CN106164267A - 通过与自分泌运动因子结合而抑制自分泌运动因子的生物学活性的适体及其应用 - Google Patents

通过与自分泌运动因子结合而抑制自分泌运动因子的生物学活性的适体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供包含下式(I)所示的核苷酸序列并且结合自分泌运动因子的适体：CGGAACC‑N1‑GGTC(I)(在该式中，N1是任意的3‑11个核苷酸)以及使用所述适体的方法。

Description

通过与自分泌运动因子结合而抑制自分泌运动因子的生物学 活性的适体及其应用
[技术领域]
本发明涉及针对自分泌运动因子(autotaxin)的适体、其使用方法等。
[背景技术]
自分泌运动因子是一种鉴定为促进黑素瘤细胞运动的分子的分泌性蛋白。其属于Enpp(胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶)家族蛋白，并且还称作Enpp2。其具有磷酸二酯酶活性，并且参与细胞外核苷酸代谢。其还具有溶血磷脂酶D活性(LysoPLD活性)，并且也是将溶血磷脂酰胆碱(LPC)降解为溶血磷脂酸(LPA)和胆碱的酶。所产生的LPA表现出脂质介质的多种生理学活性，诸如细胞运动激活、细胞增殖、血管发生等。据说LPA参与癌细胞的生长、转移等，并且已经进行了很多LPA的研究。此外，存在很多关于自分泌运动因子在癌症患者的血液和腹水中增加的表达和活性的报道，自分泌运动因子是产生LPA的酶。
近来，已经报道了LPA受体LPA1敲除小鼠和LPA1抑制剂在博来霉素诱导的肺纤维化模型中的纤维化抑制作用，由此表明LPA与肺纤维化之间的关联，并且，关于与肺纤维化的关联，自分泌运动因子作为产生LPA的酶引起关注。
其中报道了抗-自分泌运动因子单克隆抗体具有对间质性肺炎(interstitialpneumonia)和/或肺纤维化具有预防和/或治疗效果。另外，已经报道了自分泌运动因子的小分子抑制剂在博来霉素诱导的肺纤维化模型中的纤维化抑制作用。所有这些报道表明自分泌运动因子存在于特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis)患者的肺泡灌洗液中，并且与健康个体相比，其浓度和活性高。
特发性肺纤维化是一种表现出极差的预后的疾病(得到30％的五年存活率证实)。尽管其机制包含许多不清楚的方面，但是，通常理解肺泡等的损伤引起组织修复机制的过度作用，并且在肺间质中发生成纤维细胞的异常生长和结缔组织蛋白的过量产生。目前，类固醇、免疫抑制剂等用于全球标准治疗。在2008年，世界上首次在日本核准Pirespa(通用名称：吡非尼酮(pirfenidone))作为特发性肺纤维化的治疗药物，并且在临床情况下研究其有效性等。然而，其作用机制包含许多不清楚的方面，诸如Pirespa的靶标是什么等。
适体意指特异性结合目标分子(蛋白、糖链、激素等)的核酸。其由于单链RNA(或DNA)的三维结构而结合目标分子。为了获得所述适体，使用称为SELEX方法(通过指数富集的配体系统进化)的筛选方法。通过SELEX方法得到的适体具有约80个核苷酸的链长度，之后以目标分子的生理学抑制活性为指标，将其缩短。其进一步被化学修饰，以改善体内稳定性，由此优化其作为药物产品。
适体表现出对目标分子的高结合特性，并且其亲和力通常比具有相似功能的抗体高。适体不可能进行免疫消除，并且使用适体不容易发生抗体特有的副作用，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。从递送方面看，由于适体的分子大小约为抗体的1/10，因此，容易发生组织转移，并且将药物递送至目标位点更容易。一些低分子量的分子靶向药物溶解性差，并且需要优化其配制。由于适体具有高水溶性，因此，它们在该方面是有利的。此外，由于适体是通过化学合成产生的，因此，可以通过大规模生产进行成本削减。除了这些之外，长期的保存稳定性和热·溶剂耐受性也是适体的优越特征。另一方面，适体的血液半衰期通常比抗体的血液半衰期短；然而，从毒性观点看来，该特性有时是有利的。
在2004年12月，世界上的首个RNA适体药物，即Macugen，在美国核准作为年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration)的治疗药物，并且将RNA适体用于治疗药、诊断剂或试剂日益引起关注，并且预测该药物是下一代药物产品。
作为适体，已经广泛研究了RNA适体。然而，由于RNA在体内不稳定并且生产成本高，因此，也正在进行DNA适体的研究和研发，其在体内稳定并且可以以低成本生产(非专利文献1-2)。
[文献列表]
[非专利文献]
非专利文献1:Fitzwater和Polisky，Methods Enzymol.，267，275-301(1996)
非专利文献2:Stephen Fitter和Robert James，J.Biol.Chem.，280(40)，34193-34201(2005)
[发明概述]
[发明解决的问题]
本发明涉及提供针对自分泌运动因子的适体和使用该适体的方法等。
[解决问题的方法]
本发明人不懈地研究从而解决了上述问题并且成功地制备了针对自分泌运动因子的优质适体，其导致本发明的完成。
因此，本发明提供以下发明等。
[1]结合自分泌运动因子的适体，其包含由下式(I)所示的核苷酸序列：
CGGAACC-N1-GGTC(I)
其中N1表示任意的3-11个核苷酸。
[2]结合自分泌运动因子的适体，其包含由下式(II)所示的核苷酸序列：
X3X1CGGAACC-N1-GGTCX2X4(II)
其中N1表示任意的7-11个核苷酸，X1、X2、X3和X4分别是任意的核苷酸，并且X1与X2和X3与X4中的至少一对形成沃森-克里克碱基对。
[3][2]的适体，其中X1是A，X2是T，X3是G，并且X4是C。
[4]结合自分泌运动因子的适体，其包含下述(a)、(b)或(c)所示的核苷酸序列：
(a)选自SEQ ID NOs:4–14、16、20–25、27和29的核苷酸序列；
(b)选自SEQ ID NOs:4–14、16、20–25、27和29的核苷酸序列，其中，在CGGAACC-N1-GGTC(其中N1表示任意的3-11个核苷酸)中除CGGAACC和GGTC所示的序列之外的一个或多个核苷酸被取代、缺失、插入或添加；或
(c)与选自SEQ ID NOs:4–14、16、20–25、27和29的核苷酸序列具有不少于70％的同一性的核苷酸序列(排除CGGAACC-N1-GGTC(其中N1如上文定义)中由CGGAACC和GGTC所示的序列)。
[5][1]-[4]中任一项的适体，其中N1是AGAATACTTTT所示的核苷酸。
[6]结合自分泌运动因子的适体，其具有下式(IV)所示的潜在的二级结构：
其中X1，X2，X3和X4分别是任意的核苷酸，并且X1与X2和X3与X4中的至少一对形成沃森-克里克碱基对。
[7][6]的适体，其中X1是A，X2是T，X3是G，并且X4是C。
[8][1]-[7]中任一项的适体，其具有不少于30的碱基长度。
[9][1]-[8]中任一项的适体，其中各个核苷酸的脱氧核糖的2’-位的氢原子是相同的或不同的，并且是未取代的或被选自由氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。
[10][1]-[9]中任一项的适体，其中包含在所述适体中的磷酸基团是相同的或不同的，并且分别是未取代的或是P-烷基化的或P-烷氧基化的。
[11]结合自分泌运动因子的适体，其包含下式(I)所示的核苷酸序列：
CGGAACC-N1-GGTC(I)
其中N1表示任意的3-11个核苷酸，并且
向所述核苷酸序列的C和C之间的磷酸基团中引入疏水基团。
[12][11]的适体，其中上述疏水基团是烷基或烷氧基。
[13][1]-[12]中任一项的适体，其中至少一个核苷酸被修饰。
[14][13]的适体，其被反向dT或聚乙二醇修饰。
[15][14]的适体，其中所述反向dT或聚乙二醇结合所述适体的5’-端或3’-端。
[16][1]-[15]中任一项的适体，其中包含在所述适体中的至少一个磷酸基团被硫代磷酸化或二硫代磷酸化。
[17]包含[1]-[16]中任一项的适体和功能性物质的复合物。
[18][17]的复合物，其中述功能性物质是亲和性物质、标记物质、酶、药物、毒素或药物递送载体。
[19]包含[1]-[16]中任一项的适体或[17]或[18]的复合物的药物。
[20]包含[1]-[16]中任一项的适体或[17]或[18]的复合物的抗纤维化剂。
[21]自分泌运动因子检测探针，其包含[1]-[16]中任一项的适体或[17]或[18]的复合物。
[22]自分泌运动因子的检测方法，其包括使用[1]-[16]中任一项的适体或[17]或[18]的复合物。
[发明效果]
本发明的适体和复合物可以用作，例如，由自分泌运动因子引起的多种疾病的药物或诊断剂或试剂，所述疾病诸如纤维化、癌症等。本发明的适体和复合物还可以用于自分泌运动因子的纯化和浓缩以及自分泌运动因子的检测和定量。
[附图简述]
图1显示(A)具有SEQ ID NOs:4和5所示的核苷酸序列的适体的二级结构，和(B)由上式(II)所示的共有子序列的共同二级结构，所述结构由MFOLD程序预测。在图1A中，上述共有子序列的核苷酸以带圆圈的字母表示。
图2显示通过MFOLD程序预测的具有SEQ ID NOs:11和12所示的核苷酸序列的适体的二级结构，其通过链缩短和具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的适体的碱基取代得到。上述式(II)所示的共有序列的核苷酸用带圆圈的字母表示。
图3显示具有SEQ ID NO:12(48)所示的核苷酸序列的适体与自分泌运动因子的结合。作为捕获分子，固定自分泌运动因子或作为阴性对照的FGF2，并且流过适体作为分析物。使用GE Healthcare制造的Biacore T100进行测量。
图4显示在博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠中自分泌运动因子适体对肺中胶原蛋白积聚的作用。左肺分离自每天施用两个剂量的自分泌运动因子适体(SEQ ID NO:12(48))的组，和赋形剂施用组，在施用结束后，测量并比较羟脯氨酸的量/肺重量。对照组是未处理的(未施用博来霉素的)小鼠。
[实施方案描述]
本发明提供具有针对自分泌运动因子的结合活性的适体。本发明的适体可以抑制自分泌运动因子的活性(磷酸二酯酶活性，溶血磷脂酶D活性等)。
适体是指对特定的目标分子具有结合活性的核酸分子。所述适体能够通过结合特定的目标分子来抑制所述特定的目标分子的活性。本发明的适体具有针对自分泌运动因子的结合活性，并且可以抑制自分泌运动因子的活性。本发明适体可以是DNA、RNA、修饰的核酸或其混合物。本发明的适体还可以是直线型的或环型的。
