CN106188309A - 抗凝融合蛋白ha及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗凝融合蛋白HA及其应用。本发明提供了融合蛋白，包括Hirudin蛋白和AnnexinA5蛋白。上述融合蛋白中，所述融合蛋白由Hirudin蛋白的C端通过连接肽与AnnexinA5蛋白的N端连接得到。本发明的实验证明，Hirudin C端通过Linker(GGGG)串联AnnexinA5得到融合蛋白，该融合蛋白能够靶向定位结合活化血小板外翻的PS上，同时，Hirudin结构域的氮端结构得到有效暴露，展示出与凝血酶相互作用的能力，HA对于凝血酶也产生一定的结合效应，同时发挥抗血小板和抗凝的双重效果，协同作用达到较高的抗栓水平。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗凝融合蛋白HA及其应用。
背景技术
在血管内面剥落处或修补处，血流变化，血小板沉积、白细胞聚集和凝血因子增多等血液性质改变，导致血栓形成。血栓形成受遗传、环境多因素共同作用影响，一旦形成，往往会引发血栓性疾病等不可逆后果。血栓性疾病有高发病率、致残率和致死率等特点，严重危害人类生命健康。血栓的预防和治疗备受关注，抗栓药物的开发和使用仍是当今医学研究热点。
目前抗血栓药物主要有抗血小板药物、抗凝药物和溶栓药物三类，高效抗栓、减少副作用是抗栓药物的发展目标。临床上双联或三联抗栓治疗有效结合抗血小板和抗凝双重功效，实施个性化治疗、检测和评估，是当今研究和治疗的热门方向。AnnexinA5以钙离子依赖方式结合PS，PS在凝血系统中是多种因子活化的必需因素；水蛭素抑制凝血酶，使之不能活化纤维蛋白原，发挥抗凝作用。如何特异性发挥抗栓作用，合理设计融合蛋白是开发抗栓药物的重要研究方向。
血栓形成机制复杂，其中血小板和凝血系统是较重要的影响因素。初级止血形成止血栓，血小板发挥主导作用；次级凝血中需要激活一系列的凝血因子和相关级联反应，形成稳固的血凝块，凝血系统为主导。抗栓药物是否既拮抗血小板聚集，又干扰凝血系统，需要一系列实验证明。
发明内容
本发明的一个目的是提供抗凝融合蛋白HA。
本发明提供的融合蛋白，包括Hirudin蛋白和AnnexinA5蛋白。
上述融合蛋白中，所述融合蛋白由Hirudin蛋白的C端通过连接肽与AnnexinA5蛋白的N端连接得到。
上述融合蛋白中，所述连接肽为4个甘氨酸。
上述融合蛋白为如下1)或2):
1)序列表中序列2所示的蛋白质；
2)将1)所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由1)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。
为了使(1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码上述融合蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC、0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗血栓中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗血小板聚集中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗凝血中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗血栓产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗血小板聚集产品中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗凝血产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种具有如下1)-3)中至少一种功能的产品。
本发明提供的产品，包括上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
1)抗血栓；
2)抗血小板聚集；
3)抗凝血。
上述方法中，所述产品为药物。
上述抗凝血体现在融合蛋白HA延长血浆凝血时间，具体通过HA结合PS延长凝血时间；
上述抗血小板聚集体现在抑制血小板聚集或者结合GPIIb/IIIa受体。
