CN106191280A - 基于粪便和毛发的棕熊鉴定方法及所用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于动物粪便和毛发的棕熊鉴定试剂盒，试剂盒中含有鉴定所用的特异性引物对为：5'‑GCTTATTTATCTTTCACGGG‑3'，5'‑TGTGCATAGGCTCCTTGAAG‑3'。本发明还同时公开了利用上述试剂盒进行的基于动物粪便和毛发的棕熊鉴定方法，包括以下步骤：1)、以动物的粪便或毛发作为待测动物样品，从待测动物样品中获得DNA；2)、将所得的DNA利用特异性引物对进行PCR扩增，3)、利用所得的扩增产物进行判定：当扩增产物为486bp的片段时，判定待测动物为棕熊；反之，则判定待测动物不是棕熊。

Description

基于粪便和毛发的棕熊鉴定方法及所用试剂盒

技术领域

本发明涉及棕熊的鉴定操作及检测技术，具体涉及一种利用动物粪便和毛发的棕熊鉴定方法，以及由此组装的试剂盒和使用方法。

背景技术

棕熊是陆地上食肉目体形最大的哺乳动物之一，也被称为灰熊。棕熊也是杂食性动物，适应能力强，主要分布于北半球，从荒漠边缘至高山森林，甚至冰原地带都有其生活的踪迹。北美地区的棕熊生活在开阔地带，主要分布在苔原区域和高山草甸，在海岸线附近也常能见到它们的足迹。而欧亚大陆的棕熊则更喜欢居于茂密的森林之中，方便捕食和隐藏。

棕熊在消灭鼠害、防止疫病蔓延以及维持生态平衡等方面具有重要作用。根据种属地区分布，目前棕熊被分为20个亚种，我国主要有三个亚种，即东北棕熊、藏棕熊和喜马拉雅棕熊。中国境内的三个亚种均被列为国家二级重点保护野生动物名录和濒危动植物国际贸易公约，严禁国际间随意贸易。棕熊属于受贸易威胁的动物之一，种群数量在近年来不断下降。据统计，2012年全世界棕熊的数量估计在10万头左右，在西亚、西南亚、中国西藏和克什米尔地区的棕熊已经濒临绝迹，欧洲棕熊在原有分布的地区已经大面积灭绝了。随着人类变迁和农业生产的不断扩大，棕熊的分布面积日趋减少。据调查，2004年我国已知藏棕熊总量16648只，大部分分布于青海省可可西里及周边地区。藏棕熊是青藏高原特有的棕熊亚种，主要生活在青海和西藏地区的高原地带，虽为杂食性但以动物性食物为主，主要以高原鼠兔、野牦牛和藏羚羊为主。人类活动和野生环境的破坏以及盗猎成为棕熊数量急剧减少的重要因素，保护棕熊和禁止任何棕熊来源及产品的贸易已经纳入我国法律。

但另一方面，为明确棕熊的数量的分布就要对其数量和活动范围进行调查，对于棕熊等野生动物的资源调查一般采取人工调查的方法，主要方法有固定样线调查或跟踪观察、粪便形态识别等，这些方法费时费力，还可能错过最佳调查时机。为进一步做好棕熊的数量和生态行为调查研究，同时也为打击盗猎及使用棕熊产品提供鉴定方面的技术支持，开展棕熊的有效保护，本发明建立了一种可用野外收集的毛发和粪便为鉴定材料的棕熊识别技术，本技术可为野外棕熊调查提供样品的鉴定技术，也可为打击棕熊的非法盗猎物品提供鉴定技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于动物粪便和毛发的棕熊鉴定方法及所用的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于动物粪便和毛发的棕熊鉴定试剂盒，试剂盒中含有鉴定所用的特异性引物对为：

5'-GCTTATTTATCTTTCACGGG-3'(SEQ ID NO:1)，

5'-TGTGCATAGGCTCCTTGAAG-3'(SEQ ID NO:2)。

作为本发明的基于动物粪便和毛发的棕熊鉴定试剂盒的改进：试剂盒中还含有PCR buffer、dNTP、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、18S rRNA基因引物及双蒸水。