自分泌运动因子(EC.3.1.4.39)是一种存在于血液中的糖蛋白，并且是将溶血磷脂酰胆碱(LPC)降解成溶血磷酸(LPA)和胆碱的酶。本发明的适体可以表现出针对来源于任意哺乳动物的自分泌运动因子的抑制活性。所述哺乳动物包括灵长类(例如人、猴)、啮齿类(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)和陪伴动物、家养动物和工作动物(例如狗、猫、马、牛、山羊、绵羊、猪)，优选人。
关于人自分泌运动因子，已经报道了4种同工型：α，β，γ，δ。在本发明中，人自分泌运动因子特别意指β型。人β-自分泌运动因子的氨基酸序列标示为登记号NP_001035181，并且人自分泌运动因子还包括具有基本上等价的LPA合成活性的部分蛋白和其中一部分氨基酸被取代、缺失、添加或插入的突变蛋白。
本发明的适体结合生理缓冲液中的自分泌运动因子。尽管缓冲液没有特别限制，但是，优选使用具有约5.0-10.0的pH的缓冲液。所述缓冲液的实例包括下文提及的溶液A(见实施例1)。本发明的适体以通过下文所示的任意测试可检测水平的强度结合自分泌运动因子。
使用GE Healthcare制造的Biacore T100测量结合强度。在一种测量方法中，首先将适体固定在传感芯片上。固定的量设定为约1500RU。以20μL注入制备为0.020μM的作为分析物的自分泌运动因子溶液，并且检测自分泌运动因子与适体的结合。使用包含由40个核苷酸组成的随机核苷酸序列的DNA作为阴性对照，当自分泌运动因子较对照DNA显著强地与适体结合时，可以判断所述适体具有针对自分泌运动因子的结合能力。
在另一种测量方法中，首先将自分泌运动因子固定在传感器芯片上。固定的量设定为约2700RU。以20μL注入制备为0.30μM的作为分析物的适体溶液，并且检测适体与自分泌运动因子的结合。使用包含由40个核苷酸组成的随机核苷酸序列的DNA作为阴性对照，当适体较对照DNA显著强地与自分泌运动因子结合时，可以判断所述适体具有针对自分泌运动因子的结合能力。
针对自分泌运动因子的抑制活性意指针对所述自分泌运动因子所具有的任意活性的抑制能力。尽管自分泌运动因子具有磷酸二酯酶活性通过水解切割磷酸二酯键，但是此种活性被抑制。酶活性的可接受的底物不限于体内存在的包含磷酸二酯键的底物(例如，ATP等)，并且包括这样的底物，其中包含磷酸二酯键的化合物被添加显色物质或荧光物质。显色物质和荧光物质是本领域普通技术人员已知的。此外，自分泌运动因子具有溶血磷脂酶D活性。通过这一活性，主要通过切割在溶血磷脂的磷酸二酯的甘油骨架相对侧的键产生溶血磷酸(LPA)。自分泌运动因子活性的抑制还包括抑制所述产生。
自分泌运动因子的底物是指具有通过自分泌运动因子水解被切割的磷酸二酯键的物质。作为体内存在的自分泌运动因子的底物，已知有溶血磷脂酰胆碱(LPC)和鞘氨醇基磷酸胆碱(SPC)。在本说明书中，自分泌运动因子的底物还包括具有不同碳链长度和不饱和度的LPC和SPC，以及添加了显色物质或荧光物质的那些。
例如，可以通过下述测试评价适体是否抑制自分泌运动因子的酶活性。作为自分泌运动因子的底物，使用包含磷酸二酯键的合成的底物，即，对-硝基苯基胸苷5’-单磷酸酯(pNP-TMP)(SIGMA)。通过水解切割磷酸二酯键，并且释放对-硝基苯酚。对-硝基苯酚显出黄色，并且检测该颜色。对于测定，使用96孔平板(96孔EIAsurasshuRIA聚苯乙烯平板，Costar)，并且反应混合物的量为200μL。在溶液A(见下文的实施例1)(100μL)中制备核酸，加入在反应混合物A中调整为10mM的pNP-TMP(20μL)，并且将混合物充分涡旋并在37℃加热5分钟。在另一方面，制备用溶液A稀释的6ng自分泌运动因子(重组人的，由R&D供应)(80μL)，并且在37℃加热5分钟。加热后，将它们混合，以开始酶反应。反应溶液中最终的自分泌运动因子浓度为0.3nM，并且最终底物浓度是1mM。将包含反应混合物的平板在37℃加热24小时，放置在微量平板读数仪SpectraMax190(由Molecular Devices制造)中，并且在405nm波长确定吸光度。在没有添加核酸时的吸光度为100％(A0)，按照下式，由每种测试物质的吸光度(A)确定酶活性比率。
酶活性比率＝(A/A0)x100
确定抑制50％的酶活性所需要的抑制剂的浓度(IC50)。判断具有不超过0.10μM的IC50值适体是具有优良的抑制活性的适体。
本发明的适体没有特别限制，只要它结合自分泌运动因子的任意部分即可。适体没有特别限制，只要其能够抑制自分泌运动因子的活性即可。
本发明适体的长度是没有特别限制的，并且通常可以是大约10至大约200个核苷酸，并且可以是，例如，不超过约100个核苷酸，优选不超过约75个核苷酸。本发明的适体甚至在具有30个核苷酸时保持其活性。当核苷酸的总数较小时，化学合成和大量制备将更容易，并且在成本方面具有重大优势。同样据认为化学修饰是容易的，在体内的稳定性高，并且毒性低。因此，本发明的适体的长度优选不少于30个核苷酸，更优选不少于30个核苷酸并且不超过75个核苷酸。
本发明的适体中包含的每个核苷酸是相同的或不同的，并且可以是：在脱氧核糖(例如，嘧啶核苷酸的脱氧核糖，嘌呤核苷酸的脱氧核糖)的2’-位包含氢原子的核苷酸(即，取代的核苷酸)，或其中在脱氧核糖2’-位的氢原子被任意原子或基团取代(修饰)的核苷酸。所述可选的原子或基团的实例包括被氟原子、羟基或烷氧基(例如，甲氧基)、酰氧基(例如，乙酰氧基)、氨基(例如，-NH2基团)取代的核苷酸，优选被氟原子或甲氧基取代的核苷酸。
本发明的适体的优选的实例是与自体毒素(autotoxin)结合的适体，其包含下式(I)所示的核苷酸序列
CGGAACC-N1-GGTC(I)
其中N1表示任意的3-11个核苷酸。N1的核苷酸数目优选是5–11个，更优选是7–11个。
备选地，其是与自体毒素结合的适体，其包含下式(II)所示的核苷酸序列：
X3X1CGGAACC-N1-GGTCX2X4(II)
其中N1表示任意的7-11个核苷酸，X1、X2、X3和X4分别是任意的核苷酸，并且X1与X2和X3与X4中的至少一对形成沃森-克里克碱基对。
在一个优选的实施方案中，至少X1与X2形成沃森-克里克碱基对，更优选地，X1与X2和X3与X4都形成沃森-克里克碱基对。当X1与X2形成沃森-克里克碱基对时，(X1-X2)优选为(A-T)，(C-G)或(T-A)。当X3与X4形成沃森-克里克碱基对时，(X3-X4)优选为(G-C)或(C-G)。当X1与X2和X3与X4都形成沃森-克里克碱基对时，(X1-X2，X3-X4)优选为(A-T，G-C)，(C-G，G-C)或(T-A，C-G)，更优选为(A-T，G-C)。
备选地，本发明的适体可以是结合自体毒素的适体，其包含下述(a)、(b)或(c)所示的核苷酸序列：
(a)选自SEQ ID NOs:4–14、16、20–25、27和29的核苷酸序列；
(b)选自SEQ ID NOs:4–14、16、20–25、27和29的核苷酸序列，其中，在CGGAACC-N1-GGTC(其中N1表示任意的3-11个核苷酸)中除CGGAACC和GGTC所示的序列之外的一个或多个核苷酸被取代、缺失、插入或添加；或
(c)与选自SEQ ID NOs:4–14、16、20–25、27和29的核苷酸序列具有不少于70％的同一性的核苷酸序列(条件是CGGAACC-N1-GGTC(其中N1如上文定义)中由CGGAACC和GGTC所示的序列是相同的)。
上述(b)或(c)的适体与自分泌运动因子结合。所述适体可以抑制自分泌运动因子的活性(自分泌运动因子的酶活性等)。
在上述(b)中，被取代、缺失、插入或添加的核苷酸数目没有特别限制，只要所述适体能够结合自分泌运动因子和/或抑制自分泌运动因子活性(自分泌运动因子的酶活性等)即可。例如，其可以不超过约30个，优选不超过约20个，更优选不超过约10个，更优选不超过5个，最优选4，3，2或1个。此处的取代还包括从T(胸腺嘧啶)到U(尿嘧啶)的碱基取代(作为核苷酸，从胸苷到脱氧尿苷的取代)。
在上述(c)中，“同一性”意指，当使用本领域已知的数学算法比对两条核苷酸序列时，在最佳比对中相同的核苷酸残基与全部重叠的核苷酸残基的比例(％)(优选地，所述算法可以考虑向一条或两条序列中引入缺口，以进行最佳比对)。
在本说明书中，例如，可以使用同一性计算算法NCBI BLAST-2(国家生物技术信息中心，基本本地比对搜索工具)通过在下述条件下比对两条核苷酸序列而计算核苷酸序列的同一性(缺口开放＝5个罚分；缺口延伸＝2个罚分；x_减少＝50；期待值＝10；过滤＝打开)。
本发明的适体还可以是：
(d)多个一个或多个上述(a)和/或一个或多个上述(b)和/或一个或多个上述(c)的缀合物。此处，缀合可以通过串联结合获得。在所述缀合中,可以使用接头。作为接头,可以提到核苷酸链(例如，1至约20个核苷酸)和非核苷酸链(例如，-(CH2)n-接头，-(CH2CH2O)n-接头，六甘醇(hexaethylene glycol)接头，TEG接头，含肽接头，含-S-S-键接头，含-CONH-键接头，含-OPO3-键接头)。不特别限制如在以上描述的其多个缀合物中提到的诸多缀合物，只要其是两个或更多，且多个可以是，例如，2、3或4个。
上述(a)-(d)中的核苷酸可以是相同或不同的，且每个可以是：其中在脱氧核糖的2’位是氢原子的脱氧核糖核苷酸，或在脱氧核糖的2’位的氢原子被任何原子或基团(例如，氟原子、羟基或甲氧基)取代的核苷酸。
在一个优选的实施方案中，在上述式(I)或(II)中的N1由下式(III)表示：
X5X7X9-N2-X10X8X6(III)
其中N2是任意的1–5个核苷酸，X5-X10分别是任意的核苷酸，X5与X6、X7与X8和X9与X10中的至少一对形成沃森-克里克碱基对，并且X5与X6形成沃森-克里克碱基对或G:T碱基对。优选地，当X5与X6形成沃森-克里克碱基对时，(X5-X6)是(A-T)，当形成G:T碱基对时，(X5-X6)是(G:T)。当X5与X6形成G:T碱基对时，X7与X8优选形成沃森-克里克碱基对。另一方面，当X5与X6形成沃森-克里克碱基对时，X7与X8和X9与X10中的至少一对优选形成沃森-克里克碱基对。当X7与X8形成G:T碱基对时，X9与X10优选形成沃森-克里克碱基对。
N2的核苷酸数目优选是3-5个。
在一个特别优选的实施方案中，式(I)或(II)中的N1是AGAATACTTTT(SEQ ID NO:30)。
上述式(II)所示的序列：
X3X1CGGAACC-N1-GGTCX2X4(II)
其中N1、X1、X2、X3和X4如上文定义，该序列可以形成式(IV)所示的潜在的二级结构：
由于本发明的适体在上述式(II)所示的子序列中具有上述结构，因此，认为本发明的适体表现出多种活性。
另外，茎结构可以优选地通过上述结构中5’-端和3’-端之后的序列之间的相互作用而形成。特别地，X1与X2和X3与X4中的至少一对形成沃森-克里克碱基对。
对于表现出多种活性的本发明的适体，需要保持上述潜在的二级结构所示的茎-环结构。尽管茎结构可以由互补碱基对形成，但是对碱基对的数目没有特别限制。在茎结构中，甚至当在其部分中没有形成碱基对时，只要整体上组成茎结构，便保持所述适体活性。
