CN106187705B - 一种从南极磷虾中纯化制备2,6-二叔丁基对甲酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从南极磷虾中纯化制备2,6‑二叔丁基对甲酚的方法，通过薄层层析刮板法制备含有2,6‑二叔丁基对甲酚的粗样品。将标准品与粗样品进行高效液相色谱分析，根据保留时间确定粗样品中含有2,6‑二叔丁基对甲酚，但同时也发现部分杂质，为了得到纯度更高的样品，采用制备型色谱柱进一步分离纯化，得到了纯度更高的样品，纯度为96.05%。本发明所述方法操作简单、结果准确、可靠、稳定，样品纯度高，是一种良好的纯化制备2,6‑二叔丁基对甲酚的方法。
Description
技术领域
本发明属于食品和化学领域，具体涉及一种从南极磷虾中纯化制备2,6-二叔丁基对甲酚的方法。
背景技术
南极磷虾(Euphausia superba)是生活于南极生态系统中的一种重要的生物资源，属于节肢动物门、甲壳纲、磷虾目，磷虾的寿命一般为5-7年，2龄以后即成熟，体长最大可达到60mm以上。南极磷虾具有结群的习性，经常生活在200m以内的浅水层形成密集的群体，是鸟类和鱼类等南极生物主要的食物来源。南极磷虾是地球上数量最大繁衍最成功的单种生物资源之一，其生物蕴藏量约为6.5×108～10×108吨，最新估算量为3.79×108吨。南极磷虾含有丰富的油脂，油脂中的抗氧化物质如虾青素、虾青素酯、不饱和脂肪酸、2，6-二叔丁基对甲酚等。
2，6-二叔丁基对甲酚(缩写为BHT)是国内外广泛使用的油溶性抗氧化剂，抗氧化能力较强，耐热及稳定性好。主要可以用于油脂等食品添加中，防止其酸败，维持食品的颜色和气味等，还广泛用于高分子材料、石油制品、和食品加工工业中。
目前2，6-二叔丁基对甲酚较常见的制备方法为化学合成方法，并未见在南极磷虾中的提取纯化的研究报道。因此，研究一种从南极磷虾中提取纯化的2，6-二叔丁基对甲酚的方法，这对南极磷虾资源的开发利用以及2，6-二叔丁基对甲酚的制备具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、准确、可靠的南极磷虾2，6-二叔丁基对甲酚的纯化制备方法。
本发明采用下述技术方案：
一种从南极磷虾中纯化制备2,6-二叔丁基对甲酚的方法，包括以下工序：
制备粗提物的工序：南极磷虾用甲醇进行提取，得到2,6-二叔丁基对甲酚粗提物；
第一次纯化工序：该工序采用薄层层析刮板法对2,6-二叔丁基对甲酚粗提物进行纯化，得到2,6-二叔丁基对甲酚粗样品；所述薄层层析中以体积比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-5:1-2:0.5-1为展开剂；
定性工序：该工序采用分析型高效液相色谱法对2,6-二叔丁基对甲酚粗样品进行定性分析，根据保留时间确定所述第一次纯化工序的粗样品中含有2,6-二叔丁基对甲酚；
第二次纯化工序：该工序采用制备型高效液相色谱法对2,6-二叔丁基对甲酚粗样品进行分离纯化，在目标保留时间内将含有2,6-二叔丁基对甲酚的洗脱液接出，蒸发除去溶剂得到纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚样品。
本发明的制备粗提物的工序中，所述提取方法采用超声波提取，超声波提取条件为：室温、300-400W、20或40kHz，提取时间为10-20分钟；优选的，所述超声波提取条件为：室温、350W、40kHz、提取时间为15分钟。
制备2,6-二叔丁基对甲酚粗体物的具体操作方法为：将南极磷虾与甲醇进行超声波提取，过滤提取液，得到滤液，将所述滤液蒸干，然后用甲醇溶解，即得到2,6-二叔丁基对甲酚粗提物。
其中，所述南极磷虾选用新鲜南极磷虾，从提高2,6-二叔丁基对甲酚的观点出发，所述南极磷虾与甲醇的添加量比例为1g：(3～6)mL，采用此比例的南极磷虾和甲醇提取为后续纯化提供了良好的基础。
本发明的第一次纯化工序中：所述薄层层析刮板法的基本操作为本领域技术人员所公知的技术手段，基本操作步骤为：点样、展开、显色、刮板、洗脱。
