CN105949326A

CN105949326A - 抗凝融合蛋白ea及其应用

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Publication number: CN105949326A
Application number: CN201610542954.4A
Authority: CN
Inventors: 井健
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2016-07-11
Filing date: 2016-07-11
Publication date: 2016-09-21
Anticipated expiration: 2036-07-11
Also published as: CN105949326B

Abstract

本发明公开了抗凝融合蛋白EA及其应用。本发明提供了融合蛋白，包括Echistatin蛋白和AnnexinA5蛋白。上述融合蛋白中，所述融合蛋白由Echistatin蛋白的C端通过连接肽与AnnexinA5蛋白的N端连接得到。本发明的实验证明，Echistatin C端通过Linker(GGGG)串联AnnexinA5得到融合蛋白，该融合蛋白能够靶向定位结合活化血小板外翻的PS上，同时结合血小板膜上受体GPIIbIIIa,发挥抗血小板聚集和抗凝血的双重效果，协同作用达到较高的抗栓水平；且该融合蛋白在血栓形成过程中影响初级和次级凝血功能，可发挥抗栓功效，可广泛用于抗血栓性疾病的防治，为新药物开发提供参考。

Description

抗凝融合蛋白EA及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗凝融合蛋白EA及其应用。

背景技术

在血管内面剥落处或修补处，血流变化，血小板沉积、白细胞聚集和凝血因子增多等血液性质改变，导致血栓形成。血栓形成受遗传、环境多因素共同作用影响，一旦形成，往往会引发血栓性疾病等不可逆后果。血栓性疾病有高发病率、致残率和致死率等特点，严重危害人类生命健康。血栓的预防和治疗备受关注，抗栓药物的开发和使用仍是当今医学研究热点。

目前抗血栓药物(主)要有抗血小板药物、抗凝药物和溶栓药物三类，高效抗栓、减少副作用是抗栓药物的发展目标。临床上双联或三联抗栓治疗有效结合抗血小板和抗凝双重功效，实施个性化治疗、检测和评估，是当今研究和治疗的热门方向。AnnexinA5以钙离子依赖方式结合PS，PS在凝血系统中是多种因子活化的必需因素；去整合素有抗血栓形成、抑制肿瘤转移等多种生理功能。如何特异性发挥抗栓作用，合理设计融合蛋白是开发抗栓药物的重要研究方向。

血栓形成机制复杂，其中血小板和凝血系统是较重要的影响因素。初级止血形成止血栓，血小板发挥主导作用；次级凝血中需要激活一系列的凝血因子和相关级联反应，形成稳固的血凝块，凝血系统为主导。抗栓药物是否既拮抗血小板聚集，又干扰凝血系统，需要一系列实验证明。

发明内容

本发明的一个目的是提供抗凝融合蛋白EA。

本发明提供的融合蛋白，包括Echistatin蛋白和AnnexinA5蛋白。

上述融合蛋白中，所述融合蛋白由Echistatin蛋白的C端通过连接肽与AnnexinA5蛋白的N端连接得到。

上述融合蛋白中，所述连接肽为4个甘氨酸。

上述融合蛋白为如下1)或2):

1)序列表中序列2所示的蛋白质；

2)将1)所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由1)所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。

为了使(1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述融合蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC、0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗血栓中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗血小板聚集中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗凝血中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗血栓产品中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗血小板聚集产品中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗凝血产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种具有如下1)-3)中至少一种功能的产品。

本发明提供的产品，包括上述融合蛋白或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

1)抗血栓；

2)抗血小板聚集；

3)抗凝血。

上述方法中，所述产品为药物。

上述抗凝血体现在融合蛋白EA延长血浆凝血时间，具体通过EA结合PS延长凝血时间；

上述抗血小板聚集体现在抑制血小板聚集或者结合GPIIb/IIIa受体。

本发明的实验证明，Echistatin C端通过Linker(GGGG)串联AnnexinA5得到融合蛋白，该融合蛋白能够靶向定位结合活化血小板外翻的PS上，同时结合血小板膜上受体GPIIbIIIa,发挥抗血小板聚集和抗凝血的双重效果，协同作用达到较高的抗栓水平；且该融合蛋白在血栓形成过程中影响初级和次级凝血功能，可发挥抗栓功效，可广泛用于抗血栓性疾病的防治，为新药物开发提供参考。

