CN106222254A - 分子标志物在区别慢乙肝和肝癌中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了化合物在制备区别诊断AFP阴性慢性乙型肝炎和AFP阴性肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述化合物为检测分子标志物RAB27B的表达水平的试剂。本发明可以有效甄别AFP阴性的慢性乙型肝炎患者和AFP阴性的肝癌患者，降低属于肝癌高危人群的慢性乙型肝炎患者的常规筛查中对早期肝癌的漏诊率。

Description

分子标志物在区别慢乙肝和肝癌中的用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及化合物在制备区别诊断AFP阴性慢性乙型肝炎和AFP阴性肝癌的试剂盒中的用途。
背景技术
原发性肝细胞癌是临床常见的恶性肿瘤，占肝部原发肿瘤的90％以上，其发病率居全球第五位，病死率仅次于肺癌、胃癌，居全球第三位。全世界每年平均约25万人死于肝癌，我国约占其中的45％。由于肝癌起病具有隐匿性高、进展快、侵袭性强、易转移、预后差等特点及其对传统放、化疗技术的不敏感，目前肝癌仍为内外科的难治性疾病。
肿瘤转移是造成90％的癌症患者死亡的原因，在肝炎-肝硬化-肝癌的发展过程中，肿瘤的发生及转移常常发生在典型的肝癌临床症状出现之前。临床上常见的与肝癌预后相关的指标主要如下：AST(IU/L)、TBIL(μmol/L)、GGT(IU/L)、WBC(109/L)、NLR、PTA(％)、AFP(甲胎蛋白)≥400ng/mL、Amount、Diameter(cm)、Lymph node metastasis、Portal veininvolvement。
但是，以上指标在肝癌和肝硬化、肝炎患者中均可能出现，不能将慢性肝病和肝癌进行特异性区分，如临床上广泛应用的AFP，特异性可达80％，大量临床研究发现，部分肝硬化患者会长期出现AFP达到1000u以上，但反复检查并未罹患肝癌的情况；同时，30％-40％的肝癌患者直到癌症晚期，也没有检测到AFP的升高。此外，当以AFP作为标志物时还需进行2个月的动态观察，以排除其他因素的干扰。因此对于进展较快的肝癌，可能延误其更加积极的治疗，给后续诊治带来困难。
因此有必要研究开发新的兼具敏感性、特异性及稳定性的分子标志物，从而为准确区别诊断AFP阴性慢性乙型肝炎和AFP阴性肝癌，及时了解肝癌发生及进展过程提供有效手段。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的检测技术中存在的敏感性差的缺陷，提供一种兼具敏感性、特异性及稳定性的检测方案，为准确区别诊断AFP阴性慢性乙型肝炎和AFP阴性肝癌，及时了解肝癌发生及进展过程提供有效手段。
为了实现上述目的，本发明提供了化合物在制备区别诊断AFP阴性慢性乙型肝炎和AFP阴性肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述化合物为检测分子标志物RAB27B的表达水平的试剂。
RAB27B(分子量为25KD)是原癌基因Ras超家族成员，现已有部分研究证实RAB27B在肝癌组织中普遍高表达，且表达水平越高，患者的预后越差。但目前尚无文献及专利报导血清RAB27B的表达水平可区分慢性乙型肝炎患者及肝癌患者。本发明通过上述技术方案，能够较AFP(甲胎蛋白)更加敏感地将肝癌患者从属于高危人群的慢性乙型肝炎患者中诊断出来。尤其对于AFP表达阴性的肝癌患者，RAB27B相关检测手段的引入可以极大地降低漏诊率，提高肝癌的整体诊断效率，收到良好社会效益，降低住院治疗费用。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了化合物在制备区别诊断AFP阴性慢性乙型肝炎和AFP阴性肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述化合物为检测分子标志物RAB27B的表达水平的试剂。
其中，AFP阴性的定义如下：
