊苷(VP16；例如

)、6-巯基嘌呤(6MP)、6-硫鸟嘌呤(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(例如

)、达卡巴嗪(dacarbazine，DTIC)等；抗生素，例如，如放线菌素D、多柔比星(DXR；例如

)、柔红霉素(道诺霉素)、博莱霉素、光辉霉素等；生物碱类，例如，如长春花生物碱类，例如，如长春新碱(VCR)、长春花碱等；以及其它抗肿瘤剂，例如，如紫杉醇(例如

)及紫杉醇衍生物、细胞抑制剂、糖皮质激素类(例如，如地塞米松(DEX；例如

))和皮质类固醇类(例如，如泼尼松)、核苷酶抑制剂(例如，如羟基脲)、氨基酸消耗酶(例如，如天冬酰胺酶)、甲酰四氢叶酸、亚叶酸、雷替曲塞以及其它叶酸衍生物和类似的各种抗肿瘤剂。还可使用以下药剂作为附加剂：氨磷汀(例如

)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链佐星、环磷酰胺、洛莫司汀(lornustine)(CCNU)、多柔比星脂质体(例如

)、吉西他滨(例如

)、柔红霉素脂质体(例如

)、甲基苄肼、丝裂霉素、多西他赛(例如

)、阿地白介素、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)、氟尿苷、氟达拉滨、异环磷酰胺、依达比星、美司钠、干扰素α、干扰素β、米托蒽醌、拓扑替康、亮脯利特、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、普卡霉素(plicamycin)、米托坦、培加帕酶、喷司他丁、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨或苯丁酸氮芥。

在一个优选实施方案中，所述药物组合物还包含铂配合物。所述铂配合物可选自由顺铂、卡铂、奥沙利铂、赛特铂、吡铂、奈达铂、三铂、铂脂质体(lipoplatin)及其组合组成的组。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含根据本发明的至少一种多肽和顺铂。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含根据本发明的至少一种多肽和卡铂。

在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物包含SEQ ID NO:1的多肽(P3)和顺铂。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含SEQ ID NO:2的多肽(P4)和顺铂。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含SEQ ID NO:1的多肽(P3)、SEQ ID NO:2的多肽(P4)和顺铂。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含SEQ ID NO:1的多肽(P3)和卡铂。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含SEQ ID NO:2的多肽(P4)和卡铂。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含SEQ ID NO:1的多肽(P3)、SEQ ID NO:2的多肽(P4)和卡铂。

在本发明的另一个实施方案中，所述药物组合物还包含抗血管发生剂。抗血管发生剂的实例包括但不限于抗VEGF-A、抗VEGFR(VEGFR-1、VEGFR-2或VEGFR-3)、抗PDGFR(α或β)、抗EGFR、抗c-KIT。在一个实施方案中，所述抗血管发生剂可选自由贝伐单抗、兰尼单抗(ranibizumab)、培加他尼(pegaptanib)、VEGF-trap、阿西替尼、伊马替尼、瓦他拉尼(vatalanib)、索拉非尼(sorafenib)、司马沙尼(semaxanib)、舒尼替尼(sunitinib)、凡德他尼、血管抑素、内皮抑素、血小板反应蛋白-1及其组合组成的组。

本发明的另一个目的是上述多肽或上述药物组合物，其用于治疗人体或动物体中与血管发生相关的疾病，优选地用于治疗癌症/或肿瘤。

在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的多肽或药物组合物，其用于治疗其中癌细胞表达CD9P-1的癌症和/或肿瘤。

本文中使用的术语“治疗”包括对特定疾病或病症的预后，或者减轻与特定疾病或病症相关的症状和/或预防或消除所述症状。因此，在一个实施方案中，术语“治疗”指治疗性治疗和预防性或防止性措施；其中目的是预防或减慢(减轻)所靶向的病理性病症或疾病。有治疗需要的那些包括已经患有所述疾病的那些以及易于患有所述疾病的那些或需要在其中预防所述疾病的那些。如果在接受治疗量的根据本发明的多肽之后患者表现出以下一项或更多项的可观察和/或可测量的降低或者不存在，则对象或哺乳动物的感染得到成功“治疗”：致病性细胞的数量降低；总致病性细胞的百分比降低；和/或与特定疾病或病症相关的一种或更多种症状在一定程度上有所减轻；发病率和死亡率降低，以及生命质量问题改善。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数是通过医生熟悉的常规操作可容易地测量的。

“预后性治疗”是为降低发生与疾病相关的病理的风险而向未表现出该疾病的征兆或者仅表现出该疾病的早期征兆的对象施用的治疗。“治疗性治疗”是为减弱或消除这些征兆而向表现出病理征兆的对象施用的治疗。

化合物的“治疗有效量”是足以向施用该化合物的对象提供有益效果的化合物量。因此，在一个实施方案中，“治疗有效量”涉及用于以下的必需且充足的本发明多肽的量：减慢或停止疾病或病症的一种或更多种症状的进展、加重或恶化；减轻疾病或病症的症状；治愈疾病或病症。

本发明的另一个目的是用于治疗与血管发生相关的疾病优选癌症和/或肿瘤的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明的至少一种多肽。

在一个实施方案中，本发明的方法是用于抑制血管发生、从而治疗与血管发生相关的疾病优选癌症和/或肿瘤的方法。在另一个实施方案中，本发明的方法是用于抑制内皮细胞增殖、迁移和/或分化成毛细血管、从而治疗与血管发生相关的疾病优选癌症和/或肿瘤的方法。在另一个实施方案中，本发明的方法是用于增加内皮抑素产生、从而治疗与血管发生相关的疾病优选癌症和/或肿瘤的方法。

在另一个实施方案中，本发明的方法是用于抑制肿瘤生长和/或限制或减小肿瘤体积、从而治疗癌症和/或肿瘤的方法。在另一个实施方案中，本发明的方法是用于触发CD151的降解而使CD9、CD9P-1和CD81的细胞水平保持不变、从而治疗癌症和/或肿瘤优选其中癌细胞和/或肿瘤细胞表达CD9P-1的癌症和/或肿瘤的方法。在另一个实施方案中，本发明的方法是用于降低或抑制CD9P-1与CD9之间和/或CD9P-1与CD151之间和/或CD9与CD151之间的相互作用、从而治疗癌症和/或肿瘤优选其中癌细胞和/或肿瘤细胞表达CD9P-1的癌症和/或肿瘤的方法。