式(IV)的右上茎-环部分SL1对应于式(II)的N1部分。当N1是上述式(III)所示的序列时，认为式(IV)所示的茎-环结构更稳定地保持。即，式(III)中的X5-X10形成式(IV)的SL1部分的茎结构。
在本发明的适体中，至少一种(例如，1，2，3或4种)核苷酸也可以是在脱氧核糖的2’-位包含氢原子或上述任意原子或基团(例如，选自由氟原子、羟基和甲氧基组成的组的至少两种(例如，2，3或4种)原子或基团)的核苷酸。
本发明的适体也可以是这样的核苷酸，其中所有核苷酸在脱氧核糖的2’-位具有氢原子或前述任意的原子或基团，例如，选自由氟原子、羟基和甲氧基组成的组的相同的基团。
在本说明书中，在描述核苷酸中的糖基团是如何被修饰的方面，假定构成适体的核苷酸是DNAs(即，糖基团假定为脱氧核糖)。然而,这不意味着从构成适体的核苷酸中排除RNA，且修饰应该酌情理解为RNA的修饰。当构成适体的核苷酸是RNA时,例如,由X在脱氧核糖的2’-位取代氢原子应理解为在核糖的2’-位X取代羟基。
本发明的适体可以是其中每个核苷酸的糖残基(例如，脱氧核糖)已经被修饰以增加自分泌运动因子结合活性、稳定性、药物递送性等的适体。作为糖残基中的修饰的实例，可以提及糖残基的2’-位的氢原子或3’-位和/或4’-位的羟基被另一个原子取代等。关于修饰作用的种类，可以提及氟化作用、烷氧基化(例如，甲氧基化，乙氧基化)，O-芳基化，S-烷基化(例如，S-甲基化，S-乙基化)，S-芳基化和胺化(例如，-NH2)。在糖残基中的这种改变可以通过本身已知的方法进行(参见，例如，Sproat等，(1991)Nucl.Acid.Res.19，733-738；Cotton等，(1991)Nucl.Acid.Res.19，2629-2635；Hobbs等，(1973)Biochemistry 12，5138-5145)。
糖残基也可以是BNA:桥接核酸(LNA:锁定核酸)，其中在2’-位和4’-位形成交联结构。糖残基的此类改变也可以通过本身已知的方法进行(例如，Tetrahedron Lett.，38，8735-8738(1997)；Tetrahedron，59，5123-5128(2003)，Rahman S.M.A.，Seki S.，ObikaS.，Yoshikawa H.，Miyashita K.，Imanishi T.，J.Am.Chem.Soc.，130，4886-4896(2008)等)。
本发明的适体还可以具有改变(例如，化学取代)的核酸碱基(例如，嘌呤或嘧啶)，以增加自分泌运动因子结合活性等。作为这样的改变的实例，可以提及5-位处的嘧啶改变、6-和/或8-位处的嘌呤改变、用环外胺(extracyclic amine)改变、用4-硫尿苷取代和用5-溴或5-碘-尿嘧啶取代。
另外，可以改变包含在本发明的适体中的磷酸基团，从而赋予针对核酸酶和水解的耐受性、增加自分泌运动因子结合活性等。例如，作为磷酸基团P(O)O基团可以用下述各项取代：P(O)S(硫代(thioate))，P(S)S(二硫代(dithioate))，P(O)NR2(酰胺化(amidate))，P(O)R，P(O)OR’，CO或CH2(formacetal)，或3’-胺(-NH-CH2-CH2-)[其中R或R’的每个单元独立地是H，或是取代的或未取代的烷基(例如，甲基，乙基)]。
这些中，优选这样的改变：其中要成为磷酸基团的至少一个P(O)O基团被P(O)S(硫代)、P(S)S(二硫代)或P(O)R、P(O)OR’(R和R’是未取代的烷基)取代，即，硫代磷酸酯化、二硫代磷酸酯化、P-烷基化或P-烷氧基化。当所述适体中包含的至少一个磷酸基团被硫代磷酸酯化、二硫代磷酸酯化、P-烷基化或P-烷氧基化时，本发明的适体的活性得到改善。
此处，特别地，优选地将P-甲基化的或P-烷氧基化的磷酸基团引入到共有序列部分。向共有序列中引入具有高疏水性的此类官能团(以下表示为“疏水基团”)通过与自分泌运动因子的直接作用有效地改善本发明的适体的抑制活性。尽管疏水基团没有特别限制，只要改善本发明的适体针对自分泌运动因子的抑制活性即可，但是优选烷基或烷氧基。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基等，并且烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丁氧基、丙氧基等。
特别地，在本发明中，下式(I)所示的核苷酸序列：
CGGAACC-N1-GGTC(I)
其中N1表示任意的3-11个核苷酸，或下式(II)所示的核苷酸序列：
X3X1CGGAACC-N1-GGTCX2X4(II)
其中N1表示任意的7-11个核苷酸，X1，X2，X3和X4分别是任意的核苷酸，并且X1与X2和X3与X4中的至少一对形成沃森-克里克碱基对，或优选使用这样的核苷酸序列：其中在式(IV)所示的潜在的二级结构中的C与C之间的磷酸基团中引入疏水基团：
并且，包含所述序列的适体优选作为本发明的适体。将所述核酸基团引入到共有序列中通过与自分泌运动因子直接作用有效地改善本发明的适体的抑制活性。尽管磷酸基团没有特别限制，只要改善本发明的适体针对自分泌运动因子的抑制活性即可，但是，优选烷基或烷氧基。具体的基团如上文作为实例所示。
连接基团是，例如，-O-，-N-或-S-，并且核苷酸可以通过这些连接基团与相邻的核苷酸结合。
所述改变还可以包括如在3’和5’加帽的改变。
改变还可以通过在末端添加下列各项而进行：聚乙二醇、氨基酸、肽、反向dT、核酸、核苷、肉豆蔻酰基、石胆酸(Lithocolic)-油基、二十二烷基、月桂酰、硬脂酰、棕榈酰、油酰、亚油酰(linoleoyl)、其它脂质、类固醇、胆固醇、咖啡因、维生素、染料、荧光性物质、抗癌药、毒素、酶、放射性物质、生物素等。对于这样的改变，参见，例如，美国专利5,660,985和5,756,703。
可以通过本文公开和本领域本身已知的方法化学合成本发明的适体。例如，其可以使用DNA聚合酶合成。化学合成具有目标序列的DNA，并且使用其作为模板，通过已知的聚合酶链式反应(PCR)方法进行扩增。通过已知的聚丙烯酰胺电泳方法、酶处理方法(如λ外切核酸酶等)、使用链霉抗生物素-生物素相互作用的方法和碱处理等，将其转化为单链。当合成修饰的适体时，可以通过使用聚合酶在特定的位点引入突变而提高延伸反应的效率。这样得到的受体可以通过已知的方法容易地纯化。
通过化学合成方法，诸如酰胺法、亚磷酰胺法等，可以大量合成适体。合成方法是公知的方法，并且如在Nucleic Acid(第2卷)[1]核酸合成和分析(Synthesis andAnalysis of Nucleic Acid)(编者:Yukio Sugiura，Hirokawa Publishing Company)等中所述。事实上，使用诸如由GE Healthcare Bioscience制造的OligoPilot100、OligoProcess等合成仪。纯化通过本身已知的方法进行，诸如层析等。
在通过亚磷酰胺方法等化学合成的过程中，通过引入活性基团，如氨基等，可以在合成后向适体中加入功能性物质。例如，可以通过向适体末端引入氨基，而缩合引入了羧基的聚乙二醇链。
适体以宽泛种类的结合方式与目标物质结合，诸如基于磷酸基团负电荷的离子键、基于核糖的疏水键和氢键、基于核酸碱基的氢键和堆积相互作用(stackinginteraction)。特别地，基于磷酸基团负电荷的离子键很强，并且与在蛋白正电荷表面上存在的赖氨酸和精氨酸结合，所述磷酸基团以与组成核苷酸的数目相同的数目存在。由于这种原因，不参与与目标物质直接结合的核酸碱基可以被取代。特别地，因为茎(stem)结构区已经形成碱基对，并且朝向双螺旋结构的内侧，所以核酸碱基不太可能直接与目标物质结合。因此，即使当用另一碱基对取代碱基对时，适体的活性通常不降低。在其中不形成碱基对的结构中，诸如环结构中，如果所述核酸碱基不参与与目标分子直接结合，则碱基取代是可能的。关于脱氧核糖2’-位的修饰，在脱氧核糖2’-位的官能团偶尔与目标分子直接相互作用，但是在许多情形中，它是不相关的，并且可以被另一种修饰的分子取代。因此，除非参与与目标分子直接结合的官能团被取代或缺失，适体通常保留其活性。整体三维结构基本上没有改变也是重要的。
适体可以通过使用DNA-SELEX方法和其改进的方法制备(例如，Stephen Fitter和Robert James，J.Biol.Chem.，280(40)，34193-34201(2005)等)。在SELEX方法中，通过增加轮数或使用竞争物质而设置严格的选择条件，浓缩并且选择表现出针对目标分子更强的结合潜力的适体。因此，通过调整SELEX的轮数和/或改变竞争性条件，在一些情形中可以获得具有不同结合力的适体、具有不同结合模式的适体和具有相同结合力或结合模式但具有不同碱基序列的适体。SELEX方法包括通过PCR扩增的过程；通过在该过程中使用锰离子等引起突变，以更高多样性进行SELEX是可能的。
通过SELEX获得的适体是表现出针对目标物质的高亲和性的核酸，但这并不意味着抑制所述目标物质的生理学活性。自分泌运动因子是碱性蛋白，并且被认为可能允许核酸与其非特异性地结合。不结合特定位点的适体不会影响目标物质的活性。事实上，用作阴性对照的包含随机序列的RNA不与自分泌运动因子结合或不抑制自分泌运动因子。
基于这样选择的活性适体，可以使用不同的引物进行SELEX，以尝试获得具有更高活性的适体。作为具体的方法，在制备其中具有确定序列的适体被部分随机化的模板或掺杂有10至30％的随机序列的模板后，再次进行SELEX。
通过SELEX获得的适体具有大约80个核苷酸的长度，并且这难以如其本身制备为药物。因此，需要重复试错法(try-and-error)尝试以使所述适体缩短到允许容易的化学合成的长度(其为50个核苷酸或更短)。取决于针对通过SELEX获得的适体的引物设计，随后的最小限度操作的容易性改变。除非成功设计引物，否则即使是通过SELEX选择了具有活性的适体，随后的研发也将是不可能的。在本发明中，甚至以约30个核苷酸也可能得到保持抑制活性的适体。
适体容易被改变，原因在于它们允许化学合成。对于适体，通过使用MFOLD程序预测二级结构，或通过X-射线分析或NMR分析预测空间结构，可能在某种程度上预测哪个核苷酸可以被取代或缺失，在何处插入新的核苷酸等。预测的具有新序列的适体可以容易地进行化学合成，并且使用现有的测定系统可以确定所述适体是否保留活性。
当通过上述重复进行的试错鉴定了对所获得的适体与目标物质结合重要的区域时，在许多情形中，甚至在向所述序列的两端添加新序列时，活性将保持不变。对新序列的这样的长度没有特别限制。
本领域的普通技术人员可以自由地进行修饰，如序列一样，其允许宽范围的设计或变化。
如上文阐述，适体允许宽范围的设计或变化。本发明还提供适体的制备方法，其允许对包括指定序列(例如，与选自茎区、内环区、凸起区、发夹环区和单链区的部分相对应的序列；以下，在需要时简称为固定序列)的适体进行宽范围的设计或变化。
例如，所述适体的制备方法包括通过使用单种类型的核酸分子或多种类型的核酸分子(例如，具有不同数目a、b等的核酸分子文库)和分别对应于引物(i)和(ii)的序列的引物对制备包含固定序列的适体，所述单种类型的核酸分子由下述所示的核苷酸序列组成：