本发明的实验证明，Hirudin C端通过Linker(GGGG)串联AnnexinA5得到融合蛋白，该融合蛋白能够靶向定位结合活化血小板外翻的PS上，同时，Hirudin结构域的氮端结构得到有效暴露，展示出与凝血酶相互作用的能力，HA对于凝血酶也产生一定的结合效应，同时发挥抗血小板和抗凝的双重效果，协同作用达到较高的抗栓水平；且该融合蛋白随着浓度的微小提升，可显著提高体内抗凝血效应，表现出独特的体内抗凝血双曲线效应，推测，这可能是由于Hirudin的氨基端微弱的凝血酶作用效应产生的。这种相互作用，可能不像Hirudin的羧基端一样，具有强烈的凝血酶结合特征，很可能是一种处于平衡态的凝血酶结合/解离效应，随着HA浓度的逐步提高，平衡向着有利于结合凝血酶的方向发展，最后导致呈现出体内抗凝血的双曲线效应，而非简单的线性关系。这对于HA作为抗凝血药物的使用，是非常有益的提示，微弱提高HA药物使用量，即可达到显著增强抗凝血效应的目的。HA可广泛用于抗血栓性疾病的防治，为新药物开发提供参考。
附图说明
图1为Hirudin基因电泳图。
图2为HA融合基因电泳图。
图3为阳性克隆菌落PCR电泳检测。
图4为不同IPTG浓度诱导GST-HA表达检测。
图5为GST-HA蛋白不同时间诱导表达。
图6为亲和层析纯化GST-HA。
图7为12％SDS-PAGE电泳检测PSP酶剪切目的蛋白的效率。
图8为12％SDS-PAGE电泳鉴定得到的HA。
图9为HA蛋白western blot鉴定。
图10为HA蛋白的HPLC鉴定，其中，VWD：信号A，280nm,HA.dat。
图11为HA蛋白与磷脂结合分析。
图12为HA蛋白与不同剂量PS结合活性分析。
图13为Ca2+对HA蛋白与PS结合影响分析。
图14为HA对血浆凝血时间的作用。
图15为Hirudin和HA的抗凝血酶活力对比.
图16为HA抑制血小板聚集率活性。
图17为HA小鼠体内出血时间。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pJET1.2载体购自Thermo公司；小鼠抗AnnexinA5多克隆抗体由本实验室制备保存；RGD多肽由北京金盛生物公司合成；KM小鼠(♀)购自北京维通利华实验动物技术有限公司；pJET1.2/blunt载体购自Thermo(赛默飞世尔科技中国有限公司)；pGEX-6P-1载体、Sephacryl S200HR凝胶、GST亲和介质购自GE Healthcare公司；Phosphatidylcholine购自北京华迈科生物技术有限公司；Phosphatidylcholine购自北京利维宁生物科技有限公司；Coomassie Brilliant Blue G-250、R-250、Goldview、Glycine、TEMED、Amp、IPTG、TMB、DAB、脱脂奶粉、HRP-山羊抗小鼠IgG二抗、ADP·Na2等购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；凝血酶、牛血纤维蛋白原购自北京中生泰瑞科技有限公司；FITC-羊抗人纤维蛋白原购自北京诺博莱德科技有限公司。
下述实施例中部分试剂如下：
TM表达培养基(800mL)：
用蒸馏水溶解定容至800mL。121℃高压灭菌20min，冷却。
1×PBS缓冲液(1L)：
用900mL蒸馏水溶解，浓HCl调节pH至7.4，定容至1L，真空抽滤除杂。
10mM GSH(100mL)：0.3g的还原性谷胱甘肽溶于100mL的1×PBS缓冲液，小量分装，-20℃保存。
PSP酶储存液(100mL)：
用25mM的Tris-HCl(pH8.0)溶解，定容至100mL，小量分装，-20℃保存。
50mg/mL氨苄青霉素(30mL)：称取1.5g氨苄青霉素溶解于30mL的无菌蒸馏水，用0.22μM的滤膜过滤除杂，小量分装-20℃保存。
0.1M IPTG(30mL)：称取0.715g IPIG溶解于30mL的无菌蒸馏水，用0.22μM的滤膜过滤除杂，小量分装-20℃保存。
R250染色液(1L)：
R250 1.0g
无水乙醇 420mL
冰乙酸 100mL
蒸馏水溶解定容至1L，棕色瓶室温避光保存。
G250染色液(500mL)：50mg的Brilliant Blue G-250溶于25mL的95％乙醇，加50mL磷酸溶液，用蒸馏水充分搅拌溶解，定容至500mL，避光过滤。
脱色液(1L)：
冰乙酸 50mL
无水乙醇 450mL
蒸馏水 500mL
转膜缓冲液(500mL)：
用蒸馏水定容至500mL，冰浴放置，现用现配。
洗膜缓冲液/TBST(1L)：