对于薄层层析方法的分离纯化的效果十分重要的因素是展开剂，在展开剂的选取过程中，尝试了多种组合：氯仿：甲醇：乙酸、氯仿：乙酸乙酯、氯仿：乙酸乙酯：乙酸、乙酸乙酯：丙酮：石油醚等，但是2,6-二叔丁基对甲酚的Rf值偏高，且拖尾严重。因此选取极性较低的展开剂组合，通过尝试各溶剂间组合和体积的配比，最终确定了石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-5:1-2:0.5-1(V/V/V)为最适展开剂，此时南极磷虾中的2,6-二叔丁基对甲酚得到了很好的分离纯化，且Rf值合适。
本发明中的薄层层析刮板法，本发明选取高效薄层硅胶板H板(10×20cm)，展距为8～10cm(优选9cm)；染色采用氯化铁水溶液进行染色，100～110℃烘烤5-10分钟，根据显色结果，确定2,6-二叔丁基对甲酚的Rf＝0.79，其中，所述氯化铁水溶液的质量分数为4～6％；洗脱时采用甲醇进行溶解；采用甲醇溶解后，进行超声波提取，超声波条件为：超声时间为5～8min，功率为300～400W。
优选的，制备2,6-二叔丁基对甲酚粗样品的具体操作方法为：
取2,6-二叔丁基对甲酚粗提物和标准液点于高效薄层硅胶板H板上，以体积比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-5:1-2:0.5-1为展开剂，展距9.0cm，展完后晾干展板；在距离高效薄层硅胶板H板设定处用玻璃钢刀沿竖直方向割下小部分薄层板，将割下的薄层硅胶板H板用氯化铁水溶液进行染色，然后进行烘烤，根据显色结果，确定割下的薄层硅胶板H板中2,6-二叔丁基对甲酚的位置(Rf＝0.79)处，对照薄层硅胶板H板上未被染色部分，将处于同一Rf值处的色谱带刮下，将硅胶粉末放入离心管中，用色谱级甲醇溶解、震荡。将离心管进行超声提取5-8min，功率设置为300～400W。超声完成后，将离心管放入离心机中进行离心，收集上清液，重复进行刮板-超声-离心-收集上清液过程若干次(优选10次)，将收集到的上清液蒸发除去甲醇，得到2,6-二叔丁基对甲酚色谱带的浓缩液，即为2,6-二叔丁基对甲酚粗样品。其中，所述标准液的制备方法如下：称取2,6-二叔丁基对甲酚标准品1mg，加色谱级甲醇定容至1mL，得到浓度为1mg/mL的标准液。
分析型高效液相色谱法能够全面反映样品组成信息，并对各组分进行定量和定性，采用分析型高效液相色谱仪完成；而制备型液相色谱方法主要是对产品的单体进行提取纯化和鉴别。本发明中的定性工序和第二次纯化工序中，高效液相色谱法参数均如下：色谱柱为C18柱，流动相为甲醇：水＝8～10:1(v/v)；洗脱模式为等度洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，进样量为8～12μL。优选的参数如下，流动相为甲醇：水＝9:1；流速为1mL/min；洗脱时间为16-18min；进样量为10μL；检测器为紫外/可见光检测器，检测波长为210nm。
本发明的定性工序中，所述分析型高效液相色谱法的条件为：色谱柱为C18柱，优选的型号是YMC-Pack ODS-A，内径和长度250×4.6mm，粒径：5μm，孔径：12nm。
定性工序的具体操作方法为：按照设定好的参数和条件，称取2,6-二叔丁基对甲酚标准品1mg，加色谱级甲醇定容至1mL，得到浓度为1mg/mL的标准液，经微孔滤膜(优选孔径为0.45μm)过滤后进样。取2,6-二叔丁基对甲酚粗样品，用色谱级的甲醇进行溶解，用微孔滤膜(优选孔径为0.45μm)过滤后进样，用色谱柱(YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm，5μm，12nm)进行检测，对检测结果中的峰进行分析，比较标准品与样品中峰的保留时间，通过保留时间对2,6-二叔丁基对甲酚的存在进行定性；对色谱峰手动积分，显示样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比，与标准品积分结果进行对比，确定样品的纯度。
本发明的第二次纯化工序中，所述制备型高效液相色谱法的条件为：色谱柱为C18柱，优选的型号是YMC-Pack ODS-A，内径和长度：250×10mm，填料粒径：5μm，孔径：12nm。
第二次纯化工序的具体操作方法为：