–(N)a–固定序列–(N)b–
[其中(N)a表示由“a”单位个N组成的核苷酸链；(N)b表示由“b”单位个N组成的核苷酸链；每单位的N，不管是相同的还是不同的，是选自由A，G，C，U和T(优选地，A，G，C和T)组成的组的核苷酸。“a”和“b”的每个，不管是相同的还是不同的，可以是任意的数目，并且可以是，例如，1-约100，优选为1-约50，更优选为1-约30，还更优选为1-约20或1-约10]。
本发明还提供包括本发明的适体和与其结合的功能物质的复合物。本发明的复合物中适体和功能物质之间的结合可以是共价键或非共价键。本发明的复合物可以是这样一种复合物，即，其中本发明的适体和一种或多种(例如，2或3种)相同类型或不同类型的功能物质结合在一起。对所述功能物质没有特别限制，只要它新赋予本发明的适体某种功能，或能够改变(例如，提高)本发明的适体可以具有的某种特征。作为功能物质的实例，可以提及蛋白、肽、氨基酸、脂质、糖、单糖、多核苷酸和核苷酸。作为功能物质的实例，可以提及下列各项：亲和性物质(例如，生物素、链霉抗生物素、具有针对靶互补序列的亲和性的多核苷酸、抗体、谷胱甘肽琼脂糖、组氨酸)，标记物质(例如，荧光物质，发光物质，放射性同位素)，酶(例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶)，药物递送载体(例如，脂质体，微球体，肽，聚乙二醇)，药物(例如，在定向破坏治疗(missile therapy)中使用的那些，如刺孢霉素(calicheamycin)和多卡米星(duocarmycin)；氮芥类似物如环磷酰胺(cyclophosphamide)，美法仑(melphalan)，异环磷酰胺(ifosfamide)或曲磷胺(trofosfamide)；氮丙啶(ethylenimines)如塞替派(thiotepa)；亚硝基脲(nitrosoureas)如卡莫司汀(carmustine)；烷化剂如替莫唑胺(temozolomide)或达卡巴嗪(dacarbazine)；叶酸样代谢拮抗剂如甲氨蝶呤(methotrexate)或雷替曲塞(raltitrexed)；嘌呤类似物如硫鸟嘌呤(thioguanine)，克拉屈滨(cladribine)或氟达拉滨(fludarabine)；嘧啶类似物如氟尿嘧啶(fluorouracil)，替加氟(tegafur)或吉西他滨(gemcitabine)；长春花生物碱(vinca alkaloids)如长春碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)或长春瑞滨(vinorelbine)以及它们的类似物；鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物如依托泊苷(etoposide)，紫衫烷(taxans)，多西他赛(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel)；蒽环霉素(anthracyclines)如多柔比星(doxorubicin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(idarubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)以及它们的类似物；其它细胞毒性抗生素如博来霉素(bleomycin)和丝裂霉素(mitomycin)；铂化合物如顺铂(cisplatin)，卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)；喷司他丁(pentostatin)，米替福新(miltefosine)，雌莫司汀(estramustine)，托泊替康(topotecan)，伊立替康(irinotecan)和比卡鲁胺(bicalutamide))，和毒素(例如，蓖麻毒素(ricin toxin)，liatoxin和Vero毒素(vero toxin))。在一些情形中，最终去除这些功能分子。此外，所述分子可以是能够被酶，如凝血酶、基质金属蛋白酶(MMP)，和因子X识别和切割的肽，并且可以是可被核酸酶或限制性核酸内切酶切割的多核苷酸。
本发明的适体和复合物可以用作，例如，药物、诊断剂、检测试剂或试剂。
本发明的适体和复合物可以具有抑制自分泌运动因子功能的活性。如上文提及的，自分泌运动因子深入参与器官或组织的纤维化。因此，本发明的适体和复合物用作治疗或预防涉及器官或组织纤维化的疾病、特别是与多种组织纤维化相关的疾病的药物。
此处，涉及器官或组织纤维化的疾病的实例包括肺纤维化、前列腺增生(prostatic hyperplasia)、心肌层纤维化(fibrosis of myocardium)、心肌纤维化(myocardial fibrosis)、肌骨骼纤维化(musculoskeletal fibrosis)、骨髓纤维化(bone-marrow fibrosis)、子宫肌瘤(hysteromyoma)、硬皮病(scleroderma)、手术后粘连(post-surgical adhesion)、手术后瘢痕(post-surgical scar)、烧伤瘢痕(burn scar)、肥厚性瘢痕(hypertrophic scar)、瘢痕疙瘩(keloid)、特应性皮炎(atopic dermatitis)、腹膜硬化症(peritoneal sclerosis)、哮喘(asthma)、肝硬化(cirrhosis)、慢性胰腺炎(chronicpancreatitis)、胃硬癌(scirrhous stomach cancer)、肝纤维化(hepatic fibrosis)、肾纤维化(renal fibrosis)、纤维血管病(fibrous vascular disease)、由于作为糖尿病并发症的纤维化微血管炎(fibrous microvasculitis)导致的视网膜病变(retinopathy)、神经症(neurosis)、肾病变(nephropathy)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、肾小管间质性肾炎(renal tubule interstitial nephritis)、遗传性肾脏疾病(hereditaryrenaldiseases)、动脉硬化周围动脉炎(arteriosclerosis peripheral arteritis)等。
自分泌运动因子具有酶活性，并且将生理学活性物质切割成它的底物。LPA主要由LPC产生，并且LPA与其表达在细胞表面上的受体结合，激活细胞内G蛋白，并且，进一步地，激活在其下游的PLC、ERK和Rho，并且表现出生理作用，诸如细胞增殖、存活和迁移。因此，本发明的适体和复合物可以用作与这些途径的激活相关的疾病的药物、诊断剂、测试药或试剂。关于疾病，可以提及上述涉及器官或组织纤维化的疾病。
本发明的药物可以是与药用载体配制在一起的药物。作为药用载体的实例，可以提及下列各项：赋形剂如蔗糖，淀粉，甘露醇(mannit)，山梨醇，乳糖，葡萄糖，纤维素，滑石，磷酸钙，和碳酸钙；粘合剂如纤维素，甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚丙基吡咯烷酮，明胶，阿拉伯树胶，聚乙二醇，蔗糖，和淀粉；崩解剂如淀粉，羧甲基纤维素，羟基丙基淀粉，乙二醇淀粉钠(sodium-glycol-starch)，碳酸氢钠，磷酸钙，和柠檬酸钙；润滑剂如硬脂酸镁，二甲硅油气凝胶(Aerosil)，滑石，和十二烷基硫酸钠；调味剂如柠檬酸，薄荷醇，甘草皂苷-铵盐，甘氨酸，和橙味粉剂；防腐剂如苯甲酸钠，亚硫酸氢钠，对羟基苯甲酸甲酯，和对羟基苯甲酸丙酯；稳定剂如柠檬酸，柠檬酸钠，和乙酸；悬浮剂如甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，和硬脂酸铝；分散剂如表面活性剂；稀释剂如水，生理盐水，和橙汁；基质蜡(base waxs)诸如可可脂，聚乙二醇，和煤油；等等，但是这些不是限制性的。
尽管本发明的药物的施用途径没有特别限制，例如，可以提及口服施用和肠胃外施用。适合口服施用的制剂是通过将有效量的配体溶解在稀释剂如水、生理盐水、或橙汁中而制备的溶液；包括采用固体或颗粒形式的有效量的配体的胶囊、囊剂或片剂；通过将有效量的活性成分悬浮在适当的分散剂中而制备的混悬液；通过在适当的分散剂中分散并且乳化有效量活性成分的溶液而制备的乳状液，等等。
需要时出于掩饰味道、肠内溶出、缓释等目的，本发明的药物可以通过本身已知的方法进行包衣。作为用于包被的包衣剂的实例，使用下列各项：羟丙基甲基纤维素，乙基纤维素，羟甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚氧乙烯二醇，吐温80，Pluronic F68，醋酸邻苯二甲酸纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羟甲基纤维素乙酸琥珀酸酯，Eudragit(由德国Rohm制造，甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物)，染料(例如，红色氧化铁，二氧化钛等)等。所述药物可以是快速释放的制剂或缓释的制剂。缓释的基质的实例包括脂质体、去端肽胶原(atelocollagen)、明胶、羟磷灰石、PLGA等。
作为适于肠胃外施用(例如，静脉内施用、皮下施用、肌内施用、局部施用、腹膜内施用、鼻内施用、肺部施用等)的制剂，可用水性和非水性等渗无菌注射液，其可以包括抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂、等渗剂等。也可以提及水性和非水性无菌混悬液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂等。制剂可以以单位剂量体积或以数个分开的剂量包含在容器中，如安瓿或小瓶中。活性成分和药用载体也可以是冻干的，并且以这样的状态保存，即，其可以在即将使用前溶解或悬浮在适当的无菌载体中。缓释制剂也是合适的制剂。缓释制剂包括从埋植在体内的载体或容器持续释放，所述载体或容器诸如人工骨，可生物降解的或不可降解的海绵，袋子，药泵，渗透压泵等。用于从体外持续地或间歇地，全身地或局部地递送的装置也包括在缓释制剂的范围内。可生物降解的基质包括脂质体，阳离子脂质体，聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)，去端肽胶原，明胶，羟磷灰石，多糖西佐喃(polysaccharide sizofiran)。除了液体注射剂和缓释制剂，吸入剂和油膏也是可接受的。在吸入剂的情形中，将处于冻干状态的活性成分微粉化，并且使用适当的吸入装置通过吸入而施用。当需要时，吸入剂可以适当地用常规使用的表面活性剂、油、调料、环糊精或其衍生物等配制。