NaCl 5.84g
Tris 1.21g
用800mL蒸馏水溶解，调节pH值为7.5，加0.5mL的Tween-20，定容至1L。
TBS(1L)：
Tris 2.42g
NaCl 8.8g
用900mL蒸馏水溶解，调节pH值至7.4，定容至1L。
Binding Buffer：含2％脱脂奶粉，5mMCaCl2的TBS溶液，现用现配。
Washing buffer：含0.05％Tween-20，2mMCaCl2的TBS溶液。
ELISA显色液：
A:乙酸钠2.72g，柠檬酸钠0.32g，30％H2O2 60μL，蒸馏水定容至100mL。
B:柠檬酸钠0.19g，EDTA·Na2 0.04g，TMB 0.03g，甘油10mL，蒸馏水溶解定容至100mL；
显色前将A液和B液等体积混合。
纤维蛋白原溶液：用20mL的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(PH7.4)溶解100mg纤维蛋白原，配置成0.5％纤维蛋白原溶液(现配现用)。
凝血酶：用0.9％生理盐水配置成40U/mL凝血酶溶液(现配现用)。
肝素钠溶液：生理盐水配置成200U/mL肝素钠注射液。
ADP诱导剂：用生理盐水配置成300μmol/L ADP·Na2溶液。
RGD多肽：GA-10，序列：GCGRGDWPCA，分子量：1019.20Da
实施例1、HA融合蛋白的获得
HA融合蛋白由Hirudin蛋白的C端通过Linker(GGGG)与AnnexinA5蛋白的N端连接，得到融合蛋白。
HA融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
序列2第1-66位氨基酸为Hirudin蛋白，序列2第71-389位氨基酸为AnnexinA5蛋白。
序列1第1-198位核苷酸为Hirudin蛋白编码基因，序列1第211-1167位核苷酸为AnnexinA5蛋白编码基因。
一、表达HA融合蛋白基因的载体的构建
1、自行构建获得Hirudin基因
以如下表2中的1PF、1PR作为模板，2PF、2PR为引物进行PCR扩增，得到第一次PCR扩增产物，再以第一次PCR扩增产物为模板，3PF、3PR为上下游引物扩增，得到PCR产物。
将上述PCR产物电泳，结果如图1所示，M.DNA marker；1-2.Hirudin基因，可以看出，得到198bpPCR产物。将上述PCR产物送去测序，该PCR产物为序列表中序列1第1-198位所示的Hirudin基因。
表2引物序列
2、HA融合蛋白基因的构建
表3
单下划线的分别是BamHI和XhoI的识别位点。
分别以上述Hirudin基因和pGEX-6P-1-AnnexinA5质粒为模板，用表3所示的引物和表4所示的体系进行PCR。
表4
PCR反应条件是94℃预变性5min；94℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s(循环30次)；72℃延伸10min；4℃保存。
经过PCR产物鉴定和回收，体系a、b分别得到Hirudin-L(经过测序，其核苷酸序列为序列1第1-210位，其中，199-210为连接肽的编码DNA分子)、L-AnnexinA5(经过测序，其核苷酸序列为序列1第199-1170位，其中，199-210为连接肽的编码DNA分子)，L是两段基因共有的4个甘氨酸序列。
以Hirudin-L和L-AnnexinA5基因为模板，以HA-H5、LAA-3分别为上、下游引物，进行PCR，得到1193bp的PCR产物(图2，M.DNAmarker；1-2为HA基因)。
将1193bp的PCR产物送去测序，其核苷酸序列含有序列表中序列1，将该PCR产物命名为HA基因。
3、表达HA基因的重组载体的获得
将上述获得的序列1所示的HA基因替换表达载体pGEX-6P-1(GE Healthcare公司，产品目录号Code no.28-9546-48)的BamHI和XhoI之间的片段，得到表达HA基因的重组载体，命名为pGEX-6P-1-HA，HA基因与载体上的GST标签融合表达。
二、HA融合蛋白的表达
1、表达HA融合蛋白基因的重组菌的构建
将上述重组载体pGEX-6P-1-HA转入BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1-HA。
菌液PCR鉴定，引物为HA-H5、LAA-3，结果如图3所示，M.DNA marker；1-2，阳性菌落PCR；得到1193bp为阳性菌。