在具有明确的乙型肝炎标志物阳性的慢性乙型肝炎、肝硬化患者中满足以下条件之一的患者：1)对流电泳法阳性，或定量检测血清AFP<400μg/L持续30天(每10天检测一次，共检测3次)，或<200μg/L持续60天(每10天检测一次，共检测6次)的患者；2)影像学检查有明确肝内实质性占位病变，能排除肝血管瘤和转移性肝癌，且AFP<200μg/mI持续30天(每10天检测一次，共检测3次)的患者。
其中，检测分子标志物RAB27B的表达水平的步骤可以包括：
1)获得AFP阴性待测样本和来自于确诊的慢性乙型肝炎患者和/或确诊的肝癌患者的对照样本；
2)检测待测样本和对照样本中RAB27B的表达水平差异。
待测样本可以为血清样本、肝穿刺组织样本及精液、阴道分泌物等其他体液样本。
优选的，所述表达水平为RAB27B在血清中的表达水平。
具体的，在本发明中，当待测样本中RAB27B的表达水平为高表达时，指示待测样本来自AFP阴性的肝癌患者，否则为AFP阴性的慢性乙型肝炎患者。
其中，待测样本中RAB27B的高表达指待测样本中RAB27B的表达量与慢性乙型肝炎患者样本的RAB27B表达量相比具有显著差异(P＝0.0228)，其中，慢性乙型肝炎患者样本是指按照世界卫生组织(World Health Organization(WHO))标准以及国际抗癌学会(International Union against Cancer)标准进行诊断后确认的不表现有肝癌病理特征的来自于慢性乙型肝炎患者的样本。
所述检测分子标志物RAB27B的表达水平的试剂为抗RAB27B的抗体、RAB27B编码基因的特异性引物、RAB27B编码基因的特异性探针。
可选的，所述试剂为杂交法检测试剂、扩增法检测试剂或免疫反应法检测试剂。
进一步地，检测分子标志物RAB27B的表达水平的方法选自PCR方法、Western-blot、Northern-blot、North-Western印迹、免疫吸附测定法、抗体微阵列、组织微阵列、免疫沉淀、原位杂交、放射免疫测定法和免疫酶测定法中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述免疫反应法为Western-blot或免疫组化法，所述试剂为RAB27B特异性抗体等试剂。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
1、初步筛查获得具有慢性乙型肝炎疾病的患者
1.1纳入标准
符合慢性乙型肝炎诊断标准；年龄18-65岁的男性或女性；签署知情同意书。
1.2排除标准
合并其他肝脏疾病及肝细胞癌的患者；合并有其他病原体感染的患者；有严重心、肾等并发症或合并其它原发性疾病者；精神病患者；上消化道出血者；肝肾综合征；妊娠或哺乳期妇女；患者不能合作者。
1.3诊断标准：
1.3.1HBeAg(乙型肝炎e抗原)阳性慢性乙型肝炎：血清HbsAg(乙型肝炎表面抗原)、HBeAg阳性，抗-HBe阴性，HBV(乙型肝炎病毒)DNA阳性，ALT(谷丙转氨酶)持续或反复升高，或肝组织学检查有肝炎病变。
1.3.2HBeAg阴性慢性乙型肝炎：血清HBsAg阳性，HBeAg持续阴性，抗-HBe阳性或阴性，HBV DNA阳性，ALT持续或反复异常，或肝组织学检查有肝炎病变。
2、对筛查获得的410例有慢性乙型肝炎疾病的患者血清进行AFP检测：
采用英科新创(厦门)科技有限公司的甲胎蛋白定量测定试剂盒(酶联免疫吸附法)及其配套试剂，按照试剂盒说明书所给出的步骤检测血清AFP。
满足以下条件之一的判定为AFP阴性：1)对流电泳法阳性，定量检测血清AFP<400μg/L持续30天(每10天检测一次，共检测3次)，或<200μg/L持续60天(每10天检测一次，共检测6次)的患者；2)影像学检查有明确肝内实质性占位病变，能排除肝血管瘤和转移性肝癌，且AFP<200μg/mI持续30天(每10天检测一次，共检测3次)的患者。
共筛查得到330例AFP阴性患者，检测结果如表1所示。
表1