在此，作为表面活性剂的实例，可以提及下列各项：油酸，卵磷脂(lecithin)，二油酸二甘醇酯，油酸四氢糠酯(tetrahydroflufuryl oleate)，油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，三油酸甘油酯，单月桂酸甘油酯，单油酸甘油酯，单硬脂酸甘油酯，甘油基monolysinoate，鲸蜡醇，硬脂醇，聚乙二醇400，氯化十六烷基吡啶，三油酸失水山梨糖醇酯(商标名，司盘85)，单油酸失水山梨糖醇酯(商标名，司盘80)，单月桂酸失水山梨糖醇酯(商标名，司盘20)，聚氧乙烯硬化蓖麻油(商标名，HCO-60)，聚氧乙烯(20)单月桂酸失水山梨糖醇酯(商标名，吐温20)，聚氧乙烯(20)单油酸失水山梨糖醇酯(商标名，吐温80)，天然来源的卵磷脂(商标名，Epiclon)，油烯基聚氧乙烯(2)醚(商标名，Brij 92)，硬脂酰聚氧乙烯(2)醚(商标名，Brij 72)，十二烷基聚氧乙烯(4)醚(商标名，Brij 30)，油烯基聚氧乙烯(2)醚(商标名，Genapol 0-020)，氧乙烯和氧丙烯嵌段共聚物(商标名，Synperonic)等等。作为油的实例，可以提及玉米油、橄榄油、棉籽油、葵花油等。在油膏的情形中，将适当的药用基质(黄色矿脂，白色矿脂，石蜡，plastibase，硅氧烷，白色油膏，蜂蜡，猪油，植物油，亲水性油膏，亲水性矿脂，纯化的羊毛脂，水解羊毛脂，吸水性油膏，亲水性plastibase，聚二乙醇油膏等)与活性成分掺合，并且用作制剂。
吸入剂可以按照常规方法生产。具体地，吸入剂可以这样生产：通过将上述本发明的适体和复合体粉末化或液化，将其掺加到吸入推进剂和/或载体中，并且将其填充在适当的吸入容器中。当上述本发明适体和复合体是粉末时，可以使用普通的机械粉末吸入器；在液体的情形中，可以使用诸如喷雾器的吸入器。此处，作为推进剂，可以广泛使用常规已知的推进剂；可以提及下列各项：含氯氟烃-系列化合物，如含氯氟烃-11，含氯氟烃-12，含氯氟烃-21，含氯氟烃-22，含氯氟烃-113，含氯氟烃-114，含氯氟烃-123，含氯氟烃-142c，含氯氟烃-134a，含氯氟烃-227，含氯氟烃-C318，和1,1,1,2-四氟乙烷，烃类如丙烷，异丁烷，和正丁烷，醚如二乙醚，压缩气体如氮气和二氧化碳气体，等等。
在此，作为表面活性剂的实例，可以提及下列各项：油酸，卵磷脂，二油酸二甘醇酯，油酸四氢糠酯，油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，三油酸甘油酯，单月桂酸甘油酯，单油酸甘油酯，单硬脂酸甘油酯，甘油基monolysinoate，鲸蜡醇，硬脂醇，聚乙二醇400，氯化十六烷基吡啶，三油酸失水山梨糖醇酯(商标名，司盘85)，单油酸失水山梨糖醇酯(商标名，司盘80)，单月桂酸失水山梨糖醇酯(商标名，司盘20)，聚氧乙烯硬化蓖麻油(商标名，HCO-60)，聚氧乙烯(20)单月桂酸失水山梨糖醇酯(商标名，吐温20)，聚氧乙烯(20)单油酸失水山梨糖醇酯(商标名，吐温80)，天然来源的卵磷脂(商标名，Epiclon)，油烯基聚氧乙烯(2)醚(商标名，Brij 92)，硬脂酰聚氧乙烯(2)醚(商标名，Brij 72)，十二烷基聚氧乙烯(4)醚(商标名，Brij 30)，油烯基聚氧乙烯(2)醚(商标名，Genapol 0-020)，氧乙烯和氧丙烯嵌段共聚物(商标名，Synperonic)等等。作为油的实例，可以提及玉米油、橄榄油、棉籽油、葵花油等。在油膏的情形中，将适当的药用基质(黄色矿脂，白色矿脂，石蜡，plastibase，硅氧烷，白色油膏，蜂蜡，猪油，植物油，亲水性油膏，亲水性矿脂，纯化的羊毛脂，水解羊毛脂，吸水性油膏，亲水性plastibase，聚二乙醇油膏等)与活性成分掺合，并且用作制剂。
本发明药物的剂量取决于活性成分的类型和活性、疾病的严重性、作为施用受试者的动物物种、施用的受试者的药物耐受性、体重、年龄等而变化，并且，基于每天用于成年人的活性成分量，通常的剂量可以是约0.0001–约100mg/kg，例如，约0.0001–约10mg/kg，优选约0.005–约1mg/kg。
本发明的适体和复合物能够特异性结合自分泌运动因子。因此，本发明的适体和复合物用作自分泌运动因子检测的探针。所述探针用于自分泌运动因子的体内成像、血液浓度测量、组织染色、ELISA等。另外，所述探针用作涉及自分泌运动因子的疾病(纤维化、伴有恶性肿瘤的疾病等)的诊断剂、检测药物、试剂等。
此外，基于与自分泌运动因子的特异性结合，本发明的适体和复合物可以用作配体用于自分泌运动因子的分离和纯化。
另外，本发明的适体和复合物可以用作药物递送剂，递送至体内自分泌运动因子定位的部分。
本发明还提供将本发明适体和复合体固定在其上的固相载体。作为所述固相载体的实例，可以提及基底、树脂、平板(例如，多孔平板)、滤器、药筒、柱和多孔材料。所述基底可以是用在DNA芯片、蛋白质芯片等中的基底；例如，可以提及镍-PTFE(聚四氟乙烯)基底，玻璃基底，磷灰石基底，硅基底，氧化铝基底等，和通过用聚合物等包被这些基底而制备的基底。作为树脂的实例，可以提及下列各项：琼脂糖颗粒，二氧化硅颗粒，丙烯酰胺和N,N’-亚甲基二丙烯酰胺的共聚物，聚苯乙烯-交联的二乙烯基苯颗粒，与表氯醇交联的葡聚糖颗粒，纤维素纤维，芳基葡聚糖和N,N’-亚甲基二丙烯酰胺的交联聚合物，单分散性合成聚合物，单分散性亲水性聚合物，琼脂糖，Toyopearl等，并且还包括通过将各种官能团结合在这些树脂上而制备的树脂。本发明的固相载体可以有效用于，例如，纯化、检测和定量自分泌运动因子。
本发明的适体和复合物可以通过本身已知的方法固定在固相载体上。例如，可以提及这样的方法，即，所述方法向本发明的适体或复合物中引入亲和性物质(例如，上述那些)或预先确定的官能团，并且然后将所述适体和复合物通过所述亲和性物质或预先确定的官能团固定在固相载体上。本发明还提供此类方法。所述预先确定的官能团可以是可以进行偶联反应的官能团；例如，可以提及氨基、硫醇基团、羟基、和羧基。本发明还提供在其中引入这样的官能团的适体。
本发明还提供了纯化和浓缩自分泌运动因子的方法。特别地，本发明的纯化方法使将自分泌运动因子从其他家族蛋白中分离成为可能。本发明的纯化和浓缩方法可以包括将自分泌运动因子吸附到本发明的固相载体上，并且用洗脱剂洗脱所吸附的自分泌运动因子。将自分泌运动因子吸附到本发明的固相载体上可以通过本身已知的方法实现。例如，将含有自分泌运动因子的样品(例如，细菌或细胞培养物或培养物上清，血液)引入到本发明的固相载体中或引入到包含本发明的固相载体的组合物中。自分泌运动因子可以使用诸如中性溶液的洗脱剂来洗脱。对所述中性洗脱剂没有限制，其可以具有例如约6-约9、优选约6.5-约8.5、且更优选约7-约8的pH。所述中性溶液还可以包括，例如，尿素、螯合剂(例如，EDTA)、钠盐(例如，NaCl)、钾盐(例如，KCl)、镁盐(例如，MgCl2)、表面活性剂(例如，吐温20，Triton，NP40)和甘油。本发明的纯化和浓缩方法还可以包括在自分泌运动因子吸附后用洗涤溶液洗涤所述固相载体。洗涤溶液的实例，包括含有尿素、螯合剂(例如，EDTA)、Tris、酸、碱、转移RNA、DNA、表面活性剂诸如吐温20、盐诸如NaCl等的那些。本发明的纯化和浓缩方法还可以包括加热所述固相载体。该步骤能使所述固相载体再生和灭菌。
本发明还提供检测和定量自分泌运动因子的方法。特别地，本发明使与其他家族蛋白的蛋白分开地检测和定量自分泌运动因子成为可能。本发明的检测和定量方法可以包括通过使用本发明的适体(例如，使用本发明的复合体和固相载体)测量自分泌运动因子。检测和定量自分泌运动因子的方法可以以与免疫学方法相同的方式进行，不同的是用本发明的适体替代抗体。因此，检测和定量可以通过使用本发明的适体作为探针替代抗体，以与诸如下列各项的那些方法相同的方式进行：酶免疫测定(EIA)(例如，直接竞争性ELISA，间接竞争性ELISA，夹心ELISA)，放射性免疫测定(RIA)，荧光免疫测定(FIA)，蛋白质印迹法，免疫组织化学染色方法，和细胞分选方法。其还可以用作用于PET等的分子探针。这些方法可以有效用于，例如，测量在活生物体或生物样品中的自分泌运动因子含量，并且诊断与自分泌运动因子相关的疾病。
在本文中提及的所有出版物的公开内容，包括专利和专利申请说明书，通过引用以所有这些出版物被明确地给出的程度结合在本发明中。
本发明在下文通过参考实施例更详细地阐述，所述实施例不应该解释为限制性的。
[实施例]
实施例1：制备特异性结合自分泌运动因子的DNA适体-1
使用40个核苷酸的随机序列作为DNA模板，进行部分改进的SELEX方法(Fitter等，Stephen Fitter和Robert James，J.Biol.Chem.，VOL.280，NO.40，第34193-34201页，2005年10月7日的方法)。作为SELEX的目标物质，使用固定在TALON金属亲和树脂(由Clontech制造)上的His-标记的自分泌运动因子(重组的人自分泌运动因子，由R&D制备)作为载体。所用的模板和引物的序列如下所示。通过化学合成产生DNAs的随机库和引物。
通过PCR扩增结合到自分泌运动因子上的DNAs，并且用外切核酸酶(BioLabs)处理，以给出单链DNAs。然后，将它们用λ外切核酸酶(BioLabs)处理，从而将双链DNAs转化为单链DNAs，并且该单链DNAs用作下一轮的库。
DNA随机库序列：
5’-GTGGTCTAGCTGTACTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCACAGTCAACGAGCTA-3’(SEQ ID NO:1)
正向引物:5’-GTGGTCTAGCTGTACTC-3’(SEQ ID NO:2)
反向引物:5’-p-TAGCTCGTTGACTGTGG-3’(SEQ ID NO:3)
所述DNA随机库序列(SEQ ID NO:1)中的N是脱氧核糖核苷酸(A，G，C或T)的任意组合。另外，使用在5’-端磷酸化(p)的引物Rev。
7轮SELEX后，检验51个克隆的序列，以寻找序列中的收敛性(convergence)。其序列显示在SEQ ID NOs:4–10中。这些之中，10个序列具有SEQ ID NO:4所示的序列，19个序列具有SEQ ID NO:5所示的序列，2个序列具有SEQ ID NO:6所示的序列，2个序列具有SEQ IDNO:7所示的序列，4个序列具有SEQ ID NO:8所示的序列，1个序列具有SEQ ID NO:9所示的序列，和2个序列具有10所示的序列。这些序列包含下述共有序列。在这些序列中，具有SEQID NOs:4和5所示的核苷酸序列的克隆的二级结构预测显示在图1A中。图1B显示了下述共有子序列可能的共有二级结构1。在图1A中，这些克隆中包含的共有子序列的核苷酸用圆圈(○)圈出。与X1-X4对应的核苷酸以虚线圆圈(○)圈出。
每个核苷酸序列显示如下。除非特别指明，下文所示的序列是5’至3’方向，并且全部是脱氧核糖核苷酸。
SEQ ID NO:4:
GTGGTCTAGCTGTACTCTCCGGAACCAGAGCAATTTGGTCGAGCGCTATCGGATGGTCCACAGTCAACGAGCTA