本发明还同时提供了利用上述试剂盒进行的基于动物粪便和毛发的棕熊鉴定方法，包括以下步骤：

1)、以动物的粪便或毛发作为待测动物样品，从待测动物样品中获得DNA；

2)、将步骤1)所得的DNA利用特异性引物对进行PCR扩增，

3)、利用步骤2)所得的扩增产物进行判定：

当扩增产物为486bp的片段时，判定待测动物为棕熊；

反之，则判定待测动物不是棕熊。

作为本发明的棕熊鉴定方法的改进：

步骤2)的PCR扩增体系为：

2.0μL的Buffer缓冲液(10×，含20mM的MgCl₂)，各0.1μL～4μL的特异性引物对(如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2所示，浓度均为10μM)，0.5μL～4μL的dNTP mix(浓度2.5mM)，1.0μL～5μL基因组DNA提取液(约10～20ng DNA)，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，加水(双蒸水，ddH₂O)补充至20μL；

PCR反应程序为：

95℃变性5min；95℃变性30s，58℃～62℃退火30s～40s，72℃延伸30s～40s为一个循环，共计26～35个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃。

作为本发明的棕熊鉴定方法的进一步改进：

PCR扩增体系为：

PCR反应体系20μL，其中Buffer缓冲液(10×，含20mM的MgCl₂)2.0μL，特异性引物对(如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示，浓度均为10Μm)各2.0μL，dNTP mix(2.5μM)1.2μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板2μL(约含10～20ng DNA)，补水至20.0μL；

PCR反应程序为：

95℃变性5min；95℃变性30s，62℃退火32s，72℃延伸35s为一个循环，共计31个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃。

作为本发明的棕熊鉴定方法的另一种改进：

所述步骤2)中设置阳性和阴性对照；以真核生物的18S rRNA基因为阳性对照，不含任何来源DNA的反应体系为阴性对照。

作为本发明的棕熊鉴定方法的进一步改进：

PCR扩增体系为：

2.0μL的Buffer缓冲液(10×，含20mM的MgCl₂)，各0.5～2μL的特异性引物对(如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示，浓度均为10μM)，各0.5μL～2μL的18S rRNA基因上游、下游引物(浓度均为10μM)，1.6μL的dNTP mix(浓度25mM)，2.0μL基因组DNA提取液(约10～20ng DNA)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，加水(双蒸水，ddH₂O)补充至20μL。

PCR反应程序为：

95℃变性5min；95℃变性30s～50s，58℃～63℃退火30s～45s，72℃延伸30s～45s为一个循环，共计28～35个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃。

作为本发明的棕熊鉴定方法的进一步改进：

PCR扩增体系为：

2.0μL的Buffer缓冲液(10×，含20mM的MgCl₂)，各2μL的特异性引物对(如SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2，浓度均为10μM)，0.6μL的18S rRNA基因上游、下游引物(浓度均为10μM)，1.6μL的dNTP mix(浓度2.5mM)，2.0μL基因组DNA提取液(约10～20ng DNA)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，加水补充至20μL；

PCR反应程序为：

95℃变性5min；95℃变性35s，61.3℃退火35s，72℃延伸35s为一个循环，共计30个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃。

作为本发明的棕熊鉴定方法的进一步改进：

18S rRNA基因扩增引物序列为：

上游引物：5'-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGG-3'

下游引物：5'-TAATTTGCGCGCCTGCTG-3'。

本发明的粪便和毛发是否来自棕熊的特异性PCR鉴定方法技术，即利用粪便和毛发为材料进行棕熊的鉴定，同时与棕熊的主要食源性动物，如鼠兔、野牦牛和藏羚羊等无交叉反应，具有较高的特异性。本发明还提供了含有棕熊特异性PCR鉴定试剂及操作方法的试剂盒。具体地，本发明提供了一对用于棕熊的特异性核苷酸序列的鉴定引物，经过PCR反应后，依据产物大小和有无可以鉴定粪便和毛发及其他样品是否来自棕熊。获得产物大小为486bp的片段，即判定为棕熊；其它动物则无此特异性片段，因此电泳后依据产物大小和有无即可判定样品是否来自棕熊。

