CN106226448A - 一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，步骤为：(1)选取不同时间点的细胞培养上清液，分别平行加入内标并进行前处理，得到不同时间点进样样品；(2)将所得进样样品采用超高效液相色谱和三重四级杆质谱联用仪进行分析，得到不同时间点的色谱图；(3)根据所得不同时间点的色谱图，绘制得到每种化合物在细胞培养过程中随时间的含量变化趋势图。本发明仅用一套仪器系统即可同时测定细胞培养上清液中多种化合物的含量变化，一个样品分析仅需17min，并且前处理方便，分析效率高、操作简单，适用性强，可用于不同细胞培养上清液中多种化合物的快速检测，包括微生物细胞、哺乳动物细胞等。

Description

一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域，特别涉及一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法。
背景技术
开发合适的培养基配方与优化细胞培养条件是生物技术药物生产工艺的核心内容之一。适宜的培养基组成与优化的细胞培养条件对于提高蛋白药物的产率，保证产品批次之间的一致性、稳定关键质量属性等因素至关重要，尤其是抗体药物偶联物、双靶点/特异抗体类药物、抗体片段融合蛋白等相对分子量大、结构复杂的抗体类药物，对其重要性不言而喻。
目前生物过程工艺开发与优化偏重于检测常规的温度、搅拌、气体溶解量和OD值等理化条件以及少数培养成分与代谢物的变化，缺乏对于细胞上清液组分直接、全面和快速的客观动态数据分析，因此无法精准优化调整细胞培养工艺条件和培养基中各组分配比。
随着近年分析仪器的日益发展，已有很多分析仪器应用于细胞培养上清液组分的分析，但是一种分析仪器只能单一的检测某一类或者某几个细胞上清液组分，如果要实现多类组分的全面同时检测，则需要不同的仪器，并且花费大量的人力物力。例如，检测氨基酸需要先做衍生，然后再用液相色谱仪器检测；检测糖和维生素则需要用不同的比色法，花费大量时间；有些仪器可同时检测糖和氨基酸，仅限于几种化合物而已。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术中的不足，提供一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，操作简单，灵敏度高，适用性强，可用于不同细胞培养上清液中多种化合物的快速检测。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，包括以下操作步骤：
(1)选取不同时间点的细胞培养上清液，分别平行加入2-异丙基苹果酸作为内标，加入乙腈进行蛋白沉淀后，然后将所得溶液固液分离、稀释，得到不同时间点的细胞培养上清液进样样品；
(2)将步骤(1)所得进样样品分别采用超高效液相色谱和三重四级杆质谱联用仪进行分析，完成多种化合物的分段扫描，得到不同时间点的色谱图；
(3)将步骤(2)所得不同时间点的色谱图中的每个化合物峰面积结果导出，以时间为横坐标，以对应时间点时每种化合物与内标的峰面积比值为纵坐标，从而绘制得到每种化合物在细胞培养过程中随时间的含量变化趋势图。
按上述方案，所述细胞培养上清液优选预先经过离心处理的细胞培养上清液。该预处理中，离心转速为3000～5000rpm，离心时间为1～3min。离心处理的细胞培养上清液如果暂时不进行后续步骤，可于-20℃～-80℃保存。
按上述方案，步骤(1)所述乙腈体积与细胞培养上清液体积比例为2:1～3:1。
按上述方案，所述加入的内标2-异丙基苹果酸在细胞培养上清液中的浓度为20～100μmol/L。
按上述方案，步骤(1)所述固液分离采用离心的方式。该固液分离时，离心转速优选10000～15000rpm，离心时间优选10～20min。
按上述方案，步骤(1)中采用水稀释，稀释倍数优选为10～1000倍。
按上述方案，步骤(2)中所述超高效液相色谱为反相色谱，梯度洗脱；所述三重四极杆质谱条件为电喷雾电离，正负离子同时扫描、多反应监测(MRM)方法以及分段扫描。
优选地，所述三重四极杆质谱条件为：电喷雾电离，正负离子同时扫描，雾化气2～3.0mL/min，干燥气0～10mL/min，加热气5～10mL/min，离子源接口温度200～300℃，脱溶剂管温度200～250℃，加热模块温度300～400℃；根据多种化合物出峰时间进行分段扫描。
优选地，所述超高效液相色谱条件为：色谱柱为Discovery HS F5-3，流动相A相为水和甲酸的混合溶液，B相为乙腈和甲酸的混合溶液，梯度洗脱。其中，A相中水和甲酸的体积比为995:5～999:1，B相中乙腈和甲酸的体积比为995:5～999:1。