SEQ ID NO:5:
GTGGTCTAGCTGTACTCATGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCATTGAGTACGCCACAGTCAACGAGCTA
SEQ ID NO:6:
GTGGTCTAGCTGTACTCGGAACCGTACTCAACGGTCAGTACCTTTGCGCCGCAGCAAGCCACAGTCAACGAGCTA
SEQ ID NO:7:
GTGGTCTAGCTGTACTCGCCTGCCGGAACCGCCCCTGTGGTCGCATCGAGCAACGGCCCACAGTCAACGAGCTA
SEQ ID NO:8:
GTGGTCTAGCTGTACTCCGAAAGCCGGAACCGTGCCAATGGTCGCTACTTCAGCTCCCCACAGTCAACGAGCTA
SEQ ID NO:9:
GTGGTCTAGCTGTACTCAGGCCGGAACCGGTGAAATTGGTCGCCTAATAAGCGAAATCCACAGTCAACGAGCTA
SEQ ID NO:10:
GTGGTCTAGCTGTACTCGCCGGAACCGTACTATGGTCGCGTTGTATGACGCTTGTATCCACAGTCAACGAGCTA
共有序列:-X3X1CGGAACC-N1-GGTCX2X4(N1表示任意的7-11个核苷酸，X1、X2、X3和X4分别是任意的核苷酸，并且X1与X2和X3与X4中的至少一对形成沃森-克里克碱基对)-
SEQ ID NOs:4–10所示的全部核酸都通过化学合成产生。通过表面等离子体共振方法评价这些核酸与自分泌运动因子的结合活性。对于测量，使用GE Healthcare制造的Biacore T100。使用在其上固定了链霉抗生物素的SA芯片作为传感器芯片。与其结合的是约1500RU的16个核苷酸的聚dT，对于该聚dT，生物素结合在其5’-端。将用作配体的核酸在3’-端添加多聚腺苷酸(Poly A)(16个核苷酸)，并且通过T-A退火固定在SA芯片上。将核酸(20μL)以20μL/min的流速注入，从而固定约1500RU的核酸。针对分析物的自分泌运动因子以0.02μM制备，并且注入20μL的自分泌运动因子。作为运行缓冲液，使用溶液A(145mM氯化钠、5.4mM氯化钾、1.8mM氯化钙、0.8mM氯化镁、20mM Tris(pH 7.6)，0.05％吐温20的混合溶液)。
测量结果显示在表1中。作为测量的结果，发现SEQ ID NOs:4–10结合自分泌运动因子。SEQ ID NO:1所示的核酸库(40N)，其用于第一轮并且包含40个核苷酸的随机序列用作阴性对照，该核酸库不超过表现出最高结合量的SEQ ID NO:10的10％，并且发现该核酸库不与其结合(表示为“-”)。此处，结合量表示最大共振单位(RU)值。
通过下述方法评价这些核酸是否表现出自分泌运动因子抑制活性。作为自分泌运动因子的底物，选择含磷酸二酯键的合成的底物，即，对-硝基苯基胸苷5’-单磷酸酯(pNP-TMP)(SIGMA)(以下称为NPP2抑制性测定)。通过水解切割磷酸二酯键，并且释放对-硝基苯酚。对-硝基苯酚显出黄色，并且检测该颜色。对于测定，使用96孔平板(96孔EIA/RIA聚苯乙烯平板，Costar)，并且反应混合物的量为200μL。作为反应混合物，使用溶液A。在溶液A(100μL)中制备核酸，加入在反应混合物A中调整为10mM的pNP-TMP(20μL)，并且将混合物充分搅拌并在37℃加热5分钟。在另一方面，制备用溶液A稀释的6ng自分泌运动因子(80μL)，并且在37℃加热5分钟。加热后，将它们混合，以开始酶反应。反应溶液中最终的自分泌运动因子浓度为0.3nM，并且最终底物浓度是1mM。将包含反应混合物的平板在37℃加热24小时，放置在微量平板读数仪SpectraMax190(由Molecular Devices制造)中，并且在405nm波长下确定吸光度。在没有添加核酸时的吸光度为100％(A0)，按照下式，由每种测试物质的吸光度(A)确定抑制率。
酶活性比率＝(A/A0)x100
确定抑制50％的酶活性所需要的抑制剂的浓度(IC50)。其结果显示在表1中。当使用40N的核酸库作为对照(阴性对照)时，也进行相似的处理，并且进行所述测量。结果，SEQID NOs:4–10所示的适体表现出高抑制活性，这得到不超过100nM的IC50值的证明。
表1
对自分泌运动因子的结合活性和NPP2抑制活性(IC50值)
“-”表示不超过表现出最高结合量的SEQ ID NO:10所示的适体的10％，并且“+”表示不少于它。此处，结合量表示最大共振单位(RU)值。IC50值表示2-3次测量的平均值±标准偏差，并且“>1.0”表示在多至1.0μM的浓度范围没有发现抑制活性。
实施例2：适体的链缩短和碱基取代
使具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的适体进行链缩短和碱基取代。改变形式的序列显示在SEQ ID NOs:11–16中。这些之中，SEQ ID NOs:11和12所示的适体的二级结构预测显示在图2中。在该图中，共有子序列的核苷酸以圆圈(○)圈出。对应X1-X4的核苷酸以虚线圆圈(○)圈出。除非特别指明，下文所示的序列是5’至3’方向，并且全部都是脱氧核糖核苷酸。
SEQ ID NO:11
(SEQ ID NO:5所示的适体链缩短至包含共有序列的45个核苷酸的长度后的序列)
GTACTCATGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCATTGAGTAC
SEQ ID NO:12
(SEQ ID NO:5所示的适体链缩短至包含共有序列和在3个位点的核苷酸取代的34个核苷酸的长度后的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:13
(SEQ ID NO:5所示的适体链缩短至包含共有序列的30个核苷酸的长度后的序列)
TGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCA
SEQ ID NO:14
(SEQ ID NO:5所示的适体链缩短至包含共有序列和在2个位点的核苷酸取代的30个核苷酸的长度后的序列)
GGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCC
SEQ ID NO:15
(SEQ ID NO:5所示的适体链缩短至包含共有序列的30个核苷酸的长度后的序列)
CCTGGACGGAACCAATACTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:16
(SEQ ID NO:5所示的适体链缩短至包含共有序列和在2个位点的核苷酸取代的32个核苷酸的长度后的序列)
CTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAG
SEQ ID NOs:11–16的全部核酸通过化学合成制备。通过表面等离子体共振方法评价这些核酸是否结合自分泌运动因子。对于测量，使用GE Healthcare制造的BiacoreT100，并且通过下文所示的方法进行测量。通过使用氨基偶联试剂盒，将约2700RU的自分泌运动因子固定在CM4芯片的传感器芯片表面上。流速为20μL/min，并且注入制备为0.3μM的核酸(20μL)作为分析物。作为运行缓冲液，使用溶液A。
测量结果显示在表2中，在表2中，认为表现出不超过具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列的适体的结合量的10％的结合量的核酸不结合，并且标记为(-)，并且认为不少于其的那些是结合的，并且标记为(+)。此处的结合量是最大共振单位(RU)值。结果，发现具有SEQ ID NOs:11-14和16所示的核苷酸序列的适体结合自分泌运动因子。
通过与实施例1相似的方法测量这些核酸是否表现出自分泌运动因子抑制活性。其IC50值显示在表2中。作为NPP2抑制性测定的结果，SEQ ID NOs:11–14和16所示的适体表现出高抑制活性，这得到不超过100nM的IC50值的证实。
从表2中包含的SEQ ID NO:12的结果发现，甚至当长度为34个核苷酸并且3个位点被取代时，也保留抑制活性。从SEQ ID NO:14(其是SEQ ID NO:13中5’-端的T取代为G，3’-端的A取代为C)的结果，也发现通过部分取代链缩短至30个核苷酸也是可能的。还发现具有共有序列部分的SEQ ID NO:13具有与共有二级结构1不同的二级结构，由此，认为SEQ IDNO:13的活性显著降低，尽管仍然存在活性。
此外，SEQ ID NO:15缺少共有二级结构1的上部茎，由此，认为活性显著降低。
表2
对自分泌运动因子的结合活性和NPP2抑制活性(IC50值)
“-”表示不超过表现出最高结合量的SEQ ID NO:12所示的适体的10％，并且“+”表示不少于其。此处，结合量表示最大共振单位(RU)值。IC50值表示2-3次测量的平均值±标准偏差。
实施例3：制备特异性结合自分泌运动因子的DNA适体-2
使用与实施例1不同的40个核苷酸的随机序列作为DNA模板，以与实施例1相同的方式进行SELEX。所用的模板和引物的序列如下所示。通过化学合成产生DNA模板和引物。
DNA随机库序列：
5’-ACACTCACAGGCGCTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGTGCATGGCCGCTAGT-3’:(SEQ ID NO:17)
正向引物:5’-ACACTCACAGGCGCTGG-3’:(SEQ ID NO:18)
反向引物:5’-p-ACTAGCGGCCATGCACG-3’:(SEQ ID NO:19)
所述DNA随机库序列(SEQ ID NO:17)中的N是脱氧核糖核苷酸(A，G，C或T)的任意组合。另外，使用在5’-端磷酸化(p)的引物Rev。
8轮SELEX后，检验90个克隆的序列，以寻找具有上述共有序列的序列中的收敛性(convergence)。其序列显示在SEQ ID NOs:20-25中。这些之中，2个序列具有SEQ ID NO:20所示的序列，3个序列具有SEQ ID NO:21所示的序列，19个序列具有SEQ ID NO:22所示的序列，2个序列具有SEQ ID NO:23所示的序列，3个序列具有SEQ ID NO:24所示的序列，和3个序列具有SEQ ID NO:25所示的序列。除非特别指明，下文所示的序列是5’至3’方向，并且全部是脱氧核糖核苷酸。
SEQ ID NO:20:
ACACTCACAGGCGCTGGGGTACGCTCGGAACCGAGGCAATTGGTCAGCGTGCATGGCCGCTAGT
SEQ ID NO:21:
ACACTCACAGGCGCTGGCCACCACTGCACCGGAACCGCGAATGTGGTCGTGCATGGCCGCTAGT