对照：将pGEX-6P-1转入BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1。
2、HA融合蛋白的表达条件摸索
1)最适IPTG浓度的摸索
将重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1-HA的单菌落至5mL LB液体培养基(Amp浓度为50μg/mL)，37℃，190rpm培养过夜，得到菌液。以重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1为对照。
将菌液按1:100的比例加入100mL的TM表达培养基中，37℃扩培3.5h左右达到对数期，OD600为0.6-0.8之间，加入IPTG(终浓度设定为：0μM、10μM、25μM、50μM、100μM、150μM、200μM)后，在25℃，190rpm诱导12h。在4℃，6000rpm离心15min收集菌沉。菌沉用20mL 1×PBS溶解。在等功率破碎相同的时间，4℃，12000rpm离心20min，分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE检测在不同温度下，目的蛋白的表达情况。
结果如图4所示，1-7.IPTG诱导终浓度分别是0,10,25,50,100,150,200μM全蛋白表达情况；可以看出，BL21(DE3)/pGEX-6P-1-HA加入IPTG有明显的66.4kD目的蛋白条带，为HA与载体上GST融合表达得到的重组蛋白GST-HA。
重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1经过同样的方法检测，没有目的条带。
且在IPTG为50μM时，蛋白表达量较高，且不随IPTG浓度提高而增多。IPTG浓度过高易形成包涵体，并且IPTG对细胞有一定的毒性。因此，经实验探索得知IPTG诱导浓度为50μM。
2)最适诱导时间的摸索
BL21(DE3)/pGEX-6P-1-HA在温度25℃和50μM IPTG浓度下，诱导时间设定为3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、20h，其他条件相同，SDS-PAGE检测蛋白随时间积累情况。
结果如图5所示，1-10.加入IPTG诱导3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、20h全蛋白表达情况，由图可见，在诱导3-10h，蛋白积累量在逐渐增加，在10h蛋白积累量达到最高，目的蛋白在20h没有降解。
3、融合蛋白HA的纯化
1)破菌
收集BL21(DE3)/pGEX-6P-1-HA在25℃和50μM IPTG浓度下诱导10h的菌液，4℃，6000rpm离心20min，收集菌沉。称取适量菌沉，按照每克菌沉15mL1×PBS的比例充分溶解菌沉，冰浴，超声破碎悬液，功率600W，工作3s，间歇27s，共20min(40次循环)，避免产生泡沫；4℃，12000rpm离心20min，收集上清液。
2)GST亲和层析纯化
(1)装柱和平衡：将亲和介质加入到层析柱中，自然沉降。用40mL的1×PBS平衡层析柱，流速为1mL/min，调节紫外检测仪示数至零。
(2)上样和洗涤：上述1)得到的上清液，用0.45μm的针头过滤器过滤。上样流速为0.5mL/min。PBS洗涤，流速为1mL/min，直至紫外检测仪示数降至基线。
(3)洗脱：用10mM的还原性谷胱甘肽溶液洗脱目的蛋白GST-HA，流速为0.5mL/min，紫外检测仪示数上升出现峰值，收集蛋白。
(4)蛋白浓缩、除盐：将蛋白加入到30KD的超滤管，4℃，3000g离心10min，除去部分还原性谷胱甘肽，PBS稀释浓缩液，再次超滤。
(5)柱子再生和保存：用2倍介质体积的0.5M NaOH溶液洗柱子，除去非特异性吸附的杂质，用ddH2O洗至中性，用4倍介质体积的20％乙醇洗涤，4℃保存。
(6)SDS-PAGE检测。
结果如图6所示，M.Protein marker；1-3.GSH洗脱出的目的蛋白；可以看出，将破碎后上清液稀释后上样到GST亲和柱，减缓流速，穿透液中目的蛋白较少，GST亲和柱效高；GSH洗脱出的蛋白纯度与产量较好，目的蛋白GST-HA纯度为92％。
3)PSP酶切除重组蛋白GST-HA的GST标签
用GST亲和层析纯化得到的GST-HA与PSP酶(南通表源生物技术有限公司，1000Units/mg)分别按照摩尔比例为1200：1,800：1,400：1,200：1,100：1,50：1混匀(裂解buffer:0.5mol/L Tris-HCl+150mM Nacl+0.1％Triton-100,pH 8.0)，4℃，酶切12h。