本发明的另一个目的是上述多肽、组合物、药物组合物或药物，其用于治疗，或者用于治疗与血管发生相关的疾病，优选治疗癌症和/或肿瘤。

在一个优选实施方案中，所述多肽、组合物、药物组合物或药物用于治疗其中癌细胞表达CD9P-1的癌症和/或肿瘤。在一个实施方案中，在治疗之前在包含从对象获得的癌细胞和/或肿瘤细胞的样品中测试CD9P-1的表达。

在一个实施方案中，所述多肽、组合物、药物组合物或药物用于抑制血管发生，从而治疗与血管发生相关的疾病，优选癌症和/或肿瘤。在另一个实施方案中，所述多肽、组合物、药物组合物或药物用于抑制内皮细胞增殖、迁移和/或分化成毛细血管，从而治疗与血管发生相关的疾病，优选癌症和/或肿瘤。在另一个实施方案中，所述多肽、组合物或药物用于增加内皮抑素产生，从而治疗与血管发生相关的疾病，优选癌症和/或肿瘤。

在另一个实施方案中，所述多肽、组合物、药物组合物或药物用于抑制肿瘤生长和/或限制或减小肿瘤体积，从而治疗癌症和/或肿瘤。在另一个实施方案中，所述多肽、组合物或药物用于触发CD151的降解而使CD9、CD9P-1和CD81的细胞水平保持不变，从而治疗癌症和/或肿瘤，优选其中癌细胞和/或肿瘤细胞表达CD9P-1的癌症和/或肿瘤。在另一个实施方案中，所述多肽、组合物或药物用于降低或抑制CD9P-1与CD9之间和/或CD9P-1与CD151之间和/或CD9与CD151之间的相互作用，从而治疗癌症和/或肿瘤，优选其中癌细胞和/或肿瘤细胞表达CD9P-1的癌症和/或肿瘤。

根据本发明，所述对象可以是哺乳动物，优选人。

“治疗有效剂量或治疗有效量”指足以诱导期望的生物学结果的剂量水平。所述结果可以是减轻疾病的征兆、症状或病因，或者生物系统的任何其它期望改变。优选地，该剂量或量将足以通过杀死癌细胞来减轻癌性病症，并且对导致抑制癌症生长和/或转移的效果也足够。

在一个实施方案中，本发明的方法包括施用至少10mg、优选至少20mg、更优选至少50mg的上述多肽。在一个优选实施方案中，本发明的方法包括施用10mg至3000mg、优选50mg至2000mg、更优选100mg至1500mg的本发明多肽。

在一个实施方案中，根据本发明使用的多肽、组合物、药物组合物或药物以至少10mg、优选至少20mg、更优选至少50mg的量施用。在一个优选实施方案中，根据本发明使用的多肽、组合物、药物组合物或药物以10mg至3000mg、优选50mg至2000mg、更优选100mg至1500mg的量施用。

在本发明的一个方面，根据本发明的多肽、组合物、药物组合物或药物的治疗有效量的范围为约1mg/kg/天至约50mg/kg/天、优选约3mg/kg/天至约40mg/kg/天、更优选约5mg/kg/天至约30mg/kg/天。

在一个实施方案中，根据本发明使用的多肽、组合物、药物组合物或药物每天施用一次或两次或者每周施用1次、2次、3次、4次、5次、6次。在一个具体实施方案中，根据本发明使用的多肽、组合物或药物每天施用，持续至少7天、优选至少10天、更优选至少12天。

可通过本发明的肽、组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：

心脏癌：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；

肺癌：非小细胞肺、支气管癌(鳞状细胞、未分化小细胞、未分化大细胞、腺癌)、肺泡癌(支气管癌)、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤病性错构瘤、间皮瘤；

胃肠癌：食管(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌症、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛素瘤、高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽瘤(vipoma))、小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤(Karposi’s sarcoma)、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、纤维神经瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)、结肠、结肠直肠、直肠；

生殖泌尿道癌：肾(腺癌、维尔姆斯瘤(Wihn’s tumor)[肾母细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；

肝癌：肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤；

骨癌：骨源性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤性脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨性外生骨疣(osteocartilaginous exostoses))、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨肌瘤样纤维瘤(chondromyxofibroma)、骨样骨瘤和巨细胞瘤；

神经系统癌：颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、成髓细胞瘤、胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、成视网膜细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、胶质瘤、肉瘤)；

妇科癌：子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(宫颈癌、前瘤性宫颈发育异常)、卵巢(卵巢癌[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、未分类癌症]、粒层-泡膜细胞瘤、塞-莱细胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄样肉瘤[胚胎性横纹肌肉瘤]、输卵管[癌])；

血液癌：血液(骨髓性白血病[急性和慢性]、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病(Hodgkin’sdisease)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)[恶性淋巴瘤]；

皮肤癌：恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、痣、发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕疙瘩、银屑病；以及

肾上腺癌：成神经细胞瘤。

可通过本发明的肽、组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：乳房、前列腺、结肠、结肠直肠、肺、非小细胞肺、脑、睾丸、胃、胰腺、皮肤、小肠、大肠、喉、头和颈、口、骨、肝、膀胱、肾、甲状腺和血液的癌症。

可通过本发明的肽、组合物和方法治疗的癌症包括：乳房、前列腺、结肠、卵巢、结肠直肠、肺和非小细胞肺。

可通过本发明的肽、组合物和方法治疗的癌症包括：乳房、结肠(结肠直肠)和肺(非小细胞肺)。

可通过本发明的肽、组合物和方法治疗的癌症包括：淋巴瘤和白血病。

可通过本发明的肽、组合物和方法治疗的癌症包括与血管发生相关的癌症，例如乳房癌、膀胱癌、结肠癌、口腔肿瘤、晚期肿瘤、多毛细胞白血病、黑素瘤、晚期头颈癌、转移性肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、转移性乳房癌、乳腺癌、晚期黑素瘤、胰腺癌、胃癌、成胶质细胞瘤、肺癌、卵巢、非小细胞肺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、多种实体瘤、多发性骨髓瘤、转移性前列腺癌、恶性胶质瘤、肾癌、淋巴瘤、顽固性转移性疾病、顽固性多发性骨髓瘤、宫颈癌、卡波西肉瘤、复发性间变性胶质瘤和转移性结肠癌。

