CN1061811C - 钝顶螺旋藻新品系选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钝顶螺旋藻新品系选育方法，对钝顶螺旋藻出发品系用80-120μg/mlNTG进行诱变，诱变后的悬浮液在1800-2200Lux，25-29℃连续光照下静置培养7-10天，加入0.3-0.5mMSAN9785进行筛选，筛选出的抗SAN9785突变株在基本培养平板上划线纯化，扩大培养。本发明方法易行，提高了筛选机率，缩短时间，新品系稳定可靠，γ-亚麻酸含量高，适用工厂化生产。
Description
本发明涉及一种螺旋藻品系选育方法，更具体涉及一种筛选高含量γ-亚麻酸螺旋藻品系的选育方法。
目前，月见草种子是γ-亚麻酸的主要资源，茶子、琉璃苣、被孢霉素和真菌也含有γ-亚麻酸。大量培养真菌来生产γ-亚麻酸困难大，高等植物的γ-亚麻酸含量仅占总脂肪酸含量的8-12％，且伴随十八碳四烯酸产生，分离它费用昂贵，生产周期长，产量低，不能满足γ-亚麻酸的需求。
近二十年来国内外螺旋藻生物技术产业化飞速发展，以高蛋白著称的螺旋藻γ-亚麻酸含量占总脂肪酸含量的25％左右，所以螺旋藻成为γ-亚麻酸的新资源具有很大潜力。目前国外已成功地利用一些培养条件来提高真核藻类不饱和脂肪酸的含量，但此法对螺旋藻不起作用，因为这些培养条件同时使其生长受到了抑制，而γ-亚麻酸的含量与生物量紧密相关。Cohen等人发现除草剂SAN9785能抑制螺旋藻的生长，同时也使得螺旋藻的γ-亚麻酸和亚油酸含量降低，硬脂酸和油酸含量升高，表明SAN9785对螺旋藻脂肪酸合成中的△6去饱和起抑制作用，[Cohen，Z.Norman，H.A.and heimer，Y.M1993.Potential use of substitutedpyridazinones for selecting polyunsaturated fatty acid overproducingcell lines of algae，phytochem；32(2)，PP：259-264]Cohen等人用逐步增加培养液中SAN9785浓度(0.2mM-0.4mM)来驯化培养螺旋藻，提高其抗SAN9785能力，从中筛选出γ-亚麻酸含量较高的螺旋藻SRS-1h品系(γ-亚麻酸含量为1.43％占干重)，此方法主要是通过外界因子SAN9785胁迫螺旋藻品系而提高其抗性，因此，筛选机率较小，所得品系稳定性值得考虑，而且工作量大，周期长，至少需几个月，另外，由于某些原因此品系未用于生产上，仅停留在实验室水平(Cohen，ZDidi，s.and Heimer，Y.M1992，Overproduction ofγ-Linolenicand Eicodsapentaenoic Acids by algae，Plant Physiol，98：569-572)。
本发明的目的是提供了一种螺旋藻品系选育方法，从而提高了筛选的机率，缩短了筛选时间，解决了品系选育中筛选机率较小和稳定性的问题。
为实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：用80-120μg/ml亚硝基胍(NTG)对螺旋藻出发品系在36-38℃水浴中，黑暗条件下处理30-60分钟，处理后的悬浮液在1800-2200Lux，25-29℃连续光照下静置7-10天，加入0.3-0.5mM哒嗪酮类除草剂(SANDOZ9785)进行筛选，筛选出的抗SANDOZ9785突变株在基本培养平板上划线纯化；用毛细管分离，挑起小段单丝体置于基本培养基中培养7-10天，最后扩大培养得到γ-亚麻酸含量较高的螺旋藻品系。
本发明的优点是：先用NTG诱变，再用SAN9785筛选，方法易行，提高了筛选机率，缩短了时间，所得品系稳定可靠，SP-HG8的γ-亚麻酸含量高，比出发品系高出119.72％，比Cohen所得的SRS-1H品系高出9.86％，SP-HG8的总脂肪酸、蛋白质和氨基酸含量高，其中氨基酸组成也十分合理，SP-HG8的藻丝体长，上浮率和过滤效果均较好，生长速率快，生长代时短，成本低，适用于工厂化生产。
实施例：
采用螺旋藻SP(NS)-90020出发品系(γ-亚麻酸含量为0.72％占干重)进行无菌培养，取对数期的藻液离心收集，用磷酸缓冲液(PH=7.0，1/15M)洗涤，然后悬于磷酸缓冲液中，NTG过滤灭菌后以80-120μg/ml的浓度加入藻液中，黑暗中36-38℃水浴放置30-60分钟，诱变后藻液离心，并用无菌的磷酸缓冲液(PH=7.0)洗涤；再将诱变洗涤后的悬浮液在1800-2200Lux，25-29℃连续光照下静置培养7-10天，使细胞内突变基因分离、表达，然后分别配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mM SAN9785的实验培养基，加入一定体积的出发品系藻液和诱变表达后藻液培养，选出对照生长不好而抗性突变株生长好的适当浓度作为初筛浓度，取能在筛选浓度中生长的抗性突变株，再次在含筛选浓度的SAN9785的基本培养基中培养一段时间，再用毛细管分离法挑选在筛选浓度SAN9785的实验培养基中生长良好的单根丝体放入试管中静止培养，20-30天藻落长出后，再用毛细管分离法进行反复分离，直至丝体纯化为止，最后放在筛选浓度SAN9785的实验培养基中培养，测定生长曲线，生长速率高的为所需抗SAN9785的突变品系，复筛后所得的品系在基本培养平板上划线，挑起小段单丝体置于基本培养基中培养7-10天，测定生长曲线，生长速率高的为所需抗SAN9785的突变品系，对所得突变品系进行扩大培养，测定其脂肪酸含量，其中γ-亚麻酸含量高的品系为所需要的突变品系SP-HG8，此品系的各项特征列表如下：
表1
表2
从表1、表2中可看出，突变品系SP-HG8的γ-亚麻酸含量是出发品系SP(NS)-90020的2.2倍，而且SP-HG8品系的总脂肪酸，蛋白质和氨基酸含量与出发品系相比分别升高了109.28％、9.26％和3.05％，SP-HG8的氨基酸组成合理，其中苏氨酸和丙氨酸含量与出发品系相比分别升高了171.43％、162.12％，而且SP-HG8的藻丝体较长，上浮率和过滤效率均较好，生长速率也比出发品系快，生长代时较短。
Claims (2)
1、一种螺旋藻品系选育方法，其特征在于对螺旋藻出发品系用80-120μg/ml亚硝基胍在36-38℃水浴中，黑暗条件下处理30-60分钟，处理后的悬浮液在1800-2200Lux，25-29℃连续光照下静置培养7-10天，加入0.3-0.5mM哒嗪酮类除草剂进行筛选，筛选出的抗哒嗪酮类除草剂突变株在基本培养平板上划线纯化，扩大培养。
2、根据权利要求1所述的一种螺旋藻品系选育方法，其特征在于用毛细管分离，挑起小段单丝体置于基本培养基中培养7-10天。
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