将2,6-二叔丁基对甲酚粗样品，结合对粗样品的纯度分析，按照设定好的参数和条件，利用制备型色谱柱(YMC-Pack ODS-A 250×10mm，5μm，12nm)将粗样品进行进一步纯化与制备。在目标保留时间内，将含有样品的洗脱液接出，重复操作，收集合并洗脱液后进行蒸发，得到纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚浓缩物。
采用以上方法制备得到的含有2,6-二叔丁基对甲酚的南极磷虾样品，该样品中2,6-二叔丁基对甲酚的含量较高，可达96％以上。
上述技术方案中的一个技术方案具有如下有益效果：
(1)本发明首次发现了南极磷虾中存在天然抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚，打破了2,6-二叔丁基对甲酚只能人工合成的传统观点，为2,6-二叔丁基对甲酚的制备提供一种新的思路和途径，对南极磷虾资源的开发和利用也具有十分重要的意义。
(2)针对南极磷虾这一特定的海洋动物，本发明提供了纯化制备南极磷虾2,6-二叔丁基对甲酚的良好方法，该方法简单、准确、可靠、稳定，得到的样品中2,6-二叔丁基对甲酚的纯度可达96％以上。
(3)本发明针对南极磷虾中的2,6-二叔丁基对甲酚，首先采用甲醇预处理南极磷虾得到含有2,6-二叔丁基对甲酚的粗提物，然后选取薄层层析刮板法制备含有2,6-二叔丁基对甲酚的粗样品，再通过分析型高效液相色谱法进行成分分析，根据保留时间确定粗样品中含有2,6-二叔丁基对甲酚，但同时还发现部分杂质，最后采用制备型高效液相色谱法分离得到高纯度的2,6-二叔丁基对甲酚。本发明在制备南极磷虾中的2,6-二叔丁基对甲酚选用了合适的提取、分离和纯化的方法，使得本发明能够顺利高效从南极磷虾中制备得到高纯度的2,6-二叔丁基对甲酚。
附图说明
图1是2,6-二叔丁基对甲酚标准品的高效液相色谱图。
图2是2,6-二叔丁基对甲酚标准品的高效液相色谱峰面积积分图。
图3是实施例1中的BHT粗样品的高效液相色谱图。
图4是实施例1中的纯化后样品的高效液相色谱图。
图5是实施例1中的纯化后样品的高效液相色谱峰面积积分图。
图6是实施例1中的纯化后的高效薄层硅胶板，其中，A、2,6二叔丁基对甲酚样品，B、2,6-二叔丁基对甲酚标准品。
图7是实施例2中的纯化后的高效薄层硅胶板，其中，A、2,6二叔丁基对甲酚样品，B、2,6-二叔丁基对甲酚标准品。
图8是实施例3中的纯化后的高效薄层硅胶板，其中，A、2,6二叔丁基对甲酚样品，B、2,6-二叔丁基对甲酚标准品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
取新鲜的南极磷虾10g(w)和甲醇(v)以1:3的比例在室温、350w、40kHz的条件下超声提取15分钟，过滤提取液。将上述滤液置于旋蒸仪中蒸干，用甲醇溶解，得到2，6-二叔丁基对甲酚的粗提物。精密称取1mg 2，6-二叔丁基对甲酚标准品溶于1.0mL甲醇，得浓度为1mg/ml的标准液。取待检测的粗提物和标准液点于高效薄层硅胶板H板(10×20cm)上，以体积比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4:1:0.5为展开剂，展距9.0cm，展完后晾干展板；在距离薄层板1cm处用玻璃钢刀沿竖直方向割下小部分薄层板，将割下的薄层板用5％氯化铁水溶液进行染色，105℃烘烤5分钟，根据显色结果，确定割下的薄层板中2,6-二叔丁基对甲酚的位置(Rf＝0.79)处，如图6，对照薄层板上未被染色部分，将处于同一Rf值处的色谱带刮下，一般为每块板5-6mg，将硅胶粉末放入4mL离心管中，用2mL色谱级甲醇溶解、震荡。将离心管进行超声提取5min，功率设置为350W。超声完成后，将离心管放入离心机中，调控转速为8000rpm，离心5min，收集上清液，重复进行刮板-超声-离心-收集上清液过程10次，将收集到的上清液利用旋转蒸发仪蒸发除去甲醇，得到2,6-二叔丁基对甲酚色谱带的浓缩液，作为初步制备得到的粗样品。