附图说明

图1为Echistatin基因电泳图。

图2为EA融合基因电泳图。

图3为阳性克隆菌落PCR电泳检测。

图4为不同IPTG浓度诱导GST-EA表达检测。

图5为12％SDS-PAGE鉴定GST-EA蛋白不同温度诱导表达。

图6为GST-EA蛋白不同时间诱导表达。

图7为亲和层析纯化GST-EA。

图8为12％SDS-PAGE电泳检测PSP酶剪切目的蛋白的效率。

图9为12％SDS-PAGE电泳鉴定得到的EA。

图10为EA蛋白western blot鉴定。

图11为EA蛋白的HPLC鉴定，其中，VWD：信号A，280nm,EA.dat。

图12为EA蛋白与磷脂结合分析。

图13为EA蛋白与不同剂量PS结合活性分析。

图14为Ca²⁺对EA蛋白与PS结合影响分析。

图15为EA对血浆凝血时间的作用。

图16为EA抑制血小板聚集率活性。

图17为不同蛋白对血小板平均荧光强度的作用。

图18为EA小鼠体内出血时间。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pJET1.2载体购自Thermo公司；小鼠抗AnnexinA5多克隆抗体由本实验室制备保存；RGD多肽由北京金盛生物公司合成；KM小鼠(♀)购自北京维通利华实验动物技术有限公司；pJET1.2/blunt载体购自Thermo(赛默飞世尔科技中国有限公司)；pGEX-6P-1载体、Sephacryl S200HR凝胶、GST亲和介质购自GE Healthcare公司；Phosphatidylcholine购自北京利维宁生物技术有限公司；Coomassie Brilliant Blue G-250、R-250、Goldview、Glycine、TEMED、Amp、IPTG、TMB、DAB、脱脂奶粉、HRP-山羊抗小鼠IgG二抗、ADP·Na₂等购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；凝血酶、牛血纤维蛋白原购自北京中生泰瑞科技有限公司；FITC-羊抗人纤维蛋白原购自北京诺博莱德科技有限公司。

下述实施例中部分试剂如下：

TM表达培养基(800mL)：

用蒸馏水溶解定容至800mL。121℃高压灭菌20min，冷却。

1×PBS缓冲液(1L)：

用900mL蒸馏水溶解，浓HCl调节pH至7.4，定容至1L，真空抽滤除杂。

10mM GSH(100mL)：0.3g的还原性谷胱甘肽溶于100mL的1×PBS缓冲液，小量分装，-20℃保存。

PSP酶储存液(100mL)：

用25mM的Tris-HCl(pH8.0)溶解，定容至100mL，小量分装，-20℃保存。

50mg/mL氨苄青霉素(30mL)：称取1.5g氨苄青霉素溶解于30mL的无菌蒸馏水，用0.22μM的滤膜过滤除杂，小量分装-20℃保存。

0.1M IPTG(30mL)：称取0.715g IPIG溶解于30mL的无菌蒸馏水，用0.22μM的滤膜过滤除杂，小量分装-20℃保存。

R250染色液(1L)：

R250 1.0g

无水乙醇 420mL

冰乙酸 100mL

蒸馏水溶解定容至1L，棕色瓶室温避光保存。

G250染色液(500mL)：50mg的Brilliant Blue G-250溶于25mL的95％乙醇，加50mL磷酸溶液，用蒸馏水充分搅拌溶解，定容至500mL，避光过滤。

脱色液(1L)：

冰乙酸 50mL

无水乙醇 450mL

蒸馏水 500mL

转膜缓冲液(500mL)：

用蒸馏水定容至500mL，冰浴放置，现用现配。

洗膜缓冲液/TBST(1L)：

NaCl 5.84g

Tris 1.21g

用800mL蒸馏水溶解，调节pH值为7.5，加0.5mL的Tween-20，定容至1L。

TBS(1L)：

Tris 2.42g

NaCl 8.8g

用900mL蒸馏水溶解，调节pH值至7.4，定容至1L。

Binding Buffer：含2％脱脂奶粉，5mMCaCl₂的TBS溶液，现用现配。

Washing buffer：含0.05％Tween-20，2mMCaCl₂的TBS溶液。

ELISA显色液：

A:乙酸钠2.72g，柠檬酸钠0.32g，30％H₂O₂ 60μL，蒸馏水定容至100mL。

B:柠檬酸钠0.19g，EDTA·Na₂ 0.04g，TMB 0.03g，甘油10mL，蒸馏水溶解定容至100mL；

显色前将A液和B液等体积混合。

纤维蛋白原溶液：用20mL的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(PH7.4)溶解100mg纤维蛋白原，配置成0.5％纤维蛋白原溶液(现配现用)。