在本发明中：

用商用试剂盒或按照常规分子生物学的方法(酚-氯仿提取法参见《分子克隆实验指南》第三版，上册：463-485)以及实验室其他常规分子生物学技术，对粪便及毛发样品以及肌肉样品进行DNA提取，也可采取对粪便处理后富集粪便中细胞的方法再行DNA提取处理。

PCR产物用2％琼脂糖进行电泳检测或其他等同检测方法；获得对应PCR产物阳性者即来源于棕熊的样品，反之则排除。

为进一步提高准确性和鉴定效果，本发明的试剂盒中还引物入了真核生物18SrRNA基因引物作为阳性对照，(18S rRNA基因引物序列源自于参考文献：Fajardo V,Gonzalez I,Martin I,et al.Real-time PCR for detection and quantification ofred deer(Cervus elaphus),fallow deer(Dama dama),and roe deer(Capreoluscapreolus)in meat mixtures.Meat Sci,2008,79(2):289-298.)组成双重PCR。

本发明在发明过程中，进行了如下所述的实施例：

NCBI数据库下载并比较棕熊与鼠兔、兔狲、牦牛、羚羊、鸡、家牛、绵羊、兔、鼠、骆驼、梅花鹿和猪的线粒体DNA全序列，选择棕熊特异性序列作为上下游引物的设计区域，其引物序列为SEQ ID1和SEQ ID2。

采集棕熊、高原鼠兔、兔狲、牦牛、藏羚羊、金钱豹、鸡、家牛、绵羊、家兔、小鼠、双峰驼、梅花鹿和家猪的动物组织作为方法建立的标准品，按照动物组织基因组DNA提取试剂盒操作方法，提取基因组DNA，或者参照分子克隆的DNA提取方法，从组织样品中获得DNA，溶于TE溶液中保存备用。

本发明人对棕熊有多年的野外调查经验，同时也从事棕熊样品实验室的分析与鉴定工作。多年来积累了大量疑似棕熊的粪便和毛发样品，由于存放时间和保存方法不同，这些收集的粪便和毛发样品已经无法从外形判定其来源。发明人经过对多种动物线粒体基因组的对比和引物设计筛选与优化过程，并在不断测试的基础上，选择了棕熊的特异性序列作为鉴定的靶标，还和18S rRNA引物组成了双重PCR体系，以提高检测的效率和准确性。测试果验证明，使用本发明建立的PCR扩增方法能够对来自棕熊的肉类组织、粪便和毛发来源样品实施鉴定，同时完全能够与其他常见动物和棕熊食源性动物鉴别开来。结合商用粪便和毛发样品DNA提取试剂盒或相应分子生物学技术，本发明提高了疑似棕熊粪便和毛发的鉴定准确度，为科研工作者提供了棕熊鉴定的分子生物学技术手段。

棕熊属于我国国家二级保护动物，目前对于棕熊的分布和生态习性以及种群的数量调查和分布研究多采用观察法，对其所留的粪便和毛发往往难以根据形态进行鉴定，从而降低了棕熊研究的工作效率与调查的精准度，人为选择路线跟踪调查则增加了人力成本和被熊攻击的危险。本发明对粪便和毛发等来源样品提供了实验室鉴定技术，与形态学鉴定技术相比，可以更准确地为样品提供是否来自棕熊的证据，且不受棕熊食源性动物样品的影响。本发明基于最基本的PCR技术和实验设备，适于目前大多数实验室应用，且操作简单，是一种简便的利用棕熊粪便和毛发进行物种鉴定的技术。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为实施例4的特异性测试结果；

泳道M为DNA分子量标准，1为棕熊DNA的阳性对照，2-6分别为鼠兔、兔狲、牦牛、羚羊和鸡。N为阴性对照。

图2为本发明建立的棕熊特异性鉴定引物和18S rRNA基因双重PCR结果。

图中泳道M为DNA分子量标准，1和2为棕熊DNA的阳性对照，泳道3-15分别为高原鼠兔、兔狲、牦牛、藏羚羊、金钱豹、鸡、家牛、绵羊、家兔、小鼠、双峰驼、梅花鹿和家猪。N为阴性对照。

