CN104535766A - 外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物,上述标志物是exosome来源的Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白。本发明通过western blot检测发现肝癌患者外周血exosome中Rab27A蛋白表达阳性率明显高于正常人,而肝癌患者外周血exosome中Rab27B蛋白表达阴性率明显高于正常人。上述实验结果同临床数据结合分析显示:Rab27A蛋白和Rab27B蛋白含量异常与肝癌的发生、发展显著相关;Rab27A蛋白表达阳性患者和Rab27B蛋白表达阴性患者生存时间缩短。本发明的诊断和预后标志物为临床上诊断肝癌和判断预后提供了一种灵敏度更高、特异性更强的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,涉及人类外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物及其应用;具体涉及人类血液exosome来源的Rab27A/B蛋白作为肝癌诊断和预后标志物及其在制备诊断肝癌和判断肝癌预后试剂盒中的应用。
背景技术
原发性肝癌(HCC)是世界范围内前十名常见肿瘤,有非常高的死亡率,每年大约有一百万人死于这种疾病。找到与原发性肝癌进展有关的肿瘤标志物,进而指导临床对肝癌患者来说将有非常重要的意义。
exosome是多种细胞分泌的一种30-100nm大小的膜性囊状结构。肿瘤细胞较正常细胞能分泌更多的exosome,分泌到细胞外的exosome携带有大量肿瘤特异的抗原蛋白、抗原伴侣分子和核酸,通过exosome中的蛋白质和核酸促进肿瘤细胞之间信息交流,产生旁路效应,促进肿瘤生长和转移。Rabinowits等发现肺癌病人外周血中exosome平均蛋白浓度达到2.85mg/ml(95%CI 1.94-3.76),而非肿瘤病人只有0.77mg/ml(95%CI 0.68-0.86),远远低于肺癌病人(P<0.001);从exosome蛋白浓度95%的区间来看,肺癌病人和非肺癌病人的区间无重叠。因此,外周血中exosome蛋白浓度有可能作为肺癌诊断的标志物。申请人所在课题组前期研究也发现从卵巢癌腹水中分离得到的exosome含有大量肿瘤-睾丸抗原和免疫分子,国内外学者利用exosome中的肿瘤抗原蛋白制作exosome亚细胞瘤苗,在体外和动物实验以及部分人体实验都取得了好的效果。肿瘤分泌的exosome较肿瘤细胞更易进入外周血,即使在脑胶母细胞肿瘤,纳米级的exosome也能透过致密的血脑屏障进入外周血,并通过外周血exosome中EGFRvIII基因突变的检测来明确胶母细胞肿瘤的诊断和治疗;此外,肿瘤细胞分泌exosome的能力较正常细胞更强,exosome中的核酸和蛋白质受到双层脂质膜的保护不易被血中的蛋白酶和核酸酶降解;所有上述因素都是利用外周血exosome作为肿瘤早期诊断 的最佳理由。在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌,国外学者利用外周血exosome中存在较高的肿瘤相关抗原蛋白来进行早期诊断。
Rab家族属Ras超家族的小GTP酶,目前有近70个家族成员,是参与囊泡融合及运输相关的一类膜相关蛋白,参与细胞的分泌、胞吞、信号转导等,是细胞内外信息交流的重要调控蛋白。Rab27A和Rab27B组成了Rab27亚家族,并具有71%同源性。上述两种蛋白在exosome运输(Trafficking)、与细胞膜对接(docking)、融合(fuse)和胞吐(exocytosis)上所起作用最突出。Rab27A蛋白在肺癌、乳腺癌、脑胶质母细胞瘤的高表达与这些肿瘤侵袭和转移等恶性生物学行为密切相关。但,有关Rab27B的研究较少,Hendrix等的研究表明:人体胚胎各个器官细胞均无Rab27B表达,而成熟的器官各个细胞均有表达。申请人所在课题组前期对正常肝组织、肝炎组织、肝硬化组织的、正常胃和大肠组织Rab27B蛋白表达进行了检测,发现上述组织均存在Rab27B蛋白表达,然而,其对应的肿瘤组织却不同程度的丢失。因此,Rab27B蛋白可能是一种与细胞分化相关的蛋白,由于肿瘤细胞的去分化而发生丢失。
目前,肝癌的诊断主要依赖于影像学上发现肝内肿物,包括超声、CT、核磁共振(MRI)等,同时结合血清中的肿瘤标志物如AFP等。但是,这两种方法的敏感性及特异性都不是十分令人满意。因此开发一种高敏感性和特异性的肝癌诊断方法是亟待解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物,所述标志物是exosome来源的Rab27A和/或Rab27B。本发明提供的标志物来源于人类外周血exosome,由于exosome具有选择性富集癌蛋白的作用,且受细胞膜的保护,在细胞间隙和外周血中不易被降解,因此本发明的标志物用于肝癌的诊断和预后敏感性更强。同时由于Rab27A和Rab27B在不同组织的表达模式存在明显的差异,反映了其组织特异性,因此本发明的标志物用于肝癌的诊断和预后特异性更强。
为了实现本发明的上述目的,本发明采用了如下技术方案:
本发明提供了一种外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物,所述标志 物是exsome来源的Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白。Rab27A和Rab27B两蛋白在肝癌患者血液exosome中表达相反的特点,将Rab27A/Rab27B比值作为肝癌早期诊断的指标比单独使用一种蛋白作为诊断指标的诊断率更高。
