CN106226287A - 一种测定脾虚证及中药干预后大鼠各组织微量元素的方法 - Google Patents

一种测定脾虚证及中药干预后大鼠各组织微量元素的方法 Download PDF

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闫清华
刘涌涛
张文博
王歌
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Abstract

用微波消解仪对脾虚证及中药干预后大鼠进行处理，再采用ICP‑OES法同时测定脾虚证大鼠胃、小肠和肝中Ca、Cu、Fe、Mg、Mn、Zn六种微量元素。结果显示：Ca、Mg、Mn3种元素在脾虚证大鼠中含量均较低，而对于Cu元素来说，在脾虚证大鼠各器官中含量均较高；而对于Fe、Zn元素来说，两种元素均在脾虚证大鼠的胃、小肠中含量较低，而在肝中含量较高。采用微波消解技术和ICP‑OES技术相结合的方法检测脾虚证大鼠各组织中微量元素具有简单、快捷、精密度和准确度高等优点，也为其它动物组织器官检测元素提供了新方法。

Description

一种测定脾虚证及中药干预后大鼠各组织微量元素的方法
技术领域
本发明涉及对脾虚证及中药干预后大鼠各组织进行处理并同时测定各组织微量元素含量的方法。
背景技术
脾虚证是以消化吸收功能低下为主的多器官和多系统功能减弱的综合病理变化，传统中医对其有较好的治疗作用，但对其现代科学的物质基础不甚清楚。建立中医证候动物模型是进行证候本质研究和相关中药药效研究的必要环节。利用西医利血平注射液是复制大鼠脾虚证动物模型的经典方法，传统复方四君子汤是治疗脾虚证的历史明方，代谢组学主要通过系统研究生命体在新陈代谢动态过程中代谢产物的变化规律，从而揭示机体生命活动代谢的本质。而微量元素对动物器官又有其特殊的生理功能，微量元素的变化均会不同程度地引起动物生理的异常或发生疾病，甚至对生命造成影响。例如：机体内Cu、Zn含量减少，可减弱免疫系统的免疫能力，降低抵抗疾病能力，并且会助长细菌的感染。Mg在对机体神经系统的稳定性方面扮演着重要角色。因此，动物器官中微量元素的种类和含量尤显重要。可促进“证”本质研究和中医辨证的科学化和定量化，深层次理解中医证候的本质。
如何准确快速地建立一种同时测定脾虚证及中药干预后大鼠中各组织微量元素的方法是对揭示脾虚证代谢综合征中医证候本质分析的前提条件。本申请拟通过复制脾虚证代谢综合征大鼠模型，对模型中胃、小肠和肝等标本进行微量金属元素检测，寻找脾虚证代谢综合征病变的特征性的特征元素，并观察特征元素与生理病理变化的相对关系，从而揭示脾虚证代谢综合征中医证候本质。本申请旨在保护采用微波消解仪对脾虚证大鼠中各器官进行消解处理，再采用电感耦合等离子原子发射光谱对各器官中的微量元素含量进行测定的分析方法。
发明内容
本发明的目的是提供了一种对脾虚证大鼠中各器官进行微波消解处理并同时测定各组织中微量元素的方法。
本发明的技术方案为：首先用微波消解仪对脾虚证大鼠和治愈后大鼠各组织进行处理，包括胃、小肠和肝等消解溶液的选择和微波消解条件优化。再采用电感耦合等离子体原 子发射光谱法(ICP-OES)同时测定脾虚证大鼠和治愈后大鼠各组织中Ca、Cu、Fe、Mg、Mn、Zn六种微量元素，包括ICP-OES仪器条件优化和检测结果精密度和准确度分析。
具体步骤如下：
(1)消解溶液的选择和微波消解条件优化
准确称取0.5g粉碎后的脾虚证大鼠和治愈后大鼠的胃、小肠和肝脏组织样品，放入微波消化罐中，再向消化罐中各加入11mL浓硝酸和1mL过氧化氢，用优化的微波消解仪条件消解样品，待消化完全后，将消化液转移至烧杯中，在165℃的电热板上加热赶酸，直至溶液澄清透亮近干，转移到25mL容量瓶中，并用2％的稀硝酸定容。
(2)ICP-OES仪器条件优化
选择Ca的最佳分析波长为317.933nm，Cu的最佳分析波长为324.752nm，Fe的最佳分析波长为259.939nm，Mg的最佳分析波长为285.213nm，Mn的最佳分析波长为257.610nm，Zn的最佳分析波长为213.857nm，在ICP-OES冷却气流量为15L/min,雾化气流量为0.75L/min,辅助气流量为0.2L/min，射频功率为1300W,进样量为1.5mL/min最佳仪器条件下对消解溶液进行检测。
(3)结果精密度和准确度分析
在消解样品溶液中加入不同检测元素的标准溶液，在同样的电感耦合等离子体原子发射光谱优化条件下对样品进行加标回收实验，该方法所测元素回收率均在92％-108％范围内，证明该方法准确度高。并对该加标样品溶液中检测元素进行精密度分析，每种元素连续检测5次，相对标准偏差在0.18％-2.13％之间，证明该方法精密度好。
本发明用微波消解仪对脾虚证大鼠和治愈后大鼠各组织进行处理，再采用电感耦合等离子体原子发射光谱法同时测定脾虚证大鼠和治愈后大鼠各组织中微量元素，比一般湿法消解能力强，样品分解彻底，试剂用量少，环境污染小。为生物器官、组织中常微量金属元素同时分析提供了一种较好样品处理和检测方法。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本发明。应该指出，本发明并非局限于下述实施例。
实施例
(1)样品的预处理
先取部分脾虚证大鼠和治愈后大鼠中胃、小肠和肝组织样品、粉碎。再用分析天平分别取0.5g样品转移到不同的微波消化管中，再向消化罐中各加入11mL浓硝酸和1mL过氧化氢。在表1微波消解仪工作参数下，用微波消解仪进行消化，待消化完全后，将消化液转移 至烧杯中，然后在165℃的电热板上赶酸，待近干时，停止赶酸，冷却。最后定容到25mL容量瓶中，待测。不同的微波消解条件对样品的消化效果存在明显的差别，通过试验考察了微波消解仪的运行功率、升温时间、运行温度、运行时间等因素的影响，同时，也考察了消解介质对样品消解程度的影响。硝酸不仅仅是分解基体的反应物，也是良好的微波吸收体，有助于对样品的消化。因此，用硝酸作为消解体系，实验也证明，其消化效果较佳。消化程序完成后，消化后的溶液呈黄色透明，没有沉淀，样品消化彻底。
(2)微波消解条件的优化
表1微波消解仪工作参数
通过实验考察了微波消解运行功率、升温时间、运行温度、运行时间等多方面因素的影响，并且确定了微波消解的最佳程序。
(3)ICP-OES法所测6种元素的线性方程及相关系数
表2方法的曲线方程和相关系数
根据样品中各元素的浓度范围配置适宜的标准溶液系列。将标准储备液用3％的硝酸逐级稀释，Ca、Cu、Fe、Mg、Mn、Zn等混合标准液按0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00μg/mL梯度进行配制，在最佳ICP-OES仪器优化条件下绘制标准曲线和相关系数。由上表中数据可以看出，各种待测元素的线性系数在0.9991-0.9998之间。因此，可以得出该标准曲线的线性是良好的。
(4)元素分析波长的选择及元素检出限的测定
原子发射光谱法对每种元素的测定均可同时选择多条特征谱线，实验过程中对每种检测元素选取2或3条谱线进行检测，综合分析强度、干扰情况以及稳定性，选择对谱线干扰少、精密度高的分析线进行分析测量。对空白溶液重复测定10次，取信噪比3倍的浓度值为各元素的检出限。如下表3：
表3元素的分析波长及检出限
(5)回收率和精密度实验
在同样的实验条件下，在已知含量的样品中加入一定量的混合标准溶液，测定其回收率，同时进行精密度分析，分析结果如表4所示。结果表明，6种元素的加标回收率和精密度均令人满意，说明该方法准确可靠。
表4样品回收率和精密度实验结果(mg/kg)(n＝5)
由表4可以看出的是，用微波消解法测定脾虚证及中药干预后大鼠各组织中微量元素含量的相对标准偏差在0.18％～2.13％，各元素的回收率也在92％～108％。此结果显示本实验的方法具有较好的精密度以及重复性。
(6)样品测定
表5样品测定结果(mg/kg)(n＝5)
从脾虚证大鼠、治愈后大鼠和正常大鼠所测各组织中微量元素的含量对比发现，Ca、Mg、Mn3种元素在脾虚证大鼠中含量均较低，而对于Cu元素来说，在脾虚证大鼠各器官中含量均较高；而对于Fe、Zn元素来说，两种元素均在脾虚证大鼠的的胃、小肠中含量较低，而在肝中含量较高。
以上实施例描述了本发明的样品微波消解和ICP-OES仪器最佳测定条件、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的测定条件、主要特征及优点，在不脱离本发明的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (1)