优选地，可通过本发明的肽、组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：乳房癌、类癌、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胶质瘤,头颈癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌和/或尿路上皮癌。

在一个具体实施方案中，需通过本发明的肽、组合物和方法治疗的癌症是肺癌。

本发明的多肽、组合物和方法还旨在预防或降低肿瘤细胞转移。

本发明的范围内还包括治疗或预防其中涉及血管发生的疾病的方法，其包括向有此治疗需要的对象施用治疗有效量的本发明多肽。

与血管发生相关的疾病包括眼部新生血管性疾病(例如，如缺血性视网膜病、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、视网膜静脉闭塞、年龄相关性黄斑变性、角膜新血管形成、新生血管性青光眼)、动脉粥样硬化、关节炎、银屑病、肥胖和阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease)。

根据本发明，本发明的多肽可经口、局部或通过肠胃外方式施用，所述肠胃外方式包括皮下、经皮或肌内注射、植入持续释放储库、静脉内注射、鼻内施用等。

根据本发明，包含本发明多肽的组合物可以是水溶液、乳剂、乳膏剂、软膏剂、混悬剂、凝胶、脂质体混悬剂等。

在本发明的另一个实施方案中，包含本发明的至少一种多肽的组合物可与至少一种用于治疗与血管发生相关的疾病的其它活性成分(例如，如抗血管发生剂、细胞毒剂、化学治疗剂或抗癌剂)组合使用以用于提供协同活性。在本发明的一个方面，本发明的多肽或包含本发明的至少一种多肽的组合物可用作主要抗血管发生剂、细胞毒剂、化学治疗剂或抗癌剂的附加协同治疗以用于与治疗血管发生相关的疾病，并且更特别地用于治疗癌症和/或肿瘤。

“协同的”意指活性成分组合的总效果大于每种活性成分单独服用的效果。“附加协同治疗”意指使用具有提高单一治疗的治疗效果的互补性作用机制的药剂的联合治疗。

)、苯丁酸氮芥(CHL；例如

)、顺铂(CisP；例如

)、奥沙利铂(例如ELOXATIN^TM)、白消安(例如

)、达卡巴嗪(DTIC)等；抗生素，例如，如放线菌素D、多柔比星(DXR；例如

)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链佐星、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星脂质体(例如

)、吉西他滨(例如

)、柔红霉素脂质体(例如

)、甲基苄肼、丝裂霉素、多西他赛(例如

)、阿地白介素、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、10-羟基7-乙基-喜树碱(SN38)、氟尿苷、氟达拉滨、异环磷酰胺、依达比星、美司钠、干扰素α、干扰素β、米托蒽醌、拓扑替康、亮脯利特、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、普卡霉素、米托坦、培加帕酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨或苯丁酸氮芥。

上述细胞毒剂、化学治疗剂及其它抗癌剂在化学治疗方案中的使用在癌症治疗领域中进行了一般性充分表征，并且其在本文中的使用同样考虑监测耐受性和有效性以及控制施用途径和剂量，但有所调整。有效细胞毒剂的典型剂量可在生产商建议的范围之内，并且根据体外应答或动物模型中的应答的指示可降低高达约一个数量级的浓度或量。因此，实际剂量将取决于医生的判断、患者的状况和治疗方法的有效性，所述有效性基于原代培养的恶性细胞或组织培养的组织样品的体外响应，或者在合适动物模型中观察到的应答。

在一个具体实施方案中，本发明涉及的上述治疗方法还包括施用至少一种抗赘生物药物或抗肿瘤药物。

在一个具体实施方案中，本发明涉及治疗方法的包括向有治疗需要的对象施用有效量的：

-上述至少一种多肽，优选P3(SEQ ID NO:1)或P4(SEQ ID NO:2)；和

-铂配合物，

其中优选地所述有效量足以抑制癌症或肿瘤生长。

所述铂配合物可优选地选自由顺铂、卡铂、奥沙利铂、赛特铂、吡铂、奈达铂、三铂、铂脂质体及其组合组成的组。

申请人令人吃惊地发现施用在于SEQ ID NO:1的多肽和铂配合物二者显示出协同效应。

在一个实施方案中，所述多肽和所述铂配合物同时施用。在一个实施方案中，所述多肽和所述铂配合物顺序施用。优选地，所述多肽和所述铂配合物通过单独途径施用。

在本发明的治疗方法的一个具体实施方案中，测试或者已预先测试待治疗对象的表达CD9P-1的癌细胞的存在。

表达CD9P-1的癌细胞的所述鉴定可通过本领域中公知的任何方法来进行，所述方法例如，如免疫组织化学、PCR、原位杂交，使用CD9P-1特异性的引物、序列或抗体。抗CD9P-1抗体的实例是以下：SAB2700379、HPA017074(Sigma)。

本发明的一个目的是用于选择需要本发明治疗的对象的诊断试剂盒。在一个实施方案中，所述诊断试剂盒包含测量CD9P-1表达的免疫测定试剂或者引物或序列。使用CD9P-1作为伴随诊断测试的生物标志物。

本发明的另一个目的是用于在有此需要的对象中治疗癌症的方法，其包括：

-评估所述对象中表达CD9P-1的癌细胞的存在，

-如果检测到表达CD9P-1的癌细胞，则如上所述治疗所述对象。

-在治疗之前对所述对象进行伴随诊断测试，其中所述伴随诊断测试包括检测表达CD9P-1的癌细胞的存在，

-根据伴随诊断测试的阳性结果，如上所述治疗所述对象。

本发明还涉及用于在有此需要的对象中治疗其中癌细胞和/或肿瘤细胞表达CD9P-1的癌症和/或肿瘤。

将从下文的实验细节更好地理解本发明。然而，本领域技术人员将容易认识到，所讨论的具体方法和结果仅仅是举例说明本发明，如在其后的权利要求书中更充分描述的，并且不应以任何方式认为局限于此。

附图说明

图1是显示肽3和4对HUVEC增殖的剂量依赖性抑制的图。人内皮细胞增殖以由经在溶剂存在下培养的在于HUVEC的对照的增殖百分比表示；并且表示为肽浓度(以μM计)的函数。将对肽PCT(肽对照)、P3和P4获得的结果进行比较。