本发明还提供了上述标志物的检测试剂。所述试剂包括Rab27A蛋白的单克隆抗体和/或Rab27B蛋白的单克隆抗体。优选地,所述Rab27A蛋白的单克隆抗体购自Abcam公司,货号为ab55667;所述Rab27B蛋白的单克隆抗体购自Proteintech Group,货号为13412-1-AP。
本发明还提供了上述标志物在制备诊断人类肝癌的试剂盒中的应用,所述试剂盒包括Rab27A蛋白的单克隆抗体和Rab27A蛋白标准品,该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋白含量来判断受试者是否患有肝癌。可选地,所述诊断试剂盒还可包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品,该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白的含量来判断受试者是否患有肝癌。
作为一种可替代的实施方案,所述诊断试剂盒包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品。该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27B蛋白含量来判断受试者是否患有肝癌。
本发明还提供了上述标志物在制备判断肝癌预后的试剂盒中的应用,所述试剂盒包括Rab27A蛋白的单克隆抗体和Rab27A蛋白标准品,该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋白含量来判断肝癌患者的预后效果。可选地,所述试剂盒还可包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品,该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白含量来判断肝癌患者的预后效果。
作为一种可替代的实施方案,所述试剂盒包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品。该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27B蛋白含量来判断肝癌患者的预后效果。
本发明还提供了一种诊断人类肝癌的试剂盒,所述试剂盒包括Rab27A蛋白的单克隆抗体和Rab27A蛋白标准品,该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋白含量来判断受试者是否患有肝癌。可选地,所述试剂盒还可包 括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品,该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白含量来判断受试者是否患有肝癌。
作为一种可替代的实施方案,所述诊断试剂盒包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品。该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27B蛋白含量来判断受试者是否患有肝癌。
本发明还提供了一种判断肝癌患者预后的试剂盒,所述试剂盒包括Rab27A蛋白的单克隆抗体和Rab27A蛋白标准品,该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋白含量来判断肝癌患者的预后效果。可选地,所述试剂盒还可包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品,该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白含量来判断肝癌患者的预后效果。
作为一种可替代的实施方案,所述试剂盒包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品。该试剂盒通过检测人类外周血exosome来源的Rab27B蛋白含量来判断肝癌患者的预后效果。
优选地,诊断试剂盒和判断预后试剂盒中Rab27A蛋白标准品和Rab27B蛋白标准品购自北京义翘神州生物技术有限公司。
优选地,本发明的诊断试剂盒和判断预后试剂盒还包括ELISA实验中常用的试剂。
本发明还提供了一种诊断人类肝癌的方法,所述方法的具体操作步骤如下:
(1)分离并纯化人类外周血中的exosome;
(2)提取exosome中的蛋白;
(3)检测Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量;
(4)将步骤(3)获得的受试者的Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量与大部分正常人相应蛋白的含量相比,如果受试者Rab27A蛋白显著升高,则诊断受试者为肝癌患者;如果Rab27B蛋白显著降低或无表达,则诊断受试者为肝癌患者。
本发明还提供了一种判断肝癌患者预后的方法,所述方法的具体操作步骤如下:
(1)分离并纯化人类外周血中的exosome;
(2)提取exosome中的蛋白;
(3)检测Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量;
(4)将步骤(3)获得的受试者的Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量与大部分正常人相应蛋白的含量相比,如果受试者Rab27A蛋白显著升高,则该肝癌患者的预后差;如果Rab27B蛋白显著降低或无表达,则该肝癌患者的预后差。
在本发明的具体实施方案中,分离并纯化人类外周血中的exosome的具体操作步骤是:
(1)全血3000*g离心15min,移去细胞和细胞碎片;