SEQ ID NO:22:
ACACTCACAGGCGCTGGCCGGAACCGTGCATATGGTCGCCAGCACATCGTGCATGGCCGCTAGT
SEQ ID NO:23:
ACACTCACAGGCGCTGGCACGGACCGGAACCGGGACGCTCGGTCGACCGTGCATGGCCGCTAGT
SEQ ID NO:24:
ACACTCACAGGCGCTGGCGAGTCGGAACCGAGCCGATTGGTCACTCGCGTGCATGGCCGCTAGT
SEQ ID NO:25:
ACACTCACAGGCGCTGGCGACGTCGGAACCGTGTACCATGGTCACGTCGTGCATGGCCGCTAGT
SEQ ID NOs:20-25所示的全部核酸都通过化学合成产生。通过与实施例2相似的表面等离子体共振方法评价这些核酸与自分泌运动因子的结合活性。测量结果显示在表3中。作为测量的结果，发现SEQ ID NOs:20-25结合自分泌运动因子。所述核酸库(40N)，其用于第一轮并且包含40个核苷酸的随机序列用作阴性对照，该核酸库不超过表现出最高结合量的SEQ ID NO:22的10％，并且发现该核酸库不与其结合(表示为“-”)。此处，结合量表示最大共振单位(RU)值。
通过与实施例1相似的方法测量这些核酸是否表现出自分泌运动因子抑制活性。其IC50值显示在表3中。作为NPP2抑制性测定的结果，SEQ ID NOs:20–25所示的适体表现出高抑制活性，这得到不超过100nM的IC50值的证实。
表3
对自分泌运动因子的结合活性和NPP2抑制活性(IC50值)
“-”表示不超过表现出最高结合量的SEQ ID NO:22所示的适体的10％，并且“+”表示不少于其。此处，结合量表示最大共振单位(RU)值。IC50值表示2-3次测量的平均值±标准偏差，并且“>1.0”表示在多至1.0μM的浓度范围没有发现抑制活性。
实施例4：适体的链缩短
使SEQ ID NOs:20和22进行链缩短。序列的改变形式显示在SEQ ID NOs:26–29中。
除非特别指明，下文所示的序列是5’至3’方向，并且全部都是脱氧核糖核苷酸。
SEQ ID NO:26(SEQ ID NO:20所示的适体链缩短至包含共有序列的38个核苷酸的长度后的序列)：
CGCTGGGGTACGCTCGGAACCGAGGCAATTGGTCAGCG
SEQ ID NO:27(SEQ ID NO:20所示的适体链缩短至包含共有序列的32个核苷酸的长度后的序列)：
TACGCTCGGAACCGAGGCAATTGGTCAGCGTG
SEQ ID NO:28(SEQ ID NO:22所示的适体链缩短至包含共有序列的31个核苷酸的长度后的序列)：
ACAGGCGCTGGCCGGAACCGTGCATATGGTC
SEQ ID NO:29(SEQ ID NO:22所示的适体链缩短至包含共有序列的31个核苷酸的长度后的序列)：
GCTGGCCGGAACCGTGCATATGGTCGCCAGC
SEQ ID NOs:26–29所示的全部核酸通过化学合成制备。通过与实施例1相似的方法测量这些核酸是否表现出自分泌运动因子抑制活性。其IC50值显示在表4中。结果，SEQ IDNOs:27和29所示的适体表现出高抑制活性，这得到不超过100nM的IC50值的证实。
尽管SEQ ID NOs:26和28包含共有序列，但是它们与共有二级结构1不同，并且它们的抑制活性显著降低(表4)。相反，发现进行链缩短具有所述共有二级结构的SEQ IDNOs:27和29表现出高抑制活性。
[表4]
针对自分泌运动因子的NPP2抑制活性(IC50值)
SEQ ID NO: 长度 NPP2抑制性测定IC50值(μM)
26 38 0.44±0.041
27 32 0.024±0.010
28 31 >1.0
29 31 0.011±0.0040
IC50值表示2-3次测量的平均值±标准偏差，并且“>1.0”表示在多至1.0μM的浓度范围没有发现抑制活性。
实施例5：链缩短的适体的修饰
产生SEQ ID NO:12所示的适体的具有修饰的末端的改变的形式和其中向序列中的嘌呤核苷酸的2’-位核糖中引入修饰的改变的形式。其序列显示在SEQ ID NOs:12(1)-12(148)中。所有的核酸都通过化学合成制备。除非特别指明，下文所示的各个序列都是5’至3’方向的脱氧核糖核苷酸。核苷酸中的括号表示2’-位的修饰，M表示甲氧基。U表示尿嘧啶，小写字母s表示硫代磷酸酯化。Nj和N(M)j(N为A，G，C或T)分别表示P-甲基化的核苷酸和P-甲基化和2’-甲氧基化的核苷酸(见下述结构式)。
P-甲基核苷酸(CjAj)
P-甲基-2’甲氧基核苷酸(C(M)jA(M)j)
末端修饰中的idT表示反向-dT，并且C12或6表示间隔臂C12或6。此外，Y表示ssH接头。另外，40P表示SUNBRIGHT GL2-400GS2，80P表示SUNBRIGHT GL2-800GS2，40PP表示SUNBRIGHT GL2-400TS，80PP表示SUNBRIGHT GL2-800TS，80PPP表示SUNBRIGHT GL4-800GS2，40PPPP表示SUNBRIGHT GL4-400TS，并且80PPPP表示SUNBRIGHT GL4-800TS，它们中的每一个都是聚乙二醇。
SEQ ID NO:12(1):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
C(M)C(M)T(M)GGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(2):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTC(M)C(M)AGG
SEQ ID NO:12(3):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)
SEQ ID NO:12(4):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAAC(M)C(M)AGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(5):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTT(M)T(M)GGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(6):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTG(M)G(M)TCTCCAGG
SEQ ID NO:12(7):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCA(M)G(M)AATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(8):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGA(M)CGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(9):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCT(M)CCAGG
SEQ ID NO:12(10):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAA(M)CCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(11):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGT(M)CTCCAGG
SEQ ID NO:12(12):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGAC(M)GGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(13):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACG(M)GAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(14):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGG(M)AACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(15):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGA(M)ACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(16):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAA(M)TACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(17):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAAT(M)ACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(18):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATA(M)CTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(19):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATAC(M)TTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(20):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACT(M)TTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(21):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTG(M)G(M)ACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(22):(向两个末端引入idT的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
idT-CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG-idT
