CN106222127A - 粉末型细胞培养基的针磨生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种粉末型细胞培养基的针磨生产工艺，包括以下步骤：步骤一、将原料分种类称量，备用；步骤二、对步骤一中称量好的原料进行预混合；步骤三、将步骤二中预混合的原料使用针式研磨机对预混好的物料进行研磨粉碎；步骤四、将步骤三粉碎后的物料进行终混；步骤五、将步骤四中终混后的产品进行包装。本发明能实现细胞培养基的连续生产，一台体积很小的针磨设备就可以与大型球磨机的产能相当，占地面积小，能节约生产成本和生产时间，产量大，批间差小及产品性质稳定。

Description

粉末型细胞培养基的针磨生产工艺
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种粉末型细胞培养基的针磨生产工艺。
背景技术
合成细胞培养基是一种人工配制的适合细胞生长营养要求的混合物质，一般为从体液、血清消化液等天然成分配制而成的培养基，以及应用化学原料配制而成的合成培养基或综合培养基。从培养基的物理性质而论，可以分成加入凝固剂的固体培养基、液体培养基和粉末培养基。国内大部门的企业都是采用传统的球磨方式。球磨虽然结构简单，但钢珠的清洗及搬运费时费力，效率低下，工作噪音大，占地面积大，增加了生产成本和生产时间。另外，球磨工艺采用的是批次生产，造成单批产能有限，批与批之间的批间差较大，产品的稳定性不好。
国内疫苗、抗体产业不断发展，规模越来越大，细胞培养基的需求量也越来越大。如果继续采用球磨方式会很大程度降低培养基的年产能。针磨生产工艺其优势在于能实现细胞培养基的连续生产，一台体积很小的针磨设备就可以与大型球磨机的产能相当。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种粉末型细胞培养基的针磨生产工艺，本发明能实现细胞培养基的连续生产，一台体积很小的针磨设备就可以与大型球磨机的产能相当，占地面积小，能节约生产成本和生产时间，产量大，批间差小及产品性质稳定。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种粉末型细胞培养基的针磨生产工艺，包括以下步骤：
步骤一、将原料分种类称量，备用；
步骤二、对步骤一中称量好的原料进行预混合；
步骤三、将步骤二中预混合的原料使用针式研磨机对预混好的物料进行研磨粉碎；
步骤四、将步骤三粉碎后的物料进行终混；
步骤五、将步骤四中终混后的产品进行包装；
其中，步骤一中分类的原料包括：无机盐类、氨基酸类、维生素类、其它营养元素，所述无机盐类包括以下中的一种或几种：氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、四水硝酸钙、无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、六水氯化镁、无水磷酸二氢钾；所述氨基酸类包括以下中的一种或几种：丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、甲硫氨酸、天门冬氨酸、门冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸二钠盐；所述维生素类包括以下中的一种或几种：维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素H、叶酸、肌醇、D-泛酸钙、烟酰胺、谷胱甘肽、氯化胆碱、盐酸吡哆醛、维生素C、亚油酸、对氨基苯甲酸；所述其它营养元素包括以下中的一种或几种：无水葡萄糖、丙酮酸铵、微量元素、植物水解蛋白。
进一步地，步骤二中对称量后的原料使用二维运动混合机或三维运动混合机混合，混合时间为10-60min。
进一步地，步骤二中对称量后的原料使用三维运动混合机混合时，混合时间为20-40min。
进一步地，步骤三中使用针式研磨机对预混的物料进行研磨粉碎，粉碎的转速为15000r/min–30000r/min，粉碎时间为20-60min。
进一步地，步骤三的粉碎过程中，使用干冰或氮气进行降温处理，使粉碎过程中物料温度控制在20-50℃范围内。
进一步地，步骤四中使用二维运动混合机或三维运动混合机进行终混，终混的时间为20-60min。
进一步地，步骤五中对制备的产品进行包装的方式包括：无菌塑料桶、无菌尼龙袋、铝箔袋。
进一步地，本发明的针磨生产工艺适应于所有粉末型细胞培养基的生产，并且批次量根据实际培养基来调整，以及各组分的含量也根据不同的培养基调整。
本发明的有益效果是:
本发明能实现细胞培养基的连续生产，一台体积很小的针磨设备就可以与大型球磨机的产能相当，占地面积小，能节约生产成本和生产时间，产量大，批间差小及产品性质稳定。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是使用本发明的培养基培养的细胞图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
实施例1中采用针磨生产工艺，以制备DMEM/F12培养基为例。具体方法步骤如下。
步骤一、将原料分种类称量，备用；其中原料分种类称量如表1-4中所示：
表1：配方中无机盐
组分 含量(mg/L)
氯化钙 116.6
硫酸铜 0.0013
九水合硝酸铁 0.05
七水合硫酸亚铁 0.417
氯化钾 311.8
六水氯化镁 28.64
无水硫酸镁 48.84
氯化钠 6999.5
无水磷酸二氢钠 54.35
无水磷酸氢二钠 71.02
七水合硫酸锌 0.432
表2：配方中氨基酸
表3：配方中维生素
组分 含量(mg/L)
亚油酸 0.042
硫辛酸 0.105
D-生物素 0.0035
泛酸钙 2.24
氯化胆碱 8.98
叶酸 2.65
肌醇 12.6
烟酰胺 2.02
盐酸吡哆醛 2
维生素B6 0.031
维生素B2 0.219
维生素B1 2.17
维生素B12 0.68
表4：配方中其它元素
步骤二：对称量好的原料进行预混合
将称量好的四组原料按顺序加入三维运动混合机中。加料完成后，开启混合机，混合30分钟，使其在针磨粉碎前形成相对均一的物料。
步骤三：将预混好的原料进行粉碎
将预混好的相对均一的物料逐步加入针式研磨机中，转速调整至24000r/min，同时研磨机应开启液氮冷却系统，使物料温度控制在30℃-40℃，整个粉碎过程持续30分钟。粉碎结束后，关闭液氮冷却系统。
步骤四：将粉碎好的成品进行终混
将粉碎好的成品再加入三维运动混合机中。加料完成后，开启混合机，混合40分钟，以确保成品的均一性。
步骤五：将终混的成品进行包装
对终混好的成品进行包装，采用无菌塑料桶或内层无菌尼龙袋，外层无菌铝箔袋的方法进行包装，即得终产品。
性能测试：
依据国家化工行业标准《哺乳类动物细胞培养基》HG/T3935-2007进行检测
(1)澄清度
按照中华人民共和国药典2015年版二部附录IX B澄清度检查法，分别检测新制的实施例和市售球磨DMEM/F12干粉培养基和在室温、相对湿度50％的环境下储存30天后的实施例和市售球磨DMEM/F12干粉培养基与蒸馏水混合后形成的培养基液体。对于干粉培养基，取配制1升的用量，置于1000ml烧杯中，加水1000ml，搅拌至溶解。测试结果如下表所示：
表5澄清度测试表
从表5的结果可以看出，本实施例的干粉培养基无论是新制还是存储一段时间后，都能达到与市售的干粉培养基相同水平的澄清度。
(2)pH值
按照中华人民共和国药典2015年版二部附录VI H pH值测定法，用pH计分别检测新制的实施例和市售球磨DMEM/F12干粉培养基和在室温、相对湿度50％的环境下储存30天后的实施例和市售球磨DMEM/F12干粉培养基。对于干粉培养基，取配制1升的用量，置于1000ml烧杯中，加水1000ml，搅拌至溶解。测试结果如下表所示：
表6pH值测试结果表
从表6的结果可以看出，本实施例的干粉培养基无论是新制还是存储一段时间后，都比市售的干粉培养基稳定性更好。
(3)干燥失量
按照中华人民共和国药典2015年版二部附录VIII L干燥失重测定法，分别检测制的实施例和市售球磨DMEM/F12干粉培养基和在室温、相对湿度50％的环境下储存30天后的实施例和市售球磨DMEM/F12干粉培养基。测试结果如下表所示：
表7干燥失量测试结果表
从表7的结果可以看出，本实施例的干粉培养基无论是新制还是存储一段时间后，都能比市售的干粉培养基更稳定，更好。
(4)渗透压
按照中华人民共和国药典2015年版二部附录IX G渗透压摩尔浓度测定法，分别检测新制的实施例和市售球磨DMEM/F12干粉培养基和在室温、相对湿度50％的环境下储存30天后的实施例和市售球磨DMEM/F12干粉培养基。对于干粉培养基，取配制1升的用量，置于1000ml烧杯中，加水1000ml，搅拌至溶解。测试结果如下表所示：
表8渗透压测试结果表
从表8的结果可以看出，本实施例的干粉培养基无论是新制还是存储一段时间后，都能达到与市售的干粉培养基相同水平。
(5)细菌内毒素
按照中华人民共和国药典2015年版附录XI E细菌内毒素检查法中的凝胶法，分别检测新制的实施例和市售球磨DMEM/F12干粉培养基和在室温、相对湿度50％的环境下储存30天后的实施例和市售球磨DMEM/F12干粉培养基。对于干粉培养基，取配制1升的用量，置于1000ml烧杯中，加水1000ml，搅拌至溶解。取0.1ml培养基(液体)加入细菌内毒素检查用水(美国ACC)3.9ml，混匀即得试验溶液。测试结果如下表所示：