图2是显示肽3和4对通过经在

细胞外基质上培养的HUVEC的毛细血管网络形成的抑制的照片。毛细血管网络通过用钙黄绿素进行荧光标记用显微镜(变焦x40)来显现。示出了肽浓度为6.5μM、13μM和33μM的结果。使用溶剂作为对照。

图3是显示P3对HUVEC迁移的抑制的照片。比较在溶剂(对照)、PCT(66μM)或P3(13μM、33μM和66μM)存在下在t＝0小时和t＝20小时时在用凿尖产生的伤口上的HUVEC迁移。

图4是显示在富集有肿瘤细胞并且皮下移植在Swiss裸鼠/裸鼠中的

植入物中测量的血红蛋白水平的直方图，所述Swiss裸鼠/裸鼠用腹膜内注射肽P3、P4、P1(以10mg/kg)处理12天或者通过单独溶剂处理12天。**：p<0.01。

图5是显示肽溶剂和P3在体内对移植在Swiss裸鼠/裸鼠中的NCI-H460细胞的肿瘤生长的作用的直方图。肿瘤体积(以mm³计)表示为测试肽的函数。使用溶剂作为对照。**:p<0.01。

图6是显示在P3和/或顺铂作用之下的体内肿瘤生长抑制的直方图。处理结束时(13天)的肿瘤体积(以mm³计)表示为所接受处理的函数。PCT：对照肽；cis：顺铂；n.s.：无显著性。

图7是UMUC-3肿瘤细胞裂解液中的CD9P-1表达的Western印迹照片。上样递增量的蛋白质。泳道1：10μg；泳道2：20μg；泳道3：30μg；泳道4：40μg；泳道5：50μg；泳道6：60μg；泳道7：25μg的BT20裂解液(阳性对照)。A行的Western印迹是用抗CD9P-1单克隆抗体进行的。B行的Western印迹是用抗肌动蛋白单克隆单体进行的。

图8是显示肽P3和顺铂组合或单独施用对UMUC-3细胞的体内肿瘤生长的作用的直方图。该直方图示出了作为所接受处理的函数的处理结束时(13天)的肿瘤体积(以mm³计)的分布。使用溶剂作为对照。n.s.：无显著性；*：p<0.05。

图9A显示经与GS-168AT2孵育的HUVEC中CD9的降解的照片。列对应于在孵育1分钟、15分钟、30分钟、1小时或3小时之后用抗CD9抗体获得的Western印迹结果。

图9B是显示经与GS-168AT2孵育的HUVEC中CD9的降解的直方图。将Western印迹中对应于CD9的条带量化，相对于GAPDH归一化并以相对于经与载剂孵育的HUVEC的百分比表示。CD9的量表示为测试肽的函数。

图9C是显示经与载剂或GS-168AT2孵育的HUVEC中CD151的降解的直方图。行从上到下对应于用抗CD151抗体、抗CD81抗体和抗GAPDH抗体获得的Western印迹结果。

图9D是显示经与GS-168AT2孵育的HUVEC中CD151的降解的直方图。将Western印迹中对应于CD151的条带量化，相对于GAPDH归一化并以相对于经与载剂孵育的HUVEC的百分比表示。CD151的量表示为测试肽的函数。

图9E是显示经与GS-168AT2孵育的HUVEC中CD81的降解的直方图。将Western印迹中对应于CD81的条带量化，相对于GAPDH归一化并以相对于经与载剂孵育的HUVEC的百分比表示。CD81的量表示为测试肽的函数。

图10是显示肽P3对HUVEC中CD151、CD9、CD81、CD9P-1和整联蛋白β1链的表达的体外作用的照片。A至E行分别对应于在与33μM P3孵育(最长孵育5小时)之后用以下抗体获得的Western印迹结果：抗CD151抗体(泳道A)；抗CD9抗体(泳道B)；抗CD81抗体(泳道C)；抗CD9P-1抗体(泳道D)；抗β1整联蛋白抗体(泳道E)和抗GAPDH抗体(泳道F)。

图11A是显示在P3和P4存在下富集有NCI-H460细胞的

植入物中CD151的降解的照片。第1至3行对应于用抗CD151抗体(泳道1)、抗CD9P-1抗体(泳道2)和抗GAPDH抗体(泳道3)获得的Western印迹结果。

图11B是显示在P3和P4存在下富集有NCI-H460细胞的

植入物中CD151的降解的直方图。将Western印迹中对应于28KDa条带的CD151量化，相对于GAPDH归一化并以相对于溶剂的百分比表示。CD151的量表示为测试肽的函数。

图12A是显示当用肽3和4处理Swiss裸鼠/裸鼠时NCI-H460细胞的异种移植物中CD151的降解的照片。第1至3行对应于用抗CD151抗体(泳道1)、抗CD9P-1抗体(泳道2)和抗GAPDH抗体(泳道3)获得的Western印迹结果。

图12B是显示当用肽3和4处理Swiss裸鼠/裸鼠时NCI-H460细胞的异种移植物中CD151的降解的的直方图。将Western印迹中对应于CD151的条带量化，相对于GAPDH归一化并以相对于经单独溶剂处理小鼠的异种移植物的百分比表示。CD151的量表示为测试肽的函数。

图13是表示HUVEC中CD9-CD9P-1、CD9P-1-CD151和CD9-CD151复合物被P3解离的照片。将经与33μM P3、PCT或溶剂在EGM2-MV培养基中孵育2小时的HUVEC在brij 97缓冲液中裂解，然后用对应的抗体免疫沉淀CD81、CD9或CD151。A行：用抗CD9P-1抗体由免疫沉淀的CD81、CD9和CD151获得的Western印迹结果。B行：用抗CD9P抗体由免疫沉淀的CD81、CD9和CD151获得的Western印迹结果。C行：用抗CD151抗体由免疫沉淀的CD81、CD9和CD151获得的Western印迹结果。PCT：对照肽。IP：免疫沉淀。

图14A是显示经与P3体内孵育的HUVEC上清液中内皮抑素产生的增加的直方图。通过ELISA量化的上清液中的内皮抑素浓度(ng/mg细胞裂解液中的蛋白质表示)表示为P3浓度的函数。**：p<0.01(针对溶剂的非参数student测定)。