SEQ ID NO:12(23):(向其中引入40kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQ ID NO:12(22)所示的适体的序列)
40P-Y-CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG-idT
SEQ ID NO:12(24):(向其中引入甲氧基-修饰的SEQ ID NO:12(22)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTC CA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(25):(向其中引入甲氧基-修饰的SEQ ID NO:12(22)所示的适体的序列)
idT-C(M)C(M)T(M)G(M)G(M)AC(M)GG(M)AAC(M)C(M)A(M)G(M)AA(M)T(M)A(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(26):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTC(M)TCCAGG
SEQ ID NO:12(27):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGA(M)ATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(28):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTT(M)TTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(29):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTGG(M)TCTCCAGG
SEQ ID NO:12(30):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTG(M)GTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(31):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAAC(M)CAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(32):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACC(M)AGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(33):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTT(M)GGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(34):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTT(M)TGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(35):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTG(M)GACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(36):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGG(M)ACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(37):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTC(M)CAGG
SEQ ID NO:12(38):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCC(M)AGG
SEQ ID NO:12(39):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CCT(M)GGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(40):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
CC(M)TGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(41):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12所示的适体的序列)
C(M)CTGGACGGAACCAGAATACTTTTGGTCTCCAGG
SEQ ID NO:12(42):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12(22)所示的适体的序列)
idT-C(M)CTGG(M)AC(M)GG(M)AAC(M)C(M)A(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(43):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12(22)所示的适体的序列)
idT-C(M)CTGG(M)AC(M)GG(M)AAC(M)CA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(44):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12(22)所示的适体的序列)
idT-C(M)CTGG(M)AC(M)GG(M)AACC(M)A(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(45):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12(22)所示的适体的序列)
idT-C(M)CTGGAC(M)GG(M)AAC(M)CA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(46):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12(22)所示的适体的序列)
idT-C(M)CTGGAC(M)GG(M)AACC(M)A(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(47):(向其中引入甲氧基修饰的SEQ ID NO:12(22)所示的适体的序列)
idT-C(M)CTGG(M)AC(M)GG(M)AAC(M)C(M)A(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTC(M)CA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(48):(向其中引入40kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
40P-Y-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(49):(向其中引入40kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQ ID NO:12(42)所示的适体的序列)
40P-Y-C(M)CTGG(M)AC(M)GG(M)AAC(M)C(M)A(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(50):(向其中引入80kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
80P-Y-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(51):(具有不同于SEQ ID NO:12(50)的80kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
80PP-Y-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(52):(具有不同于SEQ ID NO:12(50)和12(51)的80kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
80PPP-Y-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(53):(具有不同于SEQ ID NO:12(50)-12(52)的80kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
80PPPP-Y-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(54):(向其中引入C12替代3’-端idT的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-C12
SEQ ID NO:12(55):(向其中引入C12替代5’-端idT的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
C12-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(56):(向其中引入C6替代3’-端idT的SEQ ID NO:12(48)所示的适体的序列)
40P-Y-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-C6
SEQ ID NO:12(57):(向其中引入C12替代3’-端idT的SEQ ID NO:12(48)所示的适体的序列)
40P-Y-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-C12
SEQ ID NO:12(58):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCjTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(59):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