CN106191148A - (r)‑3‑氨基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法 - Google Patents

(r)‑3‑氨基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种(R)‑3‑氨基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其以3‑羰基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁酸叔丁酯为底物，在转氨酶、氨基供体、辅因子及助溶剂存在下，发生反应生成目标产物(R)‑3‑氨基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁酸叔丁酯，所述的反应在pH为6.0~10.0的水相缓冲溶液中进行。本发明首次利用转氨酶将3‑羰基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁酸叔丁酯转化为(R)‑3‑氨基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁酸叔丁酯，与现有技术相比，本工艺底物稳定性好，酶转化率高，操作简单方便，后续产物无蛋白残留，更绿色经济，且产物的光学活性高。

Description

(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备 方法
技术领域
本发明涉及生物制药和绿色化学技术领域，具体涉及一种(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法。
背景技术
手性药物3-氨基-1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁烷-1-酮是Merck公司的治疗糖尿病药物西他列汀(Sitagliptin，商品名JANUVIA)。其手性氨基可以由手性砌块(R)-3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯(2)提供，因此，化合物2可以作为西他列汀的重要手性前体。
利用转氨酶生产手性胺具有成本低同时高效环保等特点，专利US 20120329108等报道了对底物3-羰基-1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁烷-1-酮的转氨反应，专利CN 201210555608.1报道了对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的转氨反应，但是到目前为止，还未有利用转氨酶将3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯(1)转化为3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的报道。
专利US 20120329108报道的酶转化工艺用在原料药合成的最后一步,因有残留蛋白风险,分离成本高。CN 201210555608报道的是用甲酯或乙酯作为底物,但是其稳定性较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用转氨酶将3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯转化为(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯为底物，在转氨酶、氨基供体、辅因子及助溶剂存在下，发生反应生成目标产物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯，所述的反应在pH为6.0～10.0的水相缓冲溶液中进行。
优选地，所述的转氨酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司的牌号为EW1101的转氨酶。
优选地，在起始反应体系中，所述转氨酶：所述氨基供体：所述辅因子：所述底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的投料质量比为0.05-0.15:1-1.5:0.005-0.015:1。
优选地，所述的氨基供体为异丙胺。
优选地，所述的助溶剂为吐温60、DMSO或其组合。
优选地，所述助溶剂的投料体积为反应总体积的10％-25％。
优选地，所述的辅因子为磷酸吡哆醛。
优选地，所述反应在pH为9.5的水相缓冲溶液中进行。
优选地，所述的缓冲溶液为三乙醇胺-盐酸缓冲溶液。
优选地，具体实施过程如下：在反应容器中依次加入所述的水相缓冲溶液、底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯、氨基供体、助溶剂、辅因子和转氨酶，搅拌均匀，在25-45℃和氮气吹扫的条件下，HPLC检测反应进程，当转化率达90-99％时，调节反应体系pH至2-3，硅藻土过滤，并在滤液中加入乙酸乙酯进行多次萃取，旋转蒸发脱去溶剂后得到(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯产品。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明采用了转氨酶将3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯转化为(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯，整个制备过程中，底物稳定性好，酶转化率高，操作简单方便，后续产物无蛋白残留，且产物的光学活性高。
具体实施方式
本发明的反应式如下：
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
实施例1
于20mL三口烧瓶中，依次加入0.1M pH 9.5三乙醇胺-盐酸缓冲溶液3.2mL，底物500mg，异丙胺900μL，吐温60 0.4mL，DMSO 0.4mL，磷酸吡哆醛(PLP)5mg，转氨酶EW1101(苏州汉酶生物技术有限公司)50mg，于30℃，200rpm搅拌桨搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，滴加4M异丙胺控制pH于9.5，反应24h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至2-3，硅藻土过滤，加入等体积乙酸乙酯萃取两次，旋转蒸发得到产物90mg，纯度98％，光学纯度>99％。
实施例2
于反应器中，依次加入0.1M pH 9.5三乙醇胺-盐酸缓冲溶液3.2L，底物500g，异丙胺900mL，吐温60 0.4L，DMSO 0.4mL，磷酸吡哆醛(PLP)5g，转氨酶EW1101(苏州汉酶生物技术有限公司)50g，于30℃，机械搅拌，0.01MPa氮气吹扫的条件下，滴加4M异丙胺控制pH于9.5，反应24h，HPLC检测转化率95％。加入盐酸调节pH至2-3，硅藻土过滤，加入等体积乙酸乙酯萃取两次，旋转蒸发得到产物90g，纯度98％，光学纯度>99％。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：其以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯为底物，在转氨酶、氨基供体、辅因子及助溶剂存在下，发生反应生成目标产物R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯，所述的反应在pH为6.0~10.0的水相缓冲溶液中进行。
2.根据权利要求1所述的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的转氨酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司的牌号为EW1101的转氨酶。
3.根据权利要求1所述的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于，在起始反应体系中，所述转氨酶：所述氨基供体：所述辅因子：所述底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的投料质量比为0.05-0.15: 1-1.5:0.005-0.015:1。
4.根据权利要求1所述的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的氨基供体为异丙胺。
5.根据权利要求1所述的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于，所述的助溶剂为吐温60、DMSO或其组合。
6.根据权利要求1或5所述的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于，所述助溶剂的投料体积为反应总体积的10%-25%。
7.根据权利要求1所述的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的辅因子为磷酸吡哆醛。
8.根据权利要求1所述的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述反应在pH为9.5的水相缓冲溶液中进行。
9.根据权利要求1或8所述的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为三乙醇胺-盐酸缓冲溶液。
10.根据权利要求1所述的(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于，具体实施过程如下：在反应容器中依次加入所述的水相缓冲溶液、底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯、氨基供体、助溶剂、辅因子和转氨酶，搅拌均匀，在25-45℃和氮气吹扫的条件下，HPLC检测反应进程，当转化率达90-99%时，调节反应体系pH至2-3，硅藻土过滤，并在滤液中加入乙酸乙酯进行多次萃取，旋转蒸发脱去溶剂后得到(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯产品。
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