表9细菌内毒素测试结果表
从表9的结果可以看出，本实施例的干粉培养基无论是新制还是存储一段时间后，都能达到与市售的干粉培养基相同水平。符合本行业标准对内毒素水平的要求(＜10EU/ml)。
(6)微生物限度
按中华人民共和国药典2015年版附录XI J微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数，检查法为平皿法。取干粉培养基样品10g，加入pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液摇匀至充分溶解，混合即得试验溶液。测试结果如下表所示：
表10微生物限度测试结果表
从表10的结果可以看出，本实施例的干粉培养基无论是新制还是存储一段时间后，都能达到与市售的干粉培养基相同水平。符合本行业标准对微生物限度的要求(＜200CFU/g的细菌)。
(7)细胞生长实验
将实施例和市售球磨DMEM/F12干粉培养基分别取1L量，溶于900ml超纯水中，向所得混合物中加入100ml小牛血清混合，然后用超纯水定容至1000ml。使用0.20μm的滤菌膜过滤灭菌，即得培养液。
在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述两种培养液转移到T25细胞培养瓶中，接种Vero细胞悬液，接种密度为5×104细胞/cm2。然后在(37±1)℃温度条件及(5±0.1)％二氧化碳体积分数条件下进行贴壁培养，培养72h，观察细胞形态，并计数。培养结果见表11，细胞培养72小时的照片见图1。由图1可以看出，被培养的细胞密度大，细胞轮廓清晰。
表11细胞生长实验表
从以上结果可以看出，本发明所制的培养基与市售球磨干粉培养基的性质并无差异，某些指标甚至优于市售球磨干粉培养基。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种粉末型细胞培养基的针磨生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将原料分种类称量，备用；
步骤二、对步骤一中称量好的原料进行预混合；
步骤三、将步骤二中预混合的原料使用针式研磨机对预混好的物料进行研磨粉碎；
步骤四、将步骤三粉碎后的物料进行终混；
步骤五、将步骤四中终混后的产品进行包装；
其中，步骤一中分类的原料包括：无机盐类、氨基酸类、维生素类、其它营养元素，所述无机盐类包括以下中的一种或几种：氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、四水硝酸钙、无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、六水氯化镁、无水磷酸二氢钾；所述氨基酸类包括以下中的一种或几种：丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、甲硫氨酸、天门冬氨酸、门冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸二钠盐；所述维生素类包括以下中的一种或几种：维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素H、叶酸、肌醇、D-泛酸钙、烟酰胺、谷胱甘肽、氯化胆碱、盐酸吡哆醛、维生素C、亚油酸、对氨基苯甲酸；所述其它营养元素包括以下中的一种或几种：无水葡萄糖、丙酮酸铵、微量元素、植物水解蛋白。
2.根据权利要求1所述的粉末型细胞培养基的针磨生产工艺，其特征在于，步骤二中对称量后的原料使用二维运动混合机或三维运动混合机混合，混合时间为10-60min。
3.根据权利要求2所述的粉末型细胞培养基的针磨生产工艺，其特征在于，步骤二中对称量后的原料使用三维运动混合机混合时，混合时间为20-40min。
4.根据权利要求1所述的粉末型细胞培养基的针磨生产工艺，其特征在于，步骤三中使用针式研磨机对预混的物料进行研磨粉碎，粉碎的转速为15000r/min–30000r/min，粉碎时间为20-60min。
5.根据权利要求4所述的粉末型细胞培养基的针磨生产工艺，其特征在于，步骤三的粉碎过程中，使用干冰或氮气进行降温处理，使粉碎过程中物料温度控制在20-50℃范围内。
6.根据权利要求1所述的粉末型细胞培养基的针磨生产工艺，其特征在于，步骤四中使用二维运动混合机或三维运动混合机进行终混，终混的时间为20-60min。
7.根据权利要求1所述的粉末型细胞培养基的针磨生产工艺，其特征在于，步骤五中对制备的产品进行包装的方式包括：无菌塑料桶、无菌尼龙袋、铝箔袋。
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