凝血酶：用质量百分含量0.9％生理盐水配置成40U/mL凝血酶溶液(现配现用)。

肝素钠溶液：生理盐水配置成200U/mL肝素钠注射液。

ADP诱导剂：用生理盐水配置成300μmol/L ADP·Na₂溶液。

RGD多肽：GA-10，序列：GCGRGDWPCA，分子量：1019.20Da。

实施例1、EA融合蛋白的获得

EA融合蛋白由Echistatin蛋白的C端通过Linker(GGGG)与AnnexinA5蛋白的N端连接，得到融合蛋白。

EA融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。

序列2第1-77位氨基酸为Echistatin蛋白，序列2第82-400位氨基酸为AnnexinA5蛋白。

序列1第1-231位核苷酸为Echistatin蛋白编码基因，序列1第244-1200位核苷酸为AnnexinA5蛋白编码基因。

一、表达EA融合蛋白基因的载体的构建

1、自行构建获得Echistatin基因

以如下表2中的E1F和E1R作为模板，E2F和E2R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

将上述PCR产物电泳，结果如图1所示，M.DNA marker；1-3.Echistatin基因，可以看出，得到231bpPCR产物。将上述PCR产物送去测序，该PCR产物为序列表中序列1第1-243位所示的Echistatin基因。

表2引物序列

2、EA融合蛋白基因的构建

表3

单下划线的分别是BamHI和XhoI的识别位点，双下滑线为互补片段4个甘氨酸序列。

分别以上述Echistatin基因和pGEX-6P-1-AnnexinA5质粒为模板，用表4所示的引物或体系分别进行PCR。

表4

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min(循环30次)；72℃延伸10min；4℃保存。

体系1和2分别得到Echistatin-L(经过测序，其核苷酸序列为序列1第1-243位，其中232-243为连接肽的编码DNA分子)和L-AnnexinA5基因(经过测序，其核苷酸序列为序列1第232-1203位，其中232-243为连接肽的编码DNA分子)。

以Echistatin-L和L-AnnexinA5基因为模板，以E3F、LAA-3分别为上、下游引物，进行PCR，得到1226bp的PCR产物(图2，M.DNAmarker；1-4为EA基因)。

将1226bp的PCR产物送去测序，其核苷酸序列为序列表中序列1，将该PCR产物命名为EA基因。

3、表达EA基因的重组载体的获得

将上述获得的序列1所示的EA基因替换表达载体PGEX-6P-1(GE Healthcare公司，产品目录号Code no.28-9546--48)的BamHI和XhoI之间的片段，得到表达EA基因的重组载体，命名为pGEX-6P-1-EA，EA基因与载体上的GST标签融合表达。

二、EA融合蛋白的表达

1、表达EA融合蛋白基因的重组菌的构建

将上述重组载体pGEX-6P-1-EA转入BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA。

菌液PCR鉴定，引物为E3F、LAA-3，结果如图3所示，M.DNA marker；1-2，特异性较好的PCR电泳；得到1226bp为阳性菌。

对照：将pGEX-6P-1转入BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1。

2、EA融合蛋白的表达条件摸索

1)最适IPTG浓度的摸索

将重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA的单菌落至5mL LB液体培养基(Amp浓度为50μg/mL)，37℃，190rpm培养过夜，得到菌液。以重组菌BL21(DE3)/pGEX-6P-1为对照。

将菌液按1:100的比例加入100mL的TM表达培养基中，37℃扩培3.5h左右达到对数期，OD₆₀₀为0.6-0.8之间，加入IPTG(终浓度设定为：0、25、50、100、150、200、300μmol/L)后，在25℃，190rpm诱导12h。在4℃，6000rpm离心15min收集菌沉。菌沉用20mL 1×PBS溶解。在等功率破碎相同的时间，4℃，12000rpm离心20min，分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE检测在不同温度下，目的蛋白的表达情况。