本方法引入18S rRNA基因作为对照，当样品为阳性时PCR产物有棕熊特异性条带和18S rRNA基因产物；样品为阴性时只有18S rRNA基因产物，无18S rRNA基因产物时则说明实验失败，需要重新鉴定。结果表明，引物能够特异性扩增棕熊样品，与棕熊食源性动物及常见其它物种无交叉反应。

图3是实施例6的毛发和粪便样品的双重PCR检测；

泳道M为DNA分子量标准，1和6分别为阳性和阴性对照，2-5为毛发样品，7-16为粪便样品。图中结果显示，毛发样品2和粪便样品13、16号为棕熊样品，其它均非棕熊来源的样品。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法过程做进一步说明，但实例仅限于说明，并不限于实例中的操作。下列实施过程中具体条件和尚未注明的实验方法，通常可按常规条件进行，如《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1、材料收集及DNA提取

在青海省西宁市林业局救助站采集两头藏棕熊的肌肉、毛发和粪便，样品作为标准品。同时由青海省西宁市林业局管理处提供藏棕熊保护区的高原鼠兔、貂、金钱豹、兔狲、野牦牛、藏羚羊的肌肉样品。收集的所有肌肉样品用无水乙醇浸泡后带回实验室，毛发自然状态装入密封袋保存，粪便自然干燥后装入密封袋保存。东北棕熊和马来熊的样品为杭州野生动物园馈赠。同时，以实验室保存的常见肉用动物DNA样本作为对照，包括鸡、家牛、绵羊、家兔、小鼠、双峰驼、梅花鹿和家猪。

肌肉组织使用动物组织DNA提取试剂盒(Takara产品)，按照操作说明进行DNA提取。熊的毛发使用微量样品基因组提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取毛发DNA，粪便基因组提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取粪便样品的DNA。所有提取的DNA溶解于TE缓冲液中，经Nanodrop 2000检测，检测结果表明肌肉提取的DNA浓度在20-400ng/μL，毛发和粪便提取的DNA浓度在2-80ng/μL，把纯度较好及A₂₆₀/A₂₈₀＝1.8～2.0之间的样品，稀释至10ng/μL放置于4℃冰箱备用。DNA提取质量较差的重复本操作，直至达到要求。

实施例2、引物设计

根据GenBank数据库的基因序列，以棕熊线粒体DNA(mtDNA)全序列(EU497665，AF303110，GU573471，GU573491)为参照，并比较黑熊(AF303109)、洞熊(FN390869)和北极熊(JX196383)的mtDNA全序列，选择棕熊的特异性序列，并和兔狲、野牦牛、羚羊、鸡、家牛、绵羊、家兔、小鼠、骆驼、梅花鹿和家猪的mtDNA全序列对比，根据其基因序列的特异性和保守性，设计棕熊的特异性引物，预期扩增产物长度486bp。经Blast与NCBI数据库对比后确认该引物与上述物种无交叉反应，引物序列如下所示。

上游引物SEQ ID 1：5'-GCTTATTTATCTTTCACGGG-3'

下游引物SEQ ID2：5'-TGTGCATAGGCTCCTTGAAG-3'

引物可由杭州擎科生物技术有限公司合成。

实施例3、PCR扩增条件优化及检测

为测试设计引物的PCR扩增效率，参照DNATaq酶(KaKara产品)使用说明，配制基础PCR体系并进行退火温度的优化，其PCR体系和反应程序如下：

PCR反应体系20μL，其中Buffer缓冲液(10×，含20mM的MgCl₂)2.0μL，引物SEQ IDNO 1和引物SEQ ID NO 2(浓度均为10μM)各2.0μL，dNTP mix(2.5μM)1.2μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，棕熊DNA模板2μL(约含20ng DNA)，ddH₂O补充至20.0μL。

在梯度PCR仪上设置温度梯度和其他参数，程序如下：95℃变性5min；95℃变性30s，55±8℃退火25～40s，72℃延伸28～45s为一个循环，共计26～35个循环；然后72℃保持5min。结束后降温至4℃。