图14B是显示经与P3体内孵育的HUVEC上清液中内皮抑素产生的增加的照片。Western印迹结果在于相同体积的上清液中通过抗COL18A1多克隆抗体使内皮抑素免疫沉淀后获得。

图15A是显示P3诱导的体内循环内皮抑素增加的直方图。该直方图示出了作为测试肽的函数的上清液中的内皮抑素浓度(以ng/mg蛋白质计)。内皮抑素通过对在体内研究中获得的血清进行ELISA而测量。

图15B是显示P3诱导的体内循环内皮抑素增加的照片。该图像通过用抗COL18A1多克隆抗体对在体内研究中获得的血清进行Western印迹而获得。

图16是显示体外HUVEC中由P3和/或由GM6001诱导的内皮抑素产生抑制的直方图。上清液中的内皮抑素浓度(以ng/mg蛋白质计)表示为提供于细胞的处理的函数。上清液中的内皮抑素浓度通过ELISA而测量(针对溶剂的非参数student测定)。

图17是显示在抗CD151抗体存在下HUVEC上清液中内皮抑素的体内产生的直方图。上清液中的内皮抑素浓度(以ng/mg蛋白质计)表示为提供于细胞的处理的函数。上清液中的内皮抑素浓度通过ELISA而测量(针对溶剂的非参数student测定)。

图18A是显示在HUVEC中内皮抑素产生的增加与CD151消耗相联系的照片。图像对应于在用不同siRNA(siRNA FITC、siRNA CD151或siRNA CD9)处理之后用HUVEC裂解液获得的Western印迹结果。

图18B是显示在HUVEC中内皮抑素产生的增加与CD151消耗相联系的直方图。上清液中的内皮抑素浓度(以ng/mg蛋白质计)表示为提供于细胞的处理的函数。上清液中的内皮抑素浓度通过ELISA在经与siRNA孵育48小时的HUVEC上清液中而测量。

图19是显示聚乙二醇化肽P4和顺铂组合或单独施用对Calu-6细胞的体内肿瘤生长的作用的直方图。该直方图示出了作为所接受处理的函数的处理结束时(16天)的肿瘤体积(以mm³计)的分布。使用溶剂作为对照。

实施例

材料和方法

细胞培养

来自人脐带静脉的内皮细胞(HUVEC)在EGM2-MV培养基(含有5％SVF、0.4％人FGF-2、0.1％VEGF、0.1％IGF-1(第3位的精氨酸被替换成谷氨酰胺(R3-IGF-1))、0.1％EGF、0.04％氢化可的松、0.1％抗坏血酸、0.1％庆大霉素-100(gentamicine-100)的EBM2培养基)中进行培养。

NCI-H460细胞(来自非小细胞肺的人癌细胞)在补充有2.5g/L葡萄糖、10mMHEPES、1mM丙酮酸钠、10％SVF的RPMI1640培养基中进行培养。

UMUC-3细胞(人膀胱癌细胞)在补充有10％SVF、1mM丙酮酸钠和2mM谷氨酰胺的MEMNEAA培养基中进行培养。

选择肽的方法

通过GENECUST合成肽，并将其以10mg/ml(用于体外测试)和1mg/ml(用于体内测试)溶解于10％DMSO中。对照肽(PCT)(SEQ ID NO:5：NQKGCYDLVT；分子量1140Da)以与受试肽相同的终浓度使用。

细胞增殖测试

细胞增殖的评价使用4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5二苯基四唑鎓溴化物(MTT)测试来进行。在培养18小时之后，通过补充有庆大霉素和5％SVF的EBM2来更换培养基。以10μL/孔的体积添加不同浓度的肽。将细胞在37℃下孵育48小时。向细胞添加MTT(50μL/孔)，持续3小时。

毛细血管形成评价

通过Grant等(1989 Cell 58,933-943)中所述的体外血管发生测试来进行

上的毛细血管形成的评价。将

滴落在96孔板的孔上并在37℃下维持30分钟以使

凝固。然后，接种HUVEC细胞并添加5μL的肽。

然后，将板在37℃下孵育18小时，随后用钙黄绿素(calcein)溶液(50μL/孔，8μM)洗涤细胞并孵育20分钟。活着的UVEC将钙黄绿素代谢成绿色荧光组分。

遵循伤口测试的迁移测试

根据伤口测试来评价细胞的迁移(Sato和Rifkin 1988J Cell Biol 107,1199-1205)。将HUVEC在EGM2-MV培养基中培养至汇合。使用软件“Analysis”(Soft ImagingSystem Gmbh Digital,Olympus)来测量伤口的宽度。然后，向培养基添加待测试的肽。

体内血管发生测试

的植入物表示血管发生的体内模型。使用NCI-H460细胞来提供在

基质中进行血管形成所必需的生长因子。然后，将混合物皮下注入Swiss nu/nu小鼠中。通过腹膜内注射来进行肽(1mg/mL)的日处理。12天后收集植入物。

植入物中的血红蛋白水平量化

使用植入物中血红蛋白的剂量作为植入物的血管的指示。将植入物称重并破碎。

体内肿瘤生长测试

将5至6周龄的Swiss nu/nu雌性小鼠用甲苯噻嗪(12mg/kg)和氯胺酮(80mg/kg)麻醉。将肿瘤细胞(NCI-H460或UMUC-3)皮下植入在小鼠胁中。当在接种10天后肿瘤达到100mm³时，将动物随机分配并通过每隔一天地腹膜内注射肽、顺铂持续13天来进行处理。测量肿瘤大小并计算肿瘤体积。对小鼠称重以检查疼痛的症状。

四跨膜蛋白表达的阻抑

使用转染剂GENJET根据生产商的说明来用siRNA转染HUVEC。在孵育48小时之后，收集上清液，通过western印迹来测试蛋白质表达并量化内皮抑素。

通过以下实施例对本发明进行进一步举例说明。

实施例1：P3和P4对HUVEC增殖的剂量依赖性抑制

将细胞在EGM2-MV中培养48小时，并通过MTT测定量化增殖。结果示于图1中，并且表示为相对于经在溶剂存在下培养的HUVEC的细胞增殖百分比。

测试3种肽对HUVEC增殖的作用。如同PCT(SEQ ID NO:5：NQKGCYDLVT)，观察到P1(SEQ ID NO:4：VSWFAVHSFGLDKAPVLLSS)对增殖无作用(结果未示出)。