结果如图4所示，M.Protein marker(上样量5ul)；1.BL21(DE3)/pGEX-6P-1未加IPTG诱导表达情况；2.BL21(DE3)/pGEX-6P-1加100μM IPTG诱导表达情况；3-9.BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA加IPTG终浓度为0μM、25μM、50μM、100μM、150μM、200μM、300μM诱导表达情况；可以看出，与BL21(DE3)/pGEX-6P-1相比，BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA66kD加入IPTG有明显的70kD目的蛋白条带，为EA与载体上GST融合表达得到的重组蛋白GST-EA。

且在IPTG为100μM时，蛋白表达量较高，且不随IPTG浓度提高而增多。IPTG浓度过高易形成包涵体，并且IPTG对细胞有一定的毒性。因此，经实验探索得知IPTG诱导浓度为100μM。

2)最适表达温度的摸索

将BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA菌液按1:100的比例加入100mL的TM表达培养基中，37℃扩培3.5h左右达到对数期，OD₆₀₀为0.6-0.8之间，加入IPTG(终浓度为100μmol/L)后，分别在37℃、30℃、25℃，190rpm诱导12h。在4℃，6000rpm离心15min收集菌沉。菌沉用20mL 1×PBS溶解。在等功率破碎相同的时间，4℃，12000rpm离心20min，分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE检测在不同温度下，目的蛋白的表达情况。

结果如图5所示，1-3，37℃诱导的全蛋白、上清、包涵体；4-6，30℃诱导的全蛋白、上清、包涵体；7-9，25℃诱导的全蛋白、上清、包涵体；可以看出，由图可见，在37℃、30℃、25℃温度下诱导，目的蛋白均能大量表达，且在上清和包涵体中都存在。为方便诱导和纯化，避免包涵体错误折叠降低活性，后期大量诱导选择25℃度诱导，收集上清液进行下一步的纯化与性质研究。

(3)最适诱导时间的摸索

BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA在最适的温度25℃和100μM IPTG浓度下，诱导时间设定为0h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、20h，其他条件相同，SDS-PAGE检测蛋白随时间积累情况。

结果如图6所示，1-10.加入IPTG诱导0h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、20h全蛋白表达情况，由图可见，加入诱导剂后随时间的延长，目的蛋白逐渐增多，在11h-12h时蛋白积累量达到最大，在诱导20h全蛋白目的蛋白量有部分减少，推测是由于诱导时间过长，蛋白被降解，或是在营养物大量消耗后部分蛋白被大肠杆菌消耗。因此，后期大量表达时间应在12h左右。

3、融合蛋白EA的纯化

1)破菌

收集BL21(DE3)/pGEX-6P-1-EA在最适的温度25℃和100μM IPTG浓度下诱导12h的菌液，4℃，6000rpm离心20min，收集菌沉。称取适量菌沉，按照每克菌沉15mL1×PBS的比例充分溶解菌沉，冰浴，超声破碎悬液，功率600W，工作3s，间歇27s，共20min(40次循环)，避免产生泡沫；4℃，12000rpm离心20min，收集上清液。

2)GST亲和层析纯化

(1)装柱和平衡：将亲和介质加入到层析柱中，自然沉降。用40mL的1×PBS平衡层析柱，流速为1mL/min，调节紫外检测仪示数至零。

(2)上样和洗涤：上述1)得到的上清液，用0.45μm的针头过滤器过滤。上样流速为0.5mL/min。PBS洗涤，流速为1mL/min，直至紫外检测仪示数降至基线。