1.一种对脾虚证及中药干预后大鼠进行处理并同时测定各组织中所含微量元素的方法，包括对脾虚证大鼠不同组织的消解溶液的选择和微波消解条件优化、ICP-OES仪器条件优化和检测结果精密度和准确度分析，其特征在于：
(1)准确称取0.5g粉碎后的脾虚证大鼠和治愈后大鼠的胃、小肠和肝组织样品，放入微波消化罐中，再向消化罐中各加入11mL浓硝酸和1mL过氧化氢，用优化的微波消解仪条件消解样品，待消化完全后，将消化液转移至烧杯中，在165℃的电热板上加热赶酸，直至溶液澄清透亮近干，转移到25mL容量瓶中，并用2％的稀硝酸定容；
(2)选择Ca的最佳分析波长为317.933nm，Cu的最佳分析波长为324.752nm，Fe的最佳分析波长为259.939nm，Mg的最佳分析波长为285.213nm，Mn的最佳分析波长为257.610nm，Zn的最佳分析波长为213.857nm，在ICP-OES冷却气流量为15L/min,雾化气流量为0.75L/min,辅助气流量为0.2L/min，射频功率为1300W,进样量为1.5mL/min最佳仪器条件下对消解溶液进行检测；
(3)在消解样品溶液中加入不同检测元素的标准溶液，在同样的ICP-OES优化条件下对样品进行加标回收实验，该方法所测元素回收率均在92％-108％范围内，证明该方法准确度高，并对该加标样品溶液中检测元素进行精密度分析，每种元素连续检测5次，相对标准偏差在0.18％-2.13％之间，证明该方法精密度好。
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