高效液相色谱法分离参数如下：流动相为甲醇：水＝9:1；洗脱模式为等度洗脱；流速为1mL/min；洗脱时间为16min；进样量为10μL；检测器为紫外/可见光检测器，检测波长为210nm。按照设定好的参数和条件，称取2,6-二叔丁基对甲酚标准品1mg，加色谱级甲醇定容至1mL，得到浓度为1mg/mL的标准液，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样。取经刮板得到的粗样品，用色谱级的甲醇进行溶解，用0.45μm的微孔滤膜过滤后进样，用色谱柱(YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm，5μm，12nm)进行检测，检测结果如图1、图2和图3，对检测结果中的峰进行分析，比较标准品与样品中峰的保留时间，通过保留时间对2,6-二叔丁基对甲酚的存在进行定性；对色谱峰手动积分，显示样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比，与标准品积分结果进行对比，确定样品的纯度。以刮板法制得的2,6-二叔丁基对甲酚粗样品，结合对粗样品的纯度分析，利用制备型色谱柱(YMC-Pack ODS-A250×10mm，5μm，12nm)将粗样品进行进一步纯化与制备。在目标保留时间内，将含有样品的洗脱液接出，重复操作，收集合并洗脱液后用旋转蒸发仪进行旋转蒸发，得到纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚浓缩物。取纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚浓缩物用色谱级甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样检测，检测结果如图4和图5，对色谱峰手动积分，显示样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比，与标准品积分结果进行对比，确定样品的纯度为96.05％。
实施例2
取新鲜的南极磷虾10g(w)和甲醇(v)以1:5的比例在室温、300w、20kHz的条件下超声提取10分钟，过滤提取液。将上述滤液置于旋蒸仪中蒸干，用甲醇溶解，得到2，6-二叔丁基对甲酚的粗提物。精密称取1mg 2，6-二叔丁基对甲酚标准品溶于1.0mL甲醇，得浓度为1mg/ml的标准液。取待检测的粗提物和标准液点于高效薄层硅胶板H板(10×20cm)上，以体积比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-2:1为展开剂，展距9.0cm，展完后晾干展板；在距离薄层板1cm处用玻璃钢刀沿竖直方向割下小部分薄层板，将割下的薄层板用5％氯化铁水溶液进行染色，105℃烘烤8分钟，根据显色结果，确定割下的薄层板中2,6-二叔丁基对甲酚的位置(Rf＝0.79)处，如图7，对照薄层板上未被染色部分，将处于同一Rf值处的色谱带刮下，一般为每块板5-6mg，将硅胶粉末放入4mL离心管中，用2mL色谱级甲醇溶解、震荡。将离心管进行超声提取6min，功率设置为350W。超声完成后，将离心管放入离心机中，调控转速为8000rpm，离心6min，收集上清液，重复进行刮板-超声-离心-收集上清液过程10次，将收集到的上清液利用旋转蒸发仪蒸发除去甲醇，得到2,6-二叔丁基对甲酚色谱带的浓缩液，作为初步制备得到的粗样品。
高效液相色谱法分离参数如下：流动相为甲醇：水＝9:1；洗脱模式为等度洗脱；流速为1mL/min；洗脱时间为16-18min；进样量为10μL；检测器为紫外/可见光检测器，检测波长为210nm。按照设定好的参数和条件，称取2,6-二叔丁基对甲酚标准品1mg，加色谱级甲醇定容至1mL，得到浓度为1mg/mL的标准液，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样。取经刮板得到的粗样品，用色谱级的甲醇进行溶解，用0.45μm的微孔滤膜过滤后进样，用色谱柱(YMC-PackODS-A 250×4.6mm，5μm，12nm)进行检测，对检测结果中的峰进行分析，比较标准品与样品中峰的保留时间，通过保留时间对2,6-二叔丁基对甲酚的存在进行定性；对色谱峰手动积分，显示样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比，与标准品积分结果进行对比，确定样品的纯度。