(3)洗脱：用10mM的还原性谷胱甘肽溶液洗脱目的蛋白GST-EA，流速为0.5mL/min，紫外检测仪示数上升出现峰值，收集蛋白。

(4)蛋白浓缩、除盐：将蛋白加入到30KD的超滤管，4℃，3000g离心10min，除去部分还原性谷胱甘肽，PBS稀释浓缩液，再次超滤。

(5)柱子再生和保存：用2倍介质体积的0.5M NaOH溶液洗柱子，除去非特异性吸附的杂质，用ddH₂O洗至中性，用4倍介质体积的20％乙醇洗涤，4℃保存。

(6)SDS-PAGE检测。

结果如图7所示，1.25℃诱导表达上清液；2.穿透液；3-4.洗脱得到的GST-EA，可以看出，将破碎后上清液稀释后上样到GST亲和柱，减缓流速，穿透液中目的蛋白较少，GST亲和柱效高；GSH洗脱出的蛋白纯度与产量较好，目的蛋白GST-EA纯度为92％。

3)PSP酶切除重组蛋白GST-EA的GST标签

用GST亲和层析纯化得到的GST-EA，使用PSP酶(南通表源生物技术有限公司，1000Units/mg)分别按照摩尔比例为800:1，400:1，200:1，100:1，50:1，10:1，3:1混匀(裂解buffer:0.5mol/L Tris-HCl+150mM Nacl+0.1％Triton-100,pH 8.0)，4℃，酶切12h。

SDS-PAGE检测不同比例的酶切效果，结果如图8所示，1-8.PSP酶切效果(融合蛋白与PSP酶的摩尔数比分别为800、400、300、200、100、50、10、3；9.重组蛋白GST-EA对照，可以看出，在重组蛋白GST-EA与PSP酶的摩尔数比为800酶切12h，可将重组蛋白GST-EA充分切开，证明PSP酶活性较强。8泳道中出现三个蛋白条带，由上至下分别为PSP酶(46kD)、EA(44kD)、GST标签(26kD)。9泳道中较粗条带为GST-EA(70kD)，该融合蛋白出现一定程度的标签脱落。

将GST-EA与PSP酶按照摩尔比例为800:1酶切得到的溶液样品过GST亲和层析柱，PBS洗涤，收集穿透峰，浓缩脱盐，得到洗脱液。

洗脱液进行SDS-PAGE电泳结果如图9所示，M.Protein marker；1-2.EA，可以看出，得到大小为44kD的目的融合蛋白EA。

融合蛋白EA的氨基酸序列为序列2。

4、融合蛋白EA的验证

1)Western blot验证

将纯化的AnnexinA5蛋白(按照文献的方法制备AnnexinA5蛋白：梁盼盼,张鑫蕊,井健.人Annexin A5的表达及性质研究.北京师范大学学报(自然科学版),2009,45(4):378-380.AnnexinA5蛋白编码基因的核苷酸序列为序列1的第231-1203位)、上述3得到的融合蛋白EA上样进行Western blot检测，一抗为AnnexinA5多克隆抗体，二抗为HRP-山羊抗小鼠抗体。

结果如图10所示，1.阳性对照AnnexinA5；2.融合蛋白EA，可以看出，融合蛋白EA条带略高于阳性对照条带，目的蛋白条带对比marker位置，与蛋白分子量一致。

2)分子筛(SEC-HPLC)鉴定

(1)准备：超纯水、平衡液(1×PBS)、200μL上述3得到的融合蛋白EA、10％甲醇经0.22μM的针形滤膜过滤。

(2)开机：打开四元泵、检测器等进入自检，设定参数v＝5mL/min，水洗约2个Sephacryl S200凝胶柱体积，排除气泡。

(3)平衡：用平衡液1×PBS平衡体系约2个柱体积直至基线平稳。

(4)上样：上样200μL上述3得到的融合蛋白EA，1个柱体积的平衡液进样。

(5)结束：分别用超纯水和10％甲醇清洗管道和柱子，输出图谱，分析。

结果如图11所示，图谱显示在保留时间8.150-9.093min检测到EA蛋白，在8.513min达到峰值，与HPLC测定的蛋白分子量44kD峰值参数出现时间一致，峰型对称性较好，目的蛋白EA含量的面积百分比达到92.852％，蛋白以单体形态稳定存在。

实施例2、融合蛋白EA的功能研究

一、EA脂质结合活性分析

1、EA的磷脂结合分析

(1)分别称取10mg PS(磷脂酰丝氨酸，phosphatidylserine,购自北京华迈科生物技术有限公司)和PC(磷脂酰胆碱，phosphatidylcholine，购自北京利维宁生物科技有限公司)溶解于10mL氯仿中，向每个酶标孔中加入2.5μg，放于通风橱中待溶剂挥发完全，磷脂吸附到聚苯乙烯表面上。