SDS-PAGE检测不同比例的酶切效果，结果如图7所示，M.Protein marker；1.融合蛋白对照；2-7.PSP酶切效果，可以看出，GST-HA(69kD)蛋白出现部分标签脱落，该蛋白与PSP酶的摩尔比例为400:1时，PSP酶可将融合蛋白充分切开，生成HA(43kD)和GST(26kD)。
将GST-HA与PSP酶按照摩尔比例为400:1酶切得到的溶液样品过GST亲和层析柱，PBS洗涤，收集穿透峰，浓缩脱盐，得到洗脱液。
洗脱液进行SDS-PAGE电泳结果如图8所示，M.Protein marker；1-4.HA，可以看出，得到大小为43kD的目的融合蛋白HA。
4、融合蛋白HA的验证
1)Western blot验证
将纯化的AnnexinA5蛋白(按照文献的方法制备AnnexinA5蛋白：梁盼盼,张鑫蕊,井健.人Annexin A5的表达及性质研究.北京师范大学学报(自然科学版),2009,45(4):378-380.AnnexinA5蛋白编码基因的核苷酸序列为序列1的第211-1167位)、上述3得到的融合蛋白HA上样进行Western blot检测，一抗为AnnexinA5多克隆抗体，二抗为HRP-山羊抗小鼠抗体。
结果如图9所示，1.阳性对照AnnexinA5；2-3.HA，可以看出，融合蛋白HA条带略高于阳性对照条带，目的蛋白条带对比marker位置，与蛋白分子量一致。
2)分子筛(SEC-HPLC)鉴定
(1)准备：超纯水、平衡液(1×PBS)、200μL上述3得到的融合蛋白HA、10％甲醇经0.22μM的针形滤膜过滤。
(2)开机：打开四元泵、检测器等进入自检，设定参数v＝5mL/min，水洗约2个Sephacryl S200凝胶柱体积，排除气泡。
(3)平衡：用平衡液1×PBS平衡体系约2个柱体积直至基线平稳。
(4)上样：上样200μL上述3得到的融合蛋白HA，1个柱体积的平衡液进样。
(5)结束：分别用超纯水和10％甲醇清洗管道和柱子，输出图谱，分析。
结果如图10所示，图谱显示HA蛋白保留时间为8.390-9.443min，在8.887min达到峰值，保留时间符合HPLC测定的蛋白marker保留时间，峰型对称，目的蛋白含量的面积百分比达到82.248％，说明蛋白主要以单体形态稳定存在。
三、Hirudin蛋白获得
将Hirudin基因插入pGEX-6P-1载体的BamHI和XhoI位点间，得到表达载体，再按照上述一和二的方法表达纯化，得到7.5kD的Hirudin蛋白。
实施例2、融合蛋白HA的功能研究
一、HA脂质结合活性分析
1、HA的磷脂结合分析
(1)分别称取10mg PS(磷脂酰丝氨酸，phosphatidylserine,购自北京华迈科生物技术有限公司)和PC(磷脂酰胆碱，phosphatidylcholine，购自北京利维宁生物科技有限公司)溶解于10mL氯仿中，向每个酶标孔中加入2.5μg，放于通风橱中待溶剂挥发完全，磷脂吸附到聚苯乙烯表面上。
(2)封闭：每孔中加入100μL TBS配置5％(w/v)脱脂奶粉的封闭液，封口膜封板，37℃封闭2h。弃去封闭液，每孔加入200μLwashing buffer，静置3min弃去，重复3次。充分除净液体。
(3)Binding buffer将实施例1的纯化的融合蛋白HA稀释不同浓度，向每孔加入50μL蛋白样品，37℃温育2h，washing buffer洗涤3次，方法同上。
(4)孵一抗：binding buffer以1：10000比例稀释一抗(小鼠抗AnnexinA5多克隆抗体)，每孔加100μL，37℃孵育1h，washing buffer洗涤3次。
(5)孵二抗：binding buffer以1：5000比例稀释二抗(HRP-山羊抗鼠IgG抗体)，每孔加100μL，37℃孵育1h，washing buffer洗涤6次，ddH2O洗涤3次，用滤纸吸干水分。
(6)显色：将TMB显色液A、B等体积混合，每孔加入140μL，暗处反应10min，此时呈现不同程度的蓝色。
(7)终止反应：每孔加入40μL 2mol/LH2SO4，反应孔中蓝色变为黄色，稳定5min。
(8)用酶标仪450nm处测定各孔的吸光度。