相反，肽3(P3–SEQ ID NO:1)以剂量依赖性方式抑制HUVEC增殖(图1)。在66μM时，P3使HUVEC增殖抑制50％±1.2％(p<0.001；n＝3)。在264μM时，在P3条件下的增殖为27.3％±0.3％(p<0.0011，相对于PCT；n＝3)。用肽4(P4–SEQ ID NO:2)进行测试显示直至浓度为66μM，HUVEC增殖被抑制20％(图1)。在浓度为132μM时，P4使对HUVEC增殖的抑制增强26％±1.75％(p＝0.0121相对于PCT；n＝3)。

实施例2：通过经在

上培养的HUVEC的毛细血管网络形成的P3和P4抑制

在接种细胞之后，向培养基(EGM2-MV)添加6.5μM、13μM和33μM浓度的肽。将板在37℃下孵育18小时。通过添加钙黄绿素来实现荧光标记。用装备有照相机(变焦x40)的荧光显微镜来拍摄照片。结果示于图2中。

所观察到的网络结构的形成在溶剂存在下是自然的。PCT的添加对通过HUVEC的毛细血管形成无作用(图2)。与之相对，P3增强毛细血管长度和接点数目二者的剂量依赖性降低，说明有显著的体外抗血管发生活性(图2)。P4也显示出毛细血管长度和接点数目二者的显著降低，说明有显著的体外抗血管发生活性。

实施例3：HUVEC的P3依赖性迁移抑制

用凿尖在细胞层上产生伤口。通过伤口测定来评价在添加肽之后的HUVEC迁移，并在培养20小时之后分析HUVEC向前迁移的进展。结果显示，添加有溶剂或PCT的伤口在孵育20小时之后完全闭合。用装备有照相机(变焦x40)的显微镜来拍摄照片。将细胞与13μM P3孵育，观察到瘢痕的部分抑制。在33μM时，P3似乎完全阻止HUVEC迁移并且向前迁移的进展受到显著抑制或者几乎停止(图3)。

实施例4：P3和P4对体内肿瘤生长的作用

利用如Passaniti等(1992Experimental gerontology 27,559-566)中所述的体内血管发生模型来评价P3和P4的作用。简言之，将癌细胞并入到

中，癌细胞提供血管形成所必需的生长因子和血管发生因子。立即将该混合物以皮下形式注射到小鼠肋。在接种后第二天，将20只小鼠(Swiss nu-nu)随机分成4组，每组包括5只小鼠，并如下开始处理：组1的小鼠通过200μL/注射/天的单独溶剂，持续连续12天来进行处理；组2的小鼠通过200μL/注射在溶剂/注射/天中的P1溶液(1mg/mL)，持续连续12天来进行处理；组3的小鼠通过200μL在溶剂/注射/天中的P3溶液(1mg/mL)，持续连续12天来进行处理；组4的小鼠通过200μL在溶剂/注射/天中的P4溶液(1mg/mL)，持续连续12天来进行处理。

在第13天将小鼠处死，收集植入物并检测。结果显示，组1(仅具有溶剂的对照小鼠)和组2(具有10mg/kg P1的小鼠)的植入物的特征为红色，而从组3(具有10mg/kg P3的小鼠)和组4(具有10mg/kg P4的小鼠)收集的植入物的特征为黄色带有一些红点，表明体内血管发生受到抑制。使用植入物中血红蛋白的剂量来量化血液并由此评价植入物中功能性血管的密度。对经P3和P4处理的植入物的分析显示，与组1相比，这些肽引起血红蛋白量被抑制67.2±6.5％(p＝0.0012)和29.2±8.4％(p＝0.0029)(图4)。这些结果证明，P3和P4表现出抗血管发生特性。

实施例5：P3对肿瘤生长的作用-NCI-H460模型

评价该肽对体内肿瘤生长的作用。将癌细胞NCI-H460通过皮下施用来注射在Swiss nu/nu小鼠胁中(n＝20)。在接种肿瘤细胞后10天，将小鼠随机分成2组，每组5只小鼠。如下处理不同组的小鼠：组1的小鼠用溶剂进行处理(200μL/注射/48小时)；组2的小鼠用P3进行处理(200μL在溶剂中的1mg/mL P3/注射/48小时)。所有的处理都通过腹膜内注射，持续连续13天来进行。

在处理13天之后，结果显示经溶剂处理的肿瘤的平均肿瘤体积为1560±188.3mm³(n＝5)(p＝0.2625；n＝5)(图5)。相反地，经P3处理的肿瘤的平均肿瘤体积为651.5±80.97mm³(p＝0.005；n＝5)(图5)，表明体内肿瘤生长被抑制64.79±4.37％(p<0.05)。

并行地，为了研究经测试的肽对小鼠的毒性作用，随着处理测量小鼠体重。如表1中所示，观察到体重无显著改变。

表1：处理开始时(第0天)和结束时(第13天)小鼠的平均体重，以及在通过溶剂和P3进行处理期间小鼠的体重差异％。

实施例6：P3和顺铂效应对肿瘤生长的组合作用

为了比较P3与GS-168AT2的生物活性，进行P3单独或与顺铂组合的体内抗肿瘤活性的研究。

接种NCI-H460细胞(肿瘤体积为100mm³至150mm³)，将小鼠(n＝35)随机分成7组，每组包括5只小鼠。如下处理不同组的小鼠：组1用溶剂进行处理(200μL/注射/48小时)；组2的小鼠用顺铂(5mg/kg)进行处理。组3的小鼠用P3(10mg/kg)进行处理；组4的小鼠用P3(10mg/kg)和顺铂(5mg/kg)交替处理；组5的小鼠用顺铂(2.5mg/kg)进行处理；组6的小鼠用P3(10mg/kg)和顺铂(2.5mg/kg)交替处理；组7的小鼠用P3(10mg/kg)和顺铂(1mg/kg)交替处理。所有的处理都通过腹膜内注射，持续连续13天来进行。