以刮板法制得的2,6-二叔丁基对甲酚粗样品，结合对粗样品的纯度分析，利用制备型色谱柱(YMC-Pack ODS-A 250×10mm，5μm，12nm)将粗样品进行进一步纯化与制备。在目标保留时间内，将含有样品的洗脱液接出，重复操作，收集合并洗脱液后用旋转蒸发仪进行旋转蒸发，得到纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚浓缩物。取纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚浓缩物用色谱级甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样检测，对色谱峰手动积分，显示样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比，与标准品积分结果进行对比，确定样品的纯度为96.05％
实施例3
取新鲜的南极磷虾10g(w)和甲醇(v)以1:6的比例在室温、400w、40kHz的条件下超声提取20分钟，过滤提取液。将上述滤液置于旋蒸仪中蒸干，用甲醇溶解，得到2，6-二叔丁基对甲酚的粗提物。精密称取1mg 2，6-二叔丁基对甲酚标准品溶于1.0mL甲醇，得浓度为1mg/ml的标准液。取待检测的粗提物和标准液点于高效薄层硅胶板H板
(10×20cm)上，以体积比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝5:1:1为展开剂，展距9.0cm，展完后晾干展板；在距离薄层板1cm处用玻璃钢刀沿竖直方向割下小部分薄层板，将割下的薄层板用5％氯化铁水溶液进行染色，105℃烘烤5-10分钟，根据显色结果，确定割下的薄层板中2,6-二叔丁基对甲酚的位置(Rf＝0.79)处，如图8，对照薄层板上未被染色部分，将处于同一Rf值处的色谱带刮下，一般为每块板5-6mg，将硅胶粉末放入4mL离心管中，用2mL色谱级甲醇溶解、震荡。将离心管进行超声提取8min，功率设置为350W。超声完成后，将离心管放入离心机中，调控转速为8000rpm，离心8min，收集上清液，重复进行刮板-超声-离心-收集上清液过程10次，将收集到的上清液利用旋转蒸发仪蒸发除去甲醇，得到2,6-二叔丁基对甲酚色谱带的浓缩液，作为初步制备得到的粗样品。
高效液相色谱法分离参数如下：流动相为甲醇：水＝9:1；洗脱模式为等度洗脱；流速为1mL/min；洗脱时间为16-18min；进样量为10μL；检测器为紫外/可见光检测器，检测波长为210nm。按照设定好的参数和条件，称取2,6-二叔丁基对甲酚标准品1mg，加色谱级甲醇定容至1mL，得到浓度为1mg/mL的标准液，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样。取经刮板得到的粗样品，用色谱级的甲醇进行溶解，用0.45μm的微孔滤膜过滤后进样，用色谱柱(YMC-PackODS-A250×4.6mm，5μm，12nm)进行检测，对检测结果中的峰进行分析，比较标准品与样品中峰的保留时间，通过保留时间对2,6-二叔丁基对甲酚的存在进行定性；对色谱峰手动积分，显示样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比，与标准品积分结果进行对比，确定样品的纯度。以刮板法制得的2,6-二叔丁基对甲酚粗样品，结合对粗样品的纯度分析，利用制备型色谱柱(YMC-Pack ODS-A 250×10mm，5μm，12nm)将粗样品进行进一步纯化与制备。在目标保留时间内，将含有样品的洗脱液接出，重复操作，收集合并洗脱液后用旋转蒸发仪进行旋转蒸发，得到纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚浓缩物。取纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚浓缩物用色谱级甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样检测，对色谱峰手动积分，显示样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比，与标准品积分结果进行对比，确定样品的纯度为96.05％。