(2)取上层液体移入离心管,加入适量Exoquick试剂,4℃下反应30min;优选250μl血清中加入63μl Exoquick试剂;
(3)1500*g离心混合液30min(exosome沉于管下);
(4)吸出上清,离心1500*g 5min吸出所有上清(不能震动离心管);
(5)用250μl PBS溶解全部沉淀,-20℃保存。
在本发明的具体实施方案中,采用德国ExoQick试剂盒提取exosome蛋白,具体操作步骤参见试剂盒说明书。
可以用于本发明以检测Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白含量的方法包括流式细胞仪检测法、ELISA检测法、Western blot法。
使用流式细胞仪检测Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量的具体操作步骤是:取2mg的exosome与2ml直径为4mM的醛/硫酸盐的乳胶株(aldehyde/sulfate latex beads)在室温下孵育2小时;然后在每个样品中加入含20%小牛血清的PBS,再孵育30分钟;在exosome包被的乳胶株中加入鼠抗人Rab27A或Rab27B单克隆抗体,在4℃下孵育30分钟,再加入荧光素(FITC)标记的兔抗鼠多克隆抗体,在4℃下再次孵育20分钟;最后上流式细胞仪检测。
使用ELISA法检测Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的含量的具体操作步骤 是:
a.exosome蛋白提取、纯化和定量同上所述。血浆Rab27A/B蛋白检测直接取血浆检测。
b.抗体包被的酶标板的制备:用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液将Rab27A/B抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3min。
c.加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1h。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
d.加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1h,洗涤。
e.加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30min。
f.终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
g.结果判断:在波长为450nm下测得相应的OD值,并在标准曲线上找到相应的量。
h.ELASA检测Rab27A/B蛋白标准曲线的建立:在每次样本检测前,需建立Rab27A/B的标准曲线。靶Rab27A/B标准品按不同浓度稀释,再按上述ELASA方法进行检测,在对数纸上以测得的OD值为纵坐标,稀释的不同浓度为横坐标建立标准曲线。
优选地,本发明使用Western blot检测Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白的相对含量。
Rab27A蛋白在大部分正常人群中低表达,在本发明中称低表达的状态为“表达阴性”,Rab27B蛋白在大部分正常人群中高表达,在本发明中称高表达的状态为“表达阳性”。阳性和阴性是相对的。
本发明的优点和有益效果如下:
(1)血液中肿瘤源性exosome来源的蛋白是一种新型生物标志物,区别于传统生物标志物,不仅稳定、微创、易于检测,且定量精确,将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性,该类生物标志物的成功开发有助于肝癌的辅助诊断,为其他 疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)通过检测血液中肿瘤源性exosome来源的蛋白质的表达来判断人类肝癌预后效果的方法,为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
附图说明
图1显示western blot检测的外周血exosome中Rab27A蛋白相对表达量;
图2显示western blot检测的外周血exosome中Rab27B蛋白相对表达量。
具体的实施方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明,本发明的实施例仅用于解释本发明,并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1外周血exosome来源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白的差异性表达
1.1外周血样本的收集
发明人于2013年1月在中国人民解放军第一附属医院收集了大量的肝癌患者和肝硬化患者的外周血样本(用于研究的样本为同期收集、采样、分装、保存条件均一),通过对样本资料的整理,发明人从中选择了50例符合同医院、尽量同科室随机收集的肝癌病人血浆和50例同医院与实验组同一时期随机收集的正常人的血浆。要求患者未进行特殊治疗,如抗病毒和抗肿瘤治疗,或停止上述治疗已超过9周者,取空腹EDTA抗凝外周血。取血前,所有参与者需填写知情同意书,该项目需通过医院伦理道德委员会的批准。
1.2exosome的分离与纯化
(1)全血3000*g离心15min,移去细胞和细胞碎片;
(2)取上层液体移入离心管,加入适量Exoquick试剂,4℃下反应30min;优选250μl血清中加入63μl Exoquick试剂;
(3)1500*g离心混合液30min(exosome沉于管下);
(4)吸出上清,离心1500*g 5min吸出所有上清(不能震动离心管);