该Elisa过程是磷脂吸附-AnnexinA5包被-AnnexinA5小鼠源抗体特异结合-HRP标记山羊抗小鼠抗体孵育-TMB应用液显色生成有色产物，在λ＝450nm测定吸光值，AnnexinA5与磷脂结合活性越强，吸光值越高。磷脂(PS或PC)吸附在酶标板上，AnnexinA5分子与不同磷脂结合能力不同，AnnexinA5包被磷脂程度成剂量依赖关系。
结果如图11所示，可以看出，HA保留AnnexinA5分子与PS、Ca2+结合的活性位点，随着蛋白浓度的提高，OD450nm增高，呈现蛋白浓度剂量依赖关系，在蛋白浓度达到50μg/mL，与2.5μg趋向饱和；AnnexinA5不与PC结合。
2、磷脂剂量与磷脂结合分析
各孔中HA为50μL,50μg/mL。将PS的剂量设定为0μg、0.4μg、0.8μg、1.2μg、1.6μg、2.0μg、2.4μg、2.8μg、3.2μg，其他步骤同上述1。
结果如图12所示，由图可见，不同剂量PS固定在酶标板上，HA与PS结合呈现出剂量依赖关系，在PS>2.5μg，蛋白与PS结合逐步达到饱和。
3、钙离子浓度与磷脂结合分析
各孔中HA为50μL,20μg/mL，PS剂量为2.5μg，binding buffer中Ca2+浓度设定为0mM、0.01mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1.0mM、3mM、5mM、10mM、20mM、50mM、100mM。其他步骤同上。
结果如图13所示，AnnexinA5是钙离子依赖磷脂结合蛋白，Ca2+存在时与带负电荷的PS可逆性结合，在Ca2+浓度为0.05-50mM之间，HA与PS结合活性随Ca2+浓度增高而提升。
二、HA对血浆凝血时间影响分析
(1)向每个酶标孔中加入2.5μg PS(氯仿为溶剂)，置于通风橱中挥发溶剂。
(2)每孔中加100μL的5％脱脂奶粉(TBS配制)，37℃封闭2h，washing buffer洗涤3次。
(3)用binding buffer稀释HA为不同浓度，每孔加50μL蛋白稀释液，37℃孵育2h，washing buffer洗涤3次。
(4)制备50％血浆(PBS为溶剂)，每孔加入100μL，37℃孵育3min。每孔加入25μL0.08M CaCl2(Ca2+终浓度为16mM)，即时血浆开始凝固，设定波长为405nm，平均每5min检测各孔吸光度。
本实验用1:9枸橼酸钠抗凝血浆。向去Ca2+的抗凝血浆中重新加入Ca2+(CaCl2溶液)，血液发生凝固。从加入Ca2+至血浆凝固这一过程经历的时间为血浆凝固时间，Ca2+、磷脂与活化的凝血因子VIII结合形成复合物，后者激活凝血因子X。Ca2+、磷脂、凝血因子V存在时，活化的凝血因子X与之共同作用，将凝血酶原激活转化为凝血酶，凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，达到血浆凝固的效果。
结果如图14所示，实验中设定6个HA蛋白浓度，在吸光度OD405nm处检测蛋白对血浆凝固的作用。蛋白浓度为零时，正常血浆中Ca2+终浓度为16mM，血浆浊度随时间改变，自10min起始OD405nm增加，血浆凝固，30min后血浆凝固达到终点。HA蛋白逐渐增加，血浆凝固时间延迟且延长，5-10μmol/L，在45min血浆凝固完全；当20-30μmol/L，在65min，血浆凝固完全，血浆凝血效应降低；当40μmol/L，血浆没有出现明显凝固状态。HA与PS结合，阻止PS参与血浆中的凝血因子X活化，从而达到延长RT、减少纤维蛋白产量、降低血浆浊度的效果。
三、Hirudin和HA的抗凝血酶活性测定
凝血酶滴定法测定蛋白样品中水蛭素的抗凝血酶活性(ATU)。100μl某浓度的Hirudin-AnnexinV或者Hirudin蛋白溶液与200μl的0.5％牛血纤维蛋白原混匀，在37℃温育，用移液器在混合溶液中吹出一小气泡作为观察记号，然后加入5μl凝血酶溶液，轻轻吹打均匀，记时1min，轻轻旋转观察气泡是否随液面转动，若气泡随液面转动即溶液发生凝固为反应终点。否则每分钟滴加5μl凝血酶直至反应终点。计算公式：
其中，抗凝血酶活力单位为ATU/mg，Ct为凝血酶溶液的浓度(U/ml)，Vt为凝血酶溶液的体积(μl)，Ch为Hirudin-annexinV蛋白浓度(mg/ml)，Vh为Hirudin-annexinV蛋白体积(μl)。
Hirudin是目前发现效果最强的凝血酶天然特异抑制剂。