PCR产物经2％琼脂糖电泳检测，4S Red核酸染料按照说明书添加至融化的凝胶中。90V恒压电泳30min后凝胶成像系统下拍照观察。结果表明，PCR扩增后产物经电泳结果显示，退火温度在58℃～63℃之间、退火时间28～40s，延伸30～45s，循环数29～35个条件下均获得清晰的PCR产物带，其PCR产物大小与DNA分子量标准500bp大小接近。随后选取最优温度62℃作为退火温度，PCR反应体系不变的情况下进行再次扩增，其具体PCR程序如下：

95℃变性5min；95℃变性30s，62℃退火32s，72℃延伸35s为一个循环，共计31个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃。

PCR产物经2％琼脂糖电泳检测，4S Red核酸染料按照说明书添加至融化的凝胶中。90V恒压电泳30min后凝胶成像系统下拍照观察。经PCR扩增后电泳结果显示PCR产物大小与DNA分子量标准500bp大小接近，与预期大小486bp一致。阳性PCR产物用胶回收试剂盒回收纯化，进行测序。测序后的结果序列到NCBI数据库进行最大似然法对比，鉴定为棕熊(EU497665)，相似系数99.8％。

PCR产物测序结果如下：

gcttatttatctttcacgggtcgggcatagatacccataaggggttactcagtcaatggtcgcaggacatatagtacataaacgccactaaatcgaacgaacgacgcacgtatacgcatacgtacgcatacgtacgcatacgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcacgtgtacgcgtacgcacgcgtttttagatattaacttagcttaatcaaaccccccttaccccccgtaacttcaaggagcctatgcaca。

实施例4、PCR特异性测试

特异性测试即使用棕熊的特异性引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的PCR体系对高原鼠兔、兔狲、藏羚羊、金钱豹、貂、鸡、家牛、绵羊、家兔、小鼠、双峰驼、梅花鹿和家猪以及鸭、鱼、狗的基因组DNA进行扩增反应，依据有无PCR产物判定特异性。PCR反应体系20μL，其中Buffer缓冲液(10×，含20mM的MgCl₂)2.0μL，引物SEQ ID NO 1和引物SEQ ID NO 2(浓度均为10μM)各2.0μL，dNTP mix(2.5μM)1.2μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板2μL(约含20ng DNA)，ddH₂O补充至20.0μL。其PCR程序为：95℃变性5min；95℃变性30s，62℃退火32s，72℃延伸35s为一个循环，共计31个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃。

结果证明除了藏棕熊之外其他动物均无PCR扩增产物，即无交叉反应，结果如图1所示。使用东北棕熊的DNA重复上述实验，结果仍如图1所述。这一结果表明对棕熊之外的物种均无非特异性PCR扩增。

实施例5、双重PCR鉴定方法的建立

本发明中设计的棕熊特异性鉴定引物可以有效鉴定棕熊源性成分，同时与其他物种的DNA无交叉反应，但是在检测中要设置阴性和阳性对照，阳性对照需使用棕熊阳性DNA样品，这无疑增加了检测成本，也给检测增加了工作量。为了进一步提高检测效率和准确性，本发明把阳性对照体系进行了改进，加入了一对18S rRNA引物组成双重PCR，该引物能够扩增所有高等动物的mtDNA基因片段，得到140bp的产物，且经过条件优化后得知，只要稍微改变原来检测体系的反应条件和试剂即可实现，即在原来的PCR反应体系中添加18SrRNA基因上下游引物各0.5～2.0μL的引物(浓度均为10μM)，同时相应地减少体系中的水即可。两对引物组成的双重PCR体系保持原有引物的特异性。双重PCR反应完成后阳性样品能同时得到特异性产物和18S rRNA基因的参照产物，阴性样品则只有18S rRNA的参照产物，若检测中无扩增产物则DNA提取失败或其他原因造成检测失败，需要重新鉴定。

18S rRNA基因扩增引物序列如下：

上游引物：5'-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGG-3'

下游引物：5'-TAATTTGCGCGCCTGCTG-3'。

2.0μL的Buffer缓冲液(10×，含20mM的MgCl₂)，SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2(浓度均为10μM)各2μL，18S rRNA基因上游和下游引物(浓度均为10μM)各0.6μL，1.6μL的dNTPmix(浓度25mM)，2.0μL基因组DNA提取液(约20ng的基因组DNA)，Taq DNA聚合酶0.2μL(5U/μL)，加水(双蒸水)补充至20μL。