(5)用250μl PBS溶解全部沉淀,-20℃保存。
1.3Western blot
1.3.1蛋白提取
采用德国ExoQick试剂盒提取exosome蛋白,具体操作步骤参见试剂盒说明书。
1.3.2蛋白定量
采用BCA蛋白定量试剂盒(pierce)对exosome蛋白进行定量,具体操作步骤参见试剂盒说明书。
1.3.3免疫印迹
将50μg样品加入2×SDS凝胶加样缓冲液,100℃变性10min,顺序加样,行SDS-PAGE电泳。电泳结束后,经湿式电转仪(Bio-Rad)恒压冰浴转膜(PVDF,Pharmacia),5%脱脂牛奶4℃封闭1h,孵育一抗anti-Rab27A(1:100稀释;货号:ab55667;Abcam,UK),anti-Rab27B(1:1200稀释;货号:13412-1-AP;Proteintech Group,USA),anti-β-actin作为内参抗体,4℃过夜。加入相应种属的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h,化学发光(ECL Plus检测试剂盒,Amersham Biosciences,UK),显影,定影,观察杂交信号。
1.3.4数据处理
将X-光片上的蛋白质条带扫描,使用Image J软件进行蛋白质条带灰度值的计算,将Rab27A蛋白、Rab27B蛋白条带的灰度值以内参蛋白β-actin的灰度值为基准进行归一化处理,灰度值的比值作为蛋白质含量的衡量指标。
1.4结果
Western blot的实验结果显示,50名正常人中有7人的外周血exosome中Rab27A蛋白表达阳性,即阳性率为14%,而有41人的外周血exosome中Rab27B蛋白表达阳性,即阳性率为82%、阴性率为18%;50名肝癌患者中有35名患者的外周血exosome中Rab27A蛋白表达阳性,即阳性率为70%,而有8名患者的外周血exosome中Rab27B蛋白表达阳性,即阳性率为16%,阴性率为84%,上述数据表明肝癌患者中Rab27A蛋白表达的阳性率显著上调,而Rab27B蛋白表达的阳性率显著下调、阴性率上调。无论Rab27A还是Rab27B,在肝癌和正常人的外周血exosome中的含量差异均有统计学意义,P<0.05。Rab27A蛋白表达阳性的肝癌患者中Rab27A的蛋白表达量与大部分正常人相比,显著上调;Rab27B蛋白表达阴性的肝癌患者中Rab27B的蛋白表达量与大部分正常人相比,显著下调(如图1和图2所示)。
实施例2外周血exosome来源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白的表达与肝癌的相关性分析
按照实施例1的方法收集200名肝癌患者的外周血样本,同时收集200名正常人的外周血样本,并测定外周血样本中Rab27A蛋白和Rab27B蛋白的含量,分别统计肝癌患者和正常人的Rab27A蛋白的阳性率以及Rab27B蛋白表达的阴性率。
多因素Logistic回归分析结果显示,外周血exosome中Rab27A蛋白和Rab27B蛋白含量的异常与肝癌具有明确的相关性,分析结果见表1和表2。
表1 Rab27A蛋白含量异常与肝癌的相关性分析
正常人 | 肝癌患者 | Odd值 | P | |
阳性率 | 17% | 72% | 12.554 | <0.01 |
表2 Rab27B蛋白含量异常与肝癌的相关性分析
正常人 | 肝癌患者 | Odd值 | P | |
阴性率 | 16% | 85% | 29.75 | <0.01 |
实施例3肝癌患者外周血exosome来源的Rab27A蛋白和Rab27B蛋白的表达与预后的关系
对实施例2中200例肝癌患者进行随访,观察其生存期,进行统计,结果显示,Rab27A表达阳性的患者一年的生存率为38%,Rab27A表达阴性的患者一 年的生存率为70%,表明Rab27A表达阳性的患者较Rab27A表达阴性的患者总生存时间明显缩短(P<0.05);Rab27B表达阳性的患者一年的生存率为72%,Rab27B表达阴性的患者一年的生存率为30%,表明Rab27B表达阴性的患者较Rab27B表达阳性的患者总生存时间明显缩短(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物,所述标志物是exosome来源的Rab27A和/或Rab27B。
2.一种人类肝癌的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括Rab27A蛋白的单克隆抗体和Rab27A蛋白标准品。
3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述诊断试剂盒还包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品。
4.一种人类肝癌的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品。
5.一种判断人类肝癌预后的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括Rab27A蛋白的单克隆抗体和Rab27A蛋白标准品。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品。
7.一种判断人类肝癌预后的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括Rab27B蛋白的单克隆抗体和Rab27B蛋白标准品。
8.权利要求1所述的标志物在制备权利要求2-4中任一项所述的诊断试剂盒中的应用。
9.权利要求1所述的标志物在制备权利要求5-7中任一项所述的试剂盒中的应用。
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