结果如图15所示，图中表示Hirudin和Hirudin-Annexin两种不同蛋白的抗凝血酶活力，计算得知等摩尔数的Hirudin(7kD)与Hirudin-AnnexinV(43kD)的抗凝血酶活力比约为70:1。Hirudin的C端通过Linker连接AnnexinA5，Hirudin的抗凝血酶活力大大降低，说明C端的完整和游离状态对抑制凝血酶的催化活性位点起着至关重要的作用。但保留的抗凝血酶活性，说明HA分子具有一定凝血酶结合结构域，推测，这是由处于HA分子氮端的Hirudin部分的氨基端结构域产生的，这也从另一个方面印证了Hirudin分子游离的氨基端和羧基端对于凝血酶分子结合的不同的贡献分布度。
三、抗血小板聚集活性分析
ADP诱导血小板活化、PS外翻，AnnexinA5与外翻PS结合，在一定程度上抑制血小板聚集。通过ADP刺激下的血小板聚集实验，检测HA抑制血小板聚集的能力。
(1)准备工作：将三种具有抗血小板聚集的蛋白(HA蛋白、RGD序列、AnnexinA5)稀释成不同浓度；开机机器自检，进入ADP聚集实验界面。
(2)用蓝色1：9枸橼酸钠抗凝管收集人全血，摇匀后800rpm离心8min，黄色上清液为富血小板血浆(PRP)，取出PRP，管中剩余液体3000rpm离心10min，上清液为贫血小板血浆(PPP)。
(3)将300μl的PPP加入测试杯中，放到测试通道中按“PPP”键调零。
(4)将300μl的PRP加入测试杯中，加入测试棒，放置在左侧预温面板区域进行预温。放入调零的同一通道，按下该通道的预温键，界面显示时间开始从60s减少，至13-15s，加入10μlADP(终浓度为10μM)同时按下绿色按钮，开始测试，3min出现空白组血浆的最大聚集率。
(5)以同种方法测试给药组血浆，将300μlPRP与30μl的蛋白样品在EP管混匀，取300μl给药组血浆加入到测试杯，步骤同上。蛋白样品有四种不同浓度的HA、AnneixnA5。
(6)蛋白对ADP诱导的血小板聚集的抑制率公式为：
结果如图16所示，图中可见，Hirudin通过与凝血酶结合发挥抗凝血作用，影响凝血瀑布。HA在抑制血小板聚集效率略低于AnnexinA5，推测Hirudin消耗凝血酶，使更多的凝血酶原在Ca2+、膜磷脂作用下形成凝血酶，膜磷脂不能充分结合AnnexinA5，因此HA抑制血小板聚集不如AnnexinA5。
四、凝血四项的测定
用蓝色1：9枸橼酸钠抗凝管收集人全血，摇匀，3000rpm离心10min，取上层贫血小板血浆(PPP)。在每个测定杯子中加入300μL的PPP和30μL的蛋白样品(PBS为对照)混匀，37℃孵育10min，全自动凝血分析仪测定结果。
结果如下表5所示，
表5.HA对血浆凝血四项的作用
HA在凝血四项主要影响了血浆的APTT，在1-10μmol/L范围内，随蛋白浓度增加APTT逐渐延长，超过正常参考值。而PT变化不大，FIB、TT值没有临床意义的改变。APTT是评价内源性凝血系统状况，如凝血因子XII、XI、IX、X，以上凝血因子的减少会引起APTT的延长。推测HA影响内源凝血途径，进而会影响共同凝血途径。
五、HA在小鼠体内出血风险评估
运用小鼠尾部横截模型评价体内出血风险。昆明小白鼠，雌性，24-26g，5周龄。腹腔注射1％戊巴比妥钠0.1ml进行麻醉，眼球后静脉丛注射给药。
HA实验组为不同浓度的HA溶液(溶质为HA，溶剂为生理盐水)，剂量分别为0.038μmol/kg、0.085μmol/kg、0.158μmol/kg、0.2μmol/kg；
阴性对照组为同体积的生理盐水；
阳性对照组为肝素钠溶液(Heparin)，剂量为200U/kg；
单独A5组为不同浓度的AnnexinA5溶液(溶质为HA，溶剂为生理盐水)，剂量分别为0.038μmol/kg、0.085μmol/kg、0.2μmol/kg。
注射给药20min后，距尾端6mm处横截，立即将出血尾部放置入37℃生理盐水中浸泡观察出血状况，记录出血至停止出血的时间。
将HA设置为不同浓度，采用鼠尾横截模型记录小鼠体内出血时间，进而评估不同浓度蛋白的出血风险。
结果如图17所示，*是与生理盐水组对比差异显著(P<0.05)，#是与肝素组对比差异显著(P<0.05)。实验中，阳性对照为200U/Kg肝素钠溶液，阴性对照为同体积的生理盐水。随着蛋白浓度的增高，出血时间有所延长，出血风险增加。由图可见，在HA浓度为0.038、0.085μmol/L，鼠尾出血时间相对生理盐水组略有延长，但差异不显著，当浓度达到0.158μmol/L(P<0.05)，差异显著，但与肝素组比对仍没有显著差异。当浓度达到0.2μmol/kg,出血时间与肝素组对比，差异显著。实验研究清晰地表明了HA重组融合蛋白作为抗凝血药物的体内作用效应，药物作用浓度与体内抗凝血效应并不呈现线性增强的关系，随着浓度的提高，抗凝血效应呈现倍增效应，效果提高明显，这对于未来的合理用药、安全用药是非常有益的提示。