(2)封闭：每孔中加入100μL TBS配置5％(w/v)脱脂奶粉的封闭液，封口膜封板，37℃封闭2h。弃去封闭液，每孔加入200μLwashing buffer，静置3min弃去，重复3次。充分除净液体。

(3)Binding buffer将实施例1的纯化的融合蛋白EA和AnnexinA5蛋白稀释不同浓度，向每孔加入50μL蛋白样品，37℃温育2h，washing buffer洗涤3次，方法同上。

(4)孵一抗：binding buffer以1：10000比例稀释一抗(小鼠抗AnnexinA5多克隆抗体)，每孔加100μL，37℃孵育1h，washing buffer洗涤3次。

(5)孵二抗：binding buffer以1：5000比例稀释二抗(HRP-山羊抗鼠IgG抗体)，每孔加100μL，37℃孵育1h，washing buffer洗涤6次，ddH₂O洗涤3次，用滤纸吸干水分。

(6)显色：将TMB显色液A、B等体积混合，每孔加入140μL，暗处反应10min，此时呈现不同程度的蓝色。

(7)终止反应：每孔加入40μL 2mol/LH₂SO₄，反应孔中蓝色变为黄色，稳定5min。

(8)用酶标仪450nm处测定各孔的吸光度。

该Elisa过程是磷脂吸附-AnnexinA5包被-AnnexinA5小鼠源抗体特异结合-HRP标记山羊抗小鼠抗体孵育-TMB应用液显色生成有色产物，在λ＝450nm测定吸光值，AnnexinA5与磷脂结合活性越强，吸光值越高。磷脂(PS或PC)吸附在酶标板上，AnnexinA5分子与不同磷脂结合能力不同，AnnexinA5包被磷脂程度成剂量依赖关系。

结果如图12所示，可以看出，AnnexinA5与PS结合活性随着蛋白浓度的升高而增强；AnnexinA5不与PC结合。与AnnexinA5相比，EA蛋白磷脂结合性质与趋势没有明显区别，说明Echistatin没有遮挡AnnexinA5与PS作用位点。AnnexinA5浓度为50μg/mL时，与2.5μgPS结合已趋向饱和。

2、磷脂剂量与磷脂结合分析

各孔中EA为50μL,50μg/mL。将PS的剂量设定为0μg、0.4μg、0.8μg、1.2μg、1.6μg、2.0μg、2.4μg、2.8μg、3.2μg，其他步骤同上述1。

结果如图13所示，由图可见，不同剂量PS固定在酶标板上，EA与PS结合呈现出剂量依赖关系，在PS>2.5μg，蛋白与PS结合逐步达到饱和。

3、钙离子浓度与磷脂结合分析

各孔中EA为50μL,20μg/mL，PS剂量为2.5μg，binding buffer中Ca²⁺浓度设定为0mM、0.01mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1.0mM、3mM、5mM、10mM、20mM、50mM、100mM。其他步骤同上。

结果如图14所示，AnnexinA5是钙离子依赖磷脂结合蛋白，Ca²⁺存在时与带负电荷的PS可逆性结合，在Ca²⁺浓度为0.5-10mM之间，EA与PS结合活性随Ca²⁺浓度增高而提升。

二、EA对血浆凝血时间影响分析

(1)向每个酶标孔中加入2.5μg PS(氯仿为溶剂)，置于通风橱中挥发溶剂。

(2)每孔中加100μL的5％脱脂奶粉(TBS配制)，37℃封闭2h，washing buffer洗涤3次。

(3)用binding buffer稀释EA为不同浓度，每孔加50μL蛋白稀释液，37℃孵育2h，washing buffer洗涤3次。

(4)制备50％血浆(PBS为溶剂)，每孔加入100μL，37℃孵育3min。每孔加入25μL0.08M CaCl₂(Ca²⁺终浓度为16mM)，即时血浆开始凝固，设定波长为405nm，平均每5min检测各孔吸光度。