表1中临床金标准为：(1)AFP≥400μg/L，能排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并能触及肿大、坚硬及有大结节状肿块的肝脏或影像学检查有肝癌特征的占位性病变者，或者，(2)AFP＜400μg/L，能排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并有两种影像学检查有肝癌特征的占位性病变或有两种肝癌标志物(DCP、GGTⅡ、AFU及CAl9-9等)阳性及一种影像学检查有肝癌特征的占位性病变者，或者，(3)有肝癌的临床表观并有肯定的肝外转移病灶(包括肉眼可见的血性腹水或在其中发现癌细胞)并能排除转移性肝癌者。
该结果表明仅应用AFP从慢性乙型肝炎中检测肝癌患者的敏感性为33.33％，特异性达100％，但漏诊率达66.67％。
3、检测筛查得到的330例AFP阴性患者的RAB27B血清表达水平。
3.1血清的采集及冻存
静脉采血，将待测血清移入1.5ml离心管内，-20℃冻存，BCA法测定蛋白浓度。Western-blot对血清中RAB27B表达进行半定量检测。使用10μg经纯化的RAB27B蛋白干粉作为RAB27B阳性对照，上样参照，得出相对灰度值(相对灰度＝RAB27B表达灰度/10μg RAB27B表达灰度)。对条带灰度进行统计，并与阳性对照进行对比，得出每个样本血清中RAB27B的相对表达量，并对结果进行统计获得RAB27B阳性病例161例和阴性病例169例。
4、RAB27B检测的准确性验证
对RAB27B检测的330例AFP阴性慢乙肝患者病例进行临床检查确诊，确诊依据如下：(1)AFP＜400μg/L，能排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并有两种影像学检查有肝癌特征的占位性病变或有两种肝癌标志物(DCP、GGTⅡ、AFU及CAl9-9等)阳性及一种影像学检查有肝癌特征的占位性病变者，或者，(2)有肝癌的临床表观并有肯定的肝外转移病灶(包括肉眼可见的血性腹水或在其中发现癌细胞)并能排除转移性肝癌者。
其中，肝癌患者192例，非肝癌患者138例，结果如表2所示。该结果表明RAB27B检测AFP阴性肝癌患者的敏感性达66.67％，特异性达76.47％，RAB27B检测出的阳性病例与临床金标准检测的阳性病例的符合率为89.36％。
表2
将AFP及RAB27B进行联合诊断后，临床可获确诊的肝癌患者的检出率从19.51％提高到了50.73％，从而可以提高肝癌的整体诊断效率，收到良好社会效益，降低患者住院治疗的费用。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，例如使用RAB27B的表达水平检测HCV或其他肝脏炎性疾病及与之相关的肝癌发生的鉴别等，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，例如使用实时荧光聚合酶链式反应、Northern-blot检测RAB27B的表达水平，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (4)

1.化合物在制备区别诊断AFP阴性慢性乙型肝炎和AFP阴性肝癌的试剂盒中的用途，其中，所述化合物为检测分子标志物RAB27B的表达水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述检测分子标志物RAB27B的表达水平的试剂为抗RAB27B的抗体、RAB27B编码基因的特异性引物、RAB27B编码基因的特异性探针。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述表达水平为RAB27B在血清中的表达水平。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，检测分子标志物RAB27B的表达水平的方法选自PCR方法、Western-blot、Northern-blot、North-Western印迹、免疫吸附测定法、抗体微阵列、组织微阵列、免疫沉淀、原位杂交、放射免疫测定法和免疫酶测定法中的至少一种。
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