按上述方案，所述的细胞包括微生物细胞和哺乳动物细胞。
按上述方案，所述的多种化合物主要包括糖类、氨基酸类、核苷酸类、维生素类以及其他有机酸和细胞代谢物在内的多种化合物。其中，糖类化合物包括葡萄糖、蔗糖、葡萄糖酸和氨基葡萄糖等，氨基酸类化合物包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸和胱氨酸等，核苷酸类化合物包括腺苷、胞苷、鸟苷和肌苷等，维生素类化合物包括生物素、胆碱、维生素B6和维生素B2等，有机酸类化合物包括乳酸、苹果酸、琥珀酸和丙酮酸等。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)在现有技术条件下都是通过多种手段和多种仪器检测细胞培养上清液组分，并且检测的化合物种类有限；本发明仅用一套仪器系统即可快速测定细胞培养上清液中多种化合物的含量变化，本发明所检测的多种化合物涵盖范围广，不仅包含细胞培养所需的糖类、氨基酸类、核苷酸类、维生素类等营养物质，还包含有机酸类等细胞代谢物质。
(2)本发明利用超高效液相色谱和三重四极杆质谱联用技术检测细胞培养上清液中多种化合物的含量变化，对于同一时间点的含有多种化合物的一个样品分析仅需17min，利用多反应检测(MRM)并结合分段扫描技术，在短时间内同时实现多种化合物含量变化的快速分析，打破了现有技术中一种仪器只分析一类化合物，多种化合物分析需耗时几天时间的思维局限。
(3)本发明进样样品的前处理简单方便，只需简单的离心、蛋白沉淀、稀释即可完成，不需要复杂的衍生处理。
(4)本发明方法分析效率高、操作简单，灵敏度和选择性好，适用性强，可用于不同细胞培养上清液中多种化合物的快速检测，包括微生物细胞、哺乳动物细胞等。
本发明通过对细胞培养上清液中多种化合物的相对含量变化进行分析，可优化培养基配方和细胞培养条件，建立优质高产、质量可靠的生物技术药物生产工艺流程。此外，本发明所述技术方案能够在上游工艺开发，小试、中试放大至生产规模，以及更换培养基供应商，变更生产场地和工艺等各阶段发挥至关重要的作用。
附图说明
图1为实施例1中微生物培养4h时微生物细胞培养上清液的LC-MS/MS色谱图。
图2为实施例1中蔗糖、脯氨酸、黄嘌呤、生物素和琥珀酸与内标的峰面积比在培养过程中随时间含量变化的趋势图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
下述实施例中，内标2-异丙基苹果酸购于Sigma Aldrich公司，乙腈购于霍尼韦尔公司，超纯水为Milli-Q制水。
下述实施例中，使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用系统。具体配置为：LC-30AD×2输液泵，DGU-20A5在线脱气机，SIL-30AC自动进样器，CTO-20AC柱温箱，CBM-20A系统控制器，LCMS-8050三重四极杆质谱仪，LabSolutionsVer.5.80色谱工作站。分析条件如下：
超高效液相色谱仪条件：色谱柱为反相色谱柱，流速为0.35mL/min，流动相A相为体积分数为0.1％甲酸的水溶液，B相为体积分数为0.1％甲酸的乙腈溶液，具体梯度洗脱程序如表1所示；
表1梯度洗脱程序
三重四极杆质谱仪条件：电喷雾电离，正负离子同时扫描，雾化气3.0mL/min，干燥气10mL/min，加热气10mL/min，离子源接口温度300℃，脱溶剂管温度250℃，加热模块温度400℃。
实施例1
一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，包括以下操作步骤：
(1)样品前处理
分别选取不同培养时间点(0h，2h，4h，6h，8h，10h和12h)的杆菌细胞培养上清液500μL，每个时间点平行选取三个，均按照如下步骤操作：
分别将所选取的微生物细胞培养上清液在5000rpm的转速下离心2min，精确吸取100μL离心后所得上清液，然后加入20μL2-异丙基苹果酸内标(0.5mmol/L)，再加入200μL乙腈彻底混匀，得混悬液；所得混悬液在15000rpm的转速下离心15min，精密吸取100μL此次离心后所得上清液，加入900μL纯水稀释，即得不同时间点的细胞培养上清液进样样品；
(2)将步骤(1)所得不同时间点的细胞培养上清液进样样品分别采用超高效液相色谱和三重四级杆质谱联用仪进行分析，该95种化合物和1个内标(具体化合物和保留时间见表2)，根据出峰时间分成94段进行扫描，每个时间点的样品分析时间为17分钟，得到不同时间点的95种化合物的色谱图；