95℃变性5min；95℃变性35s，61.3℃退火35s，72℃延伸35s为一个循环，共计30个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃。

双重PCR产物经2％琼脂糖电泳检测，4S Red核酸染料按照说明书添加至融化的凝胶中。90V恒压电泳30min后凝胶成像系统下拍照观察，结果如图2所示。图中样品1和2为藏棕熊和东北棕熊，PCR产物电泳结果同时可见特异性产物和18S rRNA基因的参照产物，其他物种则只有18S rRNA基因的参照产物，均未见特异性产物。说明本发明的方法具有良好的特异性。

实施例6、野外收集样品的鉴定

对野外收集的疑似来自棕熊的20份粪便和12份毛发样品用试剂盒提取DNA后，用双重PCR进行鉴定，其方法如实施例5所述，鉴定结果显示有1份毛发来自棕熊，2份粪便来自棕熊(图3)。从图3应用双重PCR体系鉴定结果来看，本检测中加入的阳性对照与检出的阳性样品完全一致，阴性样品则只有对照PCR产物，说明本发明能够很好的鉴定棕熊来源的粪便和毛发样品，为棕熊的野外调查提供了重要帮助。

结果表明泳道2、13和16号样品来自棕熊。

验证实验1、对实现已知来自东北棕熊、藏棕熊、喜马拉雅棕熊、北极熊、马来熊以及黑熊的粪便或毛发按照实施例5所述方法进行检测，所得结果如表1和表2所述。

表1、粪便的检测结果

	结果
		东北棕熊	能同时得到486bp、140bp的条带
藏棕熊	能同时得到486bp、140bp的条带
		喜马拉雅棕熊	能同时得到486bp、140bp的条带
北极熊	只能得到140bp的条带，不能得到486bp的条带
		马来熊	只能得到140bp的条带，不能得到486bp的条带
黑熊	只能得到140bp的条带，不能得到486bp的条带

表2、毛发的检测结果

	结果
		东北棕熊	能同时得到486bp、140bp的条带
藏棕熊	能同时得到486bp、140bp的条带
		喜马拉雅棕熊	能同时得到486bp、140bp的条带
北极熊	只能得到140bp的条带，不能得到486bp的条带
		黑熊	只能得到140bp的条带，不能得到486bp的条带
马来熊	只能得到140bp的条带，不能得到486bp的条带

发明人在发明过程中，还进行过如下的实验：

根据GenBank数据库的基因序列，以棕熊线粒体DNA(mtDNA)全序列为参照，并比较黑熊和北极熊的mtDNA全序列，根据其基因序列的特异性和保守性，设计3对棕熊的特异性引物，引物序列与预期扩增产物长度如下表3所示。

表3

对比试验1：

以上述表3中的3种引物对分别替代实施例5中的本发明的特异引物，其余等同于实施例5，经PCR条件优化。经过优化后的三对引物A、B和C，与18S rRNA引物分别组成双重PCR并进行再次优化。以此方法检测验证实验1中所用的东北棕熊、藏棕熊、喜马拉雅棕熊、黑熊、马来熊、北极熊的粪便或毛发，所得结果如下表4：

表4

结果表明引物对A与所测试的东北棕熊、藏棕熊、喜马拉雅棕熊、黑熊、马来熊、北极熊的DNA样品均有PCR产物，但棕熊的特异性产物为486bp，而其他熊的特异性产物为492bp，二者在2％琼脂糖电泳中难以区分大小。另外，棕熊的PCR产物486bp的条带亮度不足。究其原因，通过测序结果对比发现，该引物对中下游引物A1与棕熊的DNA存在一个碱基的错配，可能使之扩增效率降低，同时黑熊与马来熊的DNA模板中存在一个6bp的插入序列，因此产生了插入/缺失片段多态性，二者存在长度差异。其次，引物对B只能扩增棕熊之外的熊类DNA模板而不能扩增棕熊DNA，测序结果及对比分析发现其上游引物B的序列与黑熊、马来熊和北极熊的DNA模板配对区间刚好是棕熊DNA序列缺失区段，因此不能与模板DNA配对，故此不能扩增。引物对C对所有棕熊的DNA均能实现扩增，但高度保守性又难以鉴别熊的种类。