单独A5组0.038μmol/kg剂量的出血时间为193s、0.085μmol/kg剂量的出血时间为289s、0.2μmol/kg剂量的出血时间为1142s。
总而言之，HA重组融合蛋白是一种独特的抗凝血药物，微量提高药物使用浓度，即可达到显著提升抗凝血效应的效果。
Claims (10)
1.融合蛋白，包括Hirudin蛋白和AnnexinA5蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白由Hirudin蛋白的C端通过连接肽与AnnexinA5蛋白的N端连接得到。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述连接肽为4个甘氨酸。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为如下1)或2):
1)序列表中序列2所示的蛋白质；
2)将1)所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由1)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。
5.编码权利要求1-4中任一所述融合蛋白的DNA分子。
6.如权利要求5所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
7.含有权利要求5或6所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
8.权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗血栓中的应用；
或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗血小板聚集中的应用；或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗凝血中的应用；
或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗血栓产品中的应用；
或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗血小板聚集产品中的应用；
或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗凝血产品中的应用。
9.一种具有如下1)-3)中至少一种功能的产品，包括权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
1)抗血栓；
2)抗血小板聚集；
3)抗凝血。
10.根据权利要求8所述的应用或权利要求9所述的产品，其特征在于：所述产品为药物。
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|---|---|---|---|---|
| WO2023143464A1 (en) * | 2022-01-30 | 2023-08-03 | Nanjing Reju Therapeutics , Inc. | Fusion protein and application thereof |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN101402688A (zh) * | 2008-11-18 | 2009-04-08 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种融合蛋白及其编码基因与应用 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 范垚 等: "一种水蛭素类融合蛋白与凝血酶作用的动力学模拟", 《生物化学与生物物理进展》 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2023143464A1 (en) * | 2022-01-30 | 2023-08-03 | Nanjing Reju Therapeutics , Inc. | Fusion protein and application thereof |
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