表2 95种化合物和1个内标及其保留时间
(3)将步骤(2)所得不同时间点的色谱图中的每个化合物峰面积结果导出，以时间为横坐标，以对应时间点时每种化合物与内标的峰面积比值为纵坐标，从而绘制得到整个微生物细胞培养过程中各化合物随时间的含量变化趋势图。
如图1所示，实施例中17分钟即可完成某一时间点的细胞培养上清液中95种化合物的分段扫描，分析速度快，有较好的色谱峰形。
根据整个微生物细胞培养过程中各化合物随时间的含量变化趋势图，可以对细胞培养工艺改进提供参考数据。图2中蔗糖(糖类)和生物素(维生素)的峰面积与内标峰面积比值随着培养时间无明显变化，在细胞培养过程中蔗糖的浓度基本保持不变，表明该化合物在此培养条件下一直处于一个平衡状态或者不参与该细菌的培养，如果是后者，可以考虑在培养基配方中去除这些化合物，从而降低成本；图2中脯氨酸(氨基酸类)和黄嘌呤(核苷酸)峰面积与内标峰面积比值随着培养时间逐渐增大，说明在此培养条件下，这些化合物的量是足够的，可以考虑适当减少这些化合物在培养基中的配比；图2中琥珀酸的峰面积与内标峰面积比值随着培养时间逐渐减少，说明细菌培养过程中一直在消耗这些物质，可以考虑适当增加这些化合物在培养基中的配比。因此，本发明能快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化，从而科学指导细胞培养工艺的调整与确定。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)选取不同时间点的细胞培养上清液，分别平行加入2-异丙基苹果酸作为内标，加入乙腈进行蛋白沉淀后，然后将所得溶液固液分离、稀释，得到不同时间点的细胞培养上清液进样样品；
(2)将步骤(1)所得进样样品分别采用超高效液相色谱和三重四级杆质谱联用仪进行分析，完成多种化合物的分段扫描，得到不同时间点的色谱图；
(3)将步骤(2)所得不同时间点的色谱图中的每个化合物峰面积结果导出，以时间为横坐标，以对应时间点时每种化合物与内标的峰面积比值为纵坐标，从而绘制得到每种化合物在细胞培养过程中随时间的含量变化趋势图。
2.根据权利要求1所述的一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，其特征在于所述细胞培养上清液为预先经过离心处理的细胞培养上清液。
3.根据权利要求2所述的一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，其特征在于所述离心转速为3000～5000rpm，离心时间为1～3min。
4.根据权利要求1所述的一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，其特征在于步骤(1)所述乙腈体积与细胞培养上清液体积比例为2:1～3:1。
5.根据权利要求1所述的一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，其特征在于所述加入的内标2-异丙基苹果酸在细胞培养上清液中的浓度为20～100μmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，其特征在于步骤(1)所述固液分离采用离心的方式，离心转速10000～15000rpm，离心时间10～20min。
7.根据权利要求1所述的一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，其特征在于步骤(1)中采用水稀释，稀释倍数为10～1000倍。
8.根据权利要求1所述的一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，其特征在于步骤(2)中超高效液相色谱为反相色谱，根据多种化合物出峰时间进行分段扫描；所述三重四极杆质谱条件为电喷雾电离，正负离子同时扫描”。
9.根据权利要求1所述的一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，其特征在于所述超高效液相色谱的流动相A相为水和甲酸的混合溶液，B相为乙腈和甲酸的混合溶液，采用梯度洗脱程序。
10.根据权利要求1所述的一种快速测定细胞培养上清液中多种化合物含量变化的方法，其特征在于所述的细胞包括微生物细胞和哺乳动物细胞；多种化合物主要包括糖类、氨基酸类、核苷酸类、维生素类以及其他有机酸和细胞代谢物在内的多种化合物。
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