以上测试说明经过优化筛选，本发明所用的上游引物SEQ ID NO 1和下游引物SEQID NO 2能够特异性的扩增棕熊样品来源的DNA，是棕熊物种鉴定的较佳选择。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 中国计量大学

<120> 基于粪便和毛发的棕熊鉴定方法及所用试剂盒

<160> 2

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性引物对的上游引物

<400> 1

gcttatttat ctttcacggg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性引物对的下游引物

<400> 2

tgtgcatagg ctccttgaag 20

Claims (9)

1.基于动物粪便和毛发的棕熊鉴定试剂盒，其特征是：试剂盒中含有鉴定所用的特异性引物对为：

5'-GCTTATTTATCTTTCACGGG-3'，

5'-TGTGCATAGGCTCCTTGAAG-3'。

2.根据权利要求1所述的基于动物粪便和毛发的棕熊鉴定试剂盒，其特征是：试剂盒中还含有PCR buffer、dNTP、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、18S rRNA基因引物及双蒸水。

3.利用权利要求1或2所述试剂盒进行的基于动物粪便和毛发的棕熊鉴定方法，其特征是包括以下步骤：

1)、以动物的粪便或毛发作为待测动物样品，从待测动物样品中获得DNA；

2)、将步骤1)所得的DNA利用特异性引物对进行PCR扩增，

3)、利用步骤2)所得的扩增产物进行判定：

当扩增产物为486bp的片段时，判定待测动物为棕熊；

反之，则判定待测动物不是棕熊。

4.根据权利要求3所述的棕熊鉴定方法，其特征是：

步骤2)的PCR扩增体系为：

2.0μL的Buffer缓冲液，各0.1μL～4μL的特异性引物对，0.5μL～4μL的dNTP mix，1.0μL～5μL基因组DNA提取液，Taq DNA聚合酶0.2μL，加水补充至20μL；

PCR反应程序为：

95℃变性5min；95℃变性30s，58℃～62℃退火30s～40s，72℃延伸30s～40s为一个循环，共计26～35个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃。

5.根据权利要求4所述的棕熊鉴定方法，其特征是：

PCR扩增体系为：

PCR反应体系20μL，其中Buffer缓冲液2.0μL，特异性引物对各2.0μL，dNTP mix1.2μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，DNA模板2μL，补水至20.0μL；

PCR反应程序为：

95℃变性5min；95℃变性30s，62℃退火32s，72℃延伸35s为一个循环，共计31个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃。

6.根据权利要求3所述的棕熊鉴定方法，其特征是：

所述步骤2)中设置阳性和阴性对照；以真核生物的18S rRNA基因为阳性对照，不含任何来源DNA的反应体系为阴性对照。

7.根据权利要求6所述的棕熊鉴定方法，其特征是：

PCR扩增体系为：

2.0μL的Buffer缓冲液，各0.5～2μL的特异性引物对，各0.5μL～2μL的18S rRNA基因上游、下游引物，1.6μL的dNTP mix，2.0μL基因组DNA提取液，Taq DNA聚合酶0.2μL，加水补充至20μL；

PCR反应程序为：

95℃变性5min；95℃变性30s～50s，58℃～63℃退火30s～45s，72℃延伸30s～45s为一个循环，共计28～35个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃。

8.根据权利要求7所述的棕熊鉴定方法，其特征是：

PCR扩增体系为：

2.0μL的Buffer缓冲液，各2μL的特异性引物对，0.6μL的18S rRNA基因上游、下游引物，1.6μL的dNTP mix，2.0μL基因组DNA提取液，Taq DNA聚合酶0.2μL，加水补充至20μL；

PCR反应程序为：

95℃变性5min；95℃变性35s，61.3℃退火35s，72℃延伸35s为一个循环，共计30个循环；然后72℃保持5min；结束后降温至4℃。

9.根据权利要求7或8所述的棕熊鉴定方法，其特征是：

18S rRNA基因扩增引物序列为：

上游引物：5'-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGG-3'

下游引物：5'-TAATTTGCGCGCCTGCTG-3'。