结果指出，通过P3(10mg/kg)的单一治疗显示出与顺铂(5mg/kg)的单一治疗接近或类似的治疗效力。经P3处理的组的平均肿瘤体积为约651.5±80.9mm³(p＝0.0013；n＝5)，而对照组的平均肿瘤体积为1698±164.9mm³(n＝5)，表明用单独的P3进行处理引起体内肿瘤生长被抑制61.61±4.74％(p<0.05；n＝5)(图6)。经单独顺铂(5mg/kg)处理的小鼠的平均肿瘤体积为626±118.5mm³(p＝0.0019；n＝5)，表明该处理引起与P3作用类似的肿瘤生长抑制(图6)。顺铂(5mg/kg)和P3(10mg/kg)每日交替的双治疗的作用显示经该双治疗处理的组的平均肿瘤体积为551.9±122.4mm³(p＝0.0012；n＝5)。因此，该双治疗使体内肿瘤生长抑制69.85±7.2％(p<0.05；n＝5)。

降低在单一治疗或者与P3(10mg/kg)每日交替的双治疗中施用的顺铂的剂量(2.5mg/kg，然后是1mg/kg)。目的是维持治疗效力而同时限制用5mg/kg剂量的顺铂所观察到的潜在系统性效应或者基于化学治疗剂剂量的最终抗性机制。顺铂(2.5mg/kg)的半剂量减少增强抗肿瘤效力的降低(平均肿瘤体积为1017±119.8mm³；p＝0.011；n＝5)。然而，通过用顺铂(2.5mg/kg)和P3(10mg/kg)或者顺铂(1mg/kg)和P3(10mg/kg)每日交替的双治疗进行治疗维持治疗效力，其中肿瘤体积平均值分别为318.7±103.3mm³(p＝0.0004；n＝5)和265.4±72.1mm³(p＝0.0002；n＝5)(图6)。

此外，经顺铂(5mg/kg)处理的小鼠表现出20±7％的显著体重减轻(p＝0.0159，与对照相比；n＝5)或者经顺铂(5mg/kg)与P3(10mg/kg)交替处理的小鼠表现出18±11％显著体重减轻(p＝0.079，与对照相比；n＝5)。顺铂剂量的减半(2.5mg/kg)使体重减轻6±3％。经顺铂(2.5mg/kg)和P3(10mg/kg)交替处理的小鼠的体重变化为-7±1％。顺铂剂量的减少(1mg/kg)未增强任何体重变化，如表2中所述。

表2：处理开始时(第0天)和结束时(第13天)小鼠的平均体重，以及在通过P3和/或顺铂进行处理期间小鼠的体重差异％。

实施例7：P3对肿瘤生长的作用-UMUC模型-证明CD9P-1依赖性

P3来源于CD9P-1。为了检测P3是否与CD9P-1相互作用，在不表达CD9P-1的肿瘤细胞系上测试P3。在筛选测定中鉴定UMUC-3细胞系(膀胱肿瘤细胞系)为不表达CD9P-1的细胞系。通过western印迹分析的递增量的UMUC-3裂解液(10μg至60μg)显示这些细胞不表达CD9P-1(图7A)。

然后，在UMUC-3异种移植物的体内模型中测试P3对肿瘤生长的作用。将UMUC-3细胞接种10天(肿瘤体积为100mm³至150mm³)，将小鼠(n＝20)随机分成4组，每组包括5只小鼠。如下处理不同组：组1的小鼠用溶剂进行处理(200μL/注射/48小时)；组2的小鼠用顺铂(2.5mg/kg)进行处理；组3的小鼠用P3(10mg/kg)进行处理；组4的小鼠用顺铂(2.5mg/kg)和P3(10mg/kg)交替处理。与经溶剂处理的小鼠的肿瘤体积相比，经P3处理的小鼠的肿瘤体积未显著改变(图8)，这表明P3不影响不表达CD9P-1的肿瘤的肿瘤生长。然而，在顺铂(2.5mg/kg)的处理之下，这些肿瘤减小(图8)。

实施例8：P3对四跨膜蛋白的作用

现有技术已经证明，GS-168AT2与CD9相关、与CD151相关并且更弱地与CD81相关。然后，在GS-168AT2存在下随时间评估CD9、CD151和CD81的状态(Colin等2011Br J Cancer105,1002-1011)。将HUVEC与GS-168AT2(40μg/mL)孵育，然后裂解，并用抗CD9抗体、抗CD151抗体和抗CD81抗体对细胞裂解液进行western印迹。结果显示，在处理1小时之后，GS-168AT2诱导CD9和CD151的降解(图9A和C)。为了作进一步研究，还通过FACS来分析经与GS-168AT2孵育的HUVEC。结果显示，相对于对照，在GS-168AT2存在下细胞表面上CD9和CD151的量随时间显著降低，其分别为降低约40％(P<0.05；图9B)和降低约70％(P<0.01；图9D)。然而，观察到在细胞暴露于GS-168AT2之后CD81状态未显著改变(图9C和9E)。CD9和CD151的降解降低CD9与CD181、CD9与CD151以及CD81与CD9P-1之间的相互作用。然后，在不同的体外和体内细胞模型上用P3研究到类似的机制。

在内皮细胞上进行P3对四跨膜蛋白(CD9、CD81和CD151)和整联蛋白β1的体外作用。在不同的时间点，将HUVEC与P3(33μM)孵育。P3从孵育2小时开始诱导CD151显著降低(图10A)。然而，CD9(图10B)、CD81(图10C)和CD9P-1(图10D)以及整联蛋白β1(图10D)的表达均不受P3影响。

在对富集有NCI-H460的

植入物的匀浆的western印迹上分析CD151和CD9P-1表达。CD151谱在western印迹上表征为2条带；28kDa处的一条带对应于CD151，而26kDa处的另一条带对应于CD151的降解产物。结果显示，在经P3和P4(10mg/kg)处理12天的小鼠的裂解液中CD151显著降低(图11A-1)。然而，CD9P-1水平未改变(图11A-2)。量化对应于CD151的条带显示(图11B)，对应于经P3和P4处理小鼠的裂解液中的CD151的条带降低57％和51％。

在来自经P3或P4(10mg/kg)每隔一天地处理13天的小鼠的异种移植物NCI-H460细胞的裂解液中，观察到与经溶剂处理的小鼠相比，CD151水平分别降低73％和50％(图12A和12B)。观察到CD9P-1未改变(图12A)。