本实验用1:9枸橼酸钠抗凝血浆。向去Ca²⁺的抗凝血浆中重新加入Ca²⁺(CaCl₂溶液)，血液发生凝固。从加入Ca²⁺至血浆凝固这一过程经历的时间为血浆凝固时间，Ca²⁺、磷脂与活化的凝血因子VIII结合形成复合物，后者激活凝血因子X。Ca²⁺、磷脂、凝血因子V存在时，活化的凝血因子X与之共同作用，将凝血酶原激活转化为凝血酶，凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，达到血浆凝固的效果。

结果如图15所示，用酶标仪检测不同血浆样品的浊度动态变化。随着EA浓度增加，血浆凝固时间出现明显的延长，血浆在405nm吸光度在同时间点明显降低，血浆浊度较低。EA与PS结合，阻止PS参与血浆中的凝血因子X活化，从而达到延长RT、减少纤维蛋白产量、降低血浆浊度的效果。

三、抗血小板聚集活性分析

EA蛋白是去整合素Echistatin与AnnexinA5通过Linker连接的融合蛋白，Echistatin是含有RGD序列的凝血抑制物，RGD序列可识别并特异性结合血小板GPIIb/IIIa受体，AnnexinA5能够结合血小板活化后外翻的PS。

(1)准备工作：将三种具有抗血小板聚集的蛋白(EA蛋白、RGD序列、AnnexinA5)稀释成不同浓度；开机机器自检，进入ADP聚集实验界面。

(2)用蓝色1：9枸橼酸钠抗凝管收集人全血，摇匀后800rpm离心8min，黄色上清液为富血小板血浆(PRP)，取出PRP，管中剩余液体3000rpm离心10min，上清液为贫血小板血浆(PPP)。

(3)将300μl的PPP加入测试杯中，放到测试通道中按“PPP”键调零。

(4)将300μl的PRP加入测试杯中，加入测试棒，放置在左侧预温面板区域进行预温。放入调零的同一通道，按下该通道的预温键，界面显示时间开始从60s减少，至13-15s，加入10μlADP(终浓度为10μM)同时按下绿色按钮，开始测试，3min出现空白组血浆的最大聚集率。

(5)以同种方法测试给药组血浆，将300μlPRP与30μl的蛋白样品在EP管混匀，取300μl给药组血浆加入到测试杯，步骤同上。蛋白样品有四种不同浓度的EA、AnneixnA5、RGD多肽(序列为GCGRGDWPCA，M＝1019.20Da)。

(6)蛋白对ADP诱导的血小板聚集的抑制率公式为：

结果如图16所示，图中可见，随着三种蛋白药物浓度增加，ADP诱导血小板聚集的抑制率增强；EA效果最好，EA的IC50＝4μmol/L，在10μmol/L时抑制率高达90％，呈现出AnnexinA5、RGD序列、去整合素在抑制血小板聚集的协同效应。

四、凝血四项的测定

用蓝色1：9枸橼酸钠抗凝管收集人全血，摇匀，3000rpm离心10min，取上层贫血小板血浆(PPP)。在每个测定杯子中加入300μL的PPP和30μL的蛋白样品(PBS为对照)混匀，37℃孵育10min，全自动凝血分析仪测定结果。

结果如下表5所示，

表5.EA对血浆凝血四项的作用

在凝血四项检测中EA随着蛋白浓度的增高能够明显延长APTT，超过正常参考值，而PT变化幅度不大，FIB、TT值没有临床意义的改变。APTT是评价内源性凝血系统状况，如凝血因子XII、XI、IX、X，以上凝血因子的减少会引起APTT的延长。推测EA能够结合Ca²⁺、磷脂，使X因子不能充分活化，影响内源凝血途径，进而会影响共同凝血途径。