Claims (13)
1.一种从南极磷虾中纯化制备2,6-二叔丁基对甲酚的方法，其特征是，包括以下工序：
制备粗体物的工序：将南极磷虾与甲醇接触而进行提取，得到2,6-二叔丁基对甲酚粗提物；
第一次纯化工序：该工序采用薄层层析刮板法对2,6-二叔丁基对甲酚粗提物进行纯化，得到2,6-二叔丁基对甲酚粗样品；其中，所述薄层层析中以体积比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-5:1-2:0.5-1为展开剂；
定性工序：该工序采用分析型高效液相色谱法对2,6-二叔丁基对甲酚粗样品进行定性分析，根据保留时间确定所述第一次纯化工序的粗样品中含有2,6-二叔丁基对甲酚；
第二次纯化工序：该工序采用制备型高效液相色谱法对2,6-二叔丁基对甲酚粗样品进行分离纯化，得到纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚样品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述制备粗提物的工序中，所述提取方法采用超声波提取，超声波提取条件为：室温、300-400W、20或40kHz、提取10-20分钟。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是：优选的，所述超声波提取条件为：20-40℃、350W、40kHz、提取15分钟。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述第一次纯化工序中，选取高效薄层硅胶板H板，展距为8～10cm；染色采用氯化铁水溶液进行染色，100～110℃烘烤5-10分钟。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是：优选的，所述氯化铁水溶液的质量分数为4～6％；洗脱时采用甲醇进行溶解。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述定性工序和第二次纯化工序中，所述高效液相色谱法参数均如下：色谱柱为C18柱，流动相为甲醇：水的体积比为8～10:1；洗脱模式为等度洗脱。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是：所述流动相为甲醇：水的体积比为9:1。
8.如权利要求6所述的方法，其特征是：所述高效液相色谱法参数还包括：流速为0.8～1.2mL/min，洗脱时间为16-18min，进样量为8～12μL；检测器为紫外/可见光检测器，检测波长为210nm。
9.如权利要求8所述的方法，其特征是：优选的，流速为1mL/min，进样量为10μL。
10.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述定性工序中，所述分析型高效液相色谱法采用的色谱柱为YMC-Pack ODS-A。
11.如权利要求10所述的方法，其特征是：优选的，其内径和长度250×4.6mm，粒径：5μm，孔径：12nm。
12.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述第一次纯化工序和定性工序中，采用的标准液的制备方法如下：称取2,6-二叔丁基对甲酚标准品1mg，加色谱级甲醇定容至1mL，得到浓度为1mg/mL的标准液。
13.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述第二次纯化工序中，所述制备型高效液相色谱法采用的色谱柱为YMC-Pack ODS-A，其内径和长度：250×10mm，填料粒径：5μm，孔径：12nm。
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