为了更精确地研究P3对四跨膜蛋白CD9、CD81和CD151其之间以及与CD9P-1的联系的作用，进行免疫沉淀(IP)实验。在对照实验(使用溶剂)中，用CD9和CD81共沉淀CD9P-1。在P3和CD151之间观察到弱共沉淀。四跨膜蛋白与CD9P-1之间的联系在PCT条件下未改变。然而，当将HUVEC与33μM P3孵育2小时时，CD9P-1与CD9之间以及CD9P-1与CD151之间的相互作用降低。P3未改变CD9P-1和CD81之间的联系(图13A)。

在对照实验(使用溶剂)中，CD9与CD151之间以及CD9与CD81之间的联系类似。添加P3引起CD9与CD151之间而非CD9与CD81之间的联系降低(图13B)。添加P3引起复合物CD151-CD9而非复合物CD151-CD81解离(图13C)。

实施例9：在体外和体内模型中P3对内皮抑素产生的作用

内皮抑素是胶原XVIII的片段(O’Reilly等1997Cell 88,277-285)并且是血管发生的有名抑制剂。此外，GS-168AT2诱导内皮抑素的体内和体外产生，因此提出涉及来源于GS-168AT2的P3影响该活性的能力的问题。

通过ELISA对经在升高浓度的P3或PCT下孵育48小时的HUVEC的裂解液量化内皮抑素水平。与溶剂条件相比，PCT未改变内皮抑素的水平，然而在33μM和66μM P3下分别观察到33％和62％的内皮抑素产生增加(图14A)。

由于内皮抑素产生于胶原XVIII，抗体可检测内皮抑素和胶原XVIII二者。然后，进行IP以确定通过ELISA的剂量归因于内皮抑素(图14B)。

为了研究P3对体内内皮抑素产生的作用，通过ELISA和western印迹来分析来自具有肿瘤细胞NCI-H460的异种移植小鼠的血清。与经溶剂处理的小鼠相比，在经P3(10mg/kg)处理的小鼠的血清中观察到24％的增加(图15A)。通过western印迹观察到数种形式的内皮抑素。通过western印迹的血清分析确定经P3处理小鼠的血清中内皮抑素水平增加，并且大小为约28kDa(图15B)。

为了评价金属蛋白酶(MMP)在内皮抑素产生中的作用，使用MMP的多价抑制剂，GM6001。上清液中内皮抑素的浓度为6.2ng/mg裂解液的蛋白质/48小时。与对照相比，用MMP的抑制剂观察到内皮抑素显著减少约30％(4.4ng/mg裂解液的蛋白质/48小时)。观察到在33μM P3下内皮抑素水平增加10％(6.85ng/mg裂解液的蛋白质/48小时)，在66μM P3下内皮抑素水平增加46％(8.48ng/mg裂解液的蛋白质/48小时)。在添加P3前45分钟添加MMP的抑制剂，观察到与对照相比内皮抑素水平显著降低30％(图16)。GM6001抑制由P3诱导的内皮抑素产生。那么，MMP可能参与由P3诱导的内皮抑素产生。

前述结果表明，CD151的体外和体内减少以及内皮抑素的体外和体内增加由P3诱导。这提出了关于内皮抑素产生与CD151降低之间的联系的问题。因此，使CD151消耗并确定上清液中的内皮抑素水平。为此，使用抗CD151抗体和特异性地针对编码CD151的mRNA的小干扰RNA(pRNAi或siRNA)来阻抑CD151表达。

将HUVEC与抗CD151抗体(11G5a)或不相关抗体(不能够识别任何蛋白质的阴性对照)在EGM2-MV培养基中孵育48小时。然后，通过ELISA在上清液中测量内皮抑素水平。与将HUVEC细胞单独培养时的内皮抑素基线产生相比，当将HUVEC与抗CD151抗体(11G5a)孵育时观察到增加33％(图17)。

用CD151和CD9的特异性siRNA转染HUVEC细胞。在western印迹中分析蛋白质表达。并行地，通过ELISA在上清液中测量内皮抑素水平。经CD151和CD9特异性的siRNA转染的HUVEC阻抑其各自的表达(图18A)。测量经siRNA转染的HUVEC细胞的上清液中内皮抑素的水平。在对照和CD9表达阻抑之间未观察到变化(分别为1.26ng/mg裂解液的蛋白质/48小时和2ng/mg裂解液的蛋白质/48小时)。相反，在CD151消耗的HUVEC中内皮抑素水平增加为9.4ng/mg裂解液的蛋白质/48小时(图18B)。因此，CD151参与内皮抑素的产生。

实施例10：聚乙二醇化肽4对肿瘤体积的作用

所有的实验均由Genopole机构动物照管及使用委员会(Genopole’sinstitutional animal care and use committee)审查并根据机构动物照管指导方针(institutional guidelines for animal care)来进行。使用5至6周龄的雌性BALB/c nu/nu小鼠(n＝24)。用14小时光照/10小时黑暗方案在无病原体条件下将动物圈养在层气流柜内，并随意地饲喂经高压灭菌的标准食物和水。将Calu-6细胞(200μl无血清RPMI中的5x10⁶细胞)皮下注射到小鼠的右胁中。在异种移植(10天)之后，测量肿瘤体积(TV)(Balsari等,Eur J Cancer.2004May；40(8):1275-81)，将动物随机化并分成四组，每组六只动物，通过每隔一天地腹膜内(i.p.)注射(200μl/注射)持续16天(八次注射)来进行处理。使对照小鼠(组1)接受载剂(0.9％盐水)。将顺-二氯二氨合铂II(CDDP；Sigma)以0.5mg/ml溶解在0.9％盐水中并以5mg/kg的剂量注射(组2)。将聚乙二醇化肽4(P4-PEG)以1mg/ml溶解在载剂中并以10mg/kg的剂量注射(组3)。在组4中，使小鼠接受CDDP和P4-PEG二者。在治疗期(16天)内，每隔一天测量肿瘤体积和体重。

在经单独CDDP、单独P4-PEG以及CDDP和P4-PEG二者处理的小鼠中观察到肿瘤体积显著减小，因此，P4-PEG具有显著的抗肿瘤作用。