五、EA对GPIIb/IIIa受体亲和性分析

(1)用枸橼酸钠抗凝管收集人全血1ml混匀，取血4h内以室温条件800rpm离心8min，上清液为富血小板血浆(PRP)。

(2)按照以下表6依次加样：

表6

将管中液体轻轻混匀，终体积为50μl，室温下孵育10min。其中用来激活血小板的ADP终浓度为2μmol/L。

RGD序列为GCGRGDWPCA，分子量为1019.20Da，含有与GPIIb/IIIa受体特异性识别结合的RGD序列。

(3)固定：在各管中加入450μl的4％多聚甲醛，室温固定45min。

(4)荧光抗体标记：在各管分别加入5μl FITC标记的羊抗人纤维蛋白原抗体，在37℃孵育30min。

(5)流式细胞术检测：设定激发波长为488nm，检测荧光强度。

本实验中FITC标记的纤维蛋白原可结合GPIIb/IIIa受体，使血小板标记上FITC荧光。EA含RGD序列，RGD可与纤维蛋白原竞争结合GPIIb/IIIa受体，理论上来说，EA蛋白浓度越高，RGD序列含量越高，结合GPIIb/IIIa受体能力越强，流式细胞术检测到血小板的荧光强度减弱会越明显。

结果如图17所示，1-5.加入PBS，10μMRGD多肽，20μM EA，10μM EA，5μM EA选定血小板与荧光信号图；6.1-5荧光强度叠加图；7.1-5荧光强度值；血小板被2μmol/L的ADP激活，GPIIb/IIIa受体能够结合纤维蛋白原，在血小板粘附、聚集过程中发挥重要作用。实验结果表明，10μM RGD肽(阳性对照)和EA蛋白在一定程度上能够减弱血小板的平均荧光强度；随着蛋白浓度增高，平均荧光强度有减弱趋势。EA融合蛋白中RGD序列没有被蛋白分子结构所遮挡，可以被相关受体特异识别结合。

六、EA在小鼠体内出血风险评估

运用小鼠尾部横截模型评价体内出血风险。昆明小白鼠，雌性，24-26g，5周龄。腹腔注射1％戊巴比妥钠0.1ml进行麻醉，眼球后静脉丛注射给药。

EA实验组为不同浓度的EA溶液(溶质为EA，溶剂为生理盐水)，剂量分别为0.01μmol/kg、0.039μmol/kg、0.187μmol/kg；

阴性对照组为同体积的生理盐水；

阳性对照组为肝素钠溶液(Heparin)，剂量为200U/kg；

单独A5组为不同浓度的AnnexinA5溶液(溶质为EA，溶剂为生理盐水)，剂量分别为0.038μmol/kg、0.085μmol/kg、0.2μmol/kg。

注射给药20min后，距尾端6mm处横截，立即将出血尾部放置入37℃生理盐水中浸泡观察出血状况，记录出血至停止出血的时间。

将EA设置为不同浓度，采用鼠尾横截模型记录小鼠体内出血时间，进而评估不同浓度蛋白的出血风险。

结果如图18所示，*是与生理盐水组对比差异显著(P<0.05)，#是与肝素组对比差异显著(P<0.05)。实验中，与生理盐水组对比，EA实验组出血时间差异显著；当给药浓度增大3.9倍，出血时间长于肝素组(200μmol/kg)，且差异显著。

单独A5组0.038μmol/kg剂量的出血时间为193s、0.085μmol/kg剂量的出血时间为289s、0.2μmol/kg剂量的出血时间为1142s。

相比较单独的Annexin A5，EA的体内出血时间明显延长，表明EA的体内活性强于单独的Annexin A5。

当提高EA浓度，随着蛋白浓度的增高，出血时间明显延长，出血风险增加。为保证体内用药的安全低风险性，建议低浓度用药。

Claims

1.融合蛋白，包括Echistatin蛋白和AnnexinA5蛋白。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白由Echistatin蛋白的C端通过连接肽与AnnexinA5蛋白的N端连接得到。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述连接肽为4个甘氨酸。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为如下1)或2):

1)序列表中序列2所示的蛋白质；

5.编码权利要求1-4中任一所述融合蛋白的DNA分子。

6.如权利要求5所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

7.含有权利要求5或6所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

8.权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗血栓中的应用；

或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗血小板聚集中的应用；或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗凝血中的应用；

或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗血栓产品中的应用；

或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗血小板聚集产品中的应用；

或，权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备抗凝血产品中的应用。

9.一种具有如下1)-3)中至少一种功能的产品，包括权利要求权利要求1-4中任一所述融合蛋白或权利要求5或6所述DNA分子或权利要求7所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

1)抗血栓；

2)抗血小板聚集；

3)抗凝血。

10.根据权利要求8所述的应用或权利要求9所述的产品，其特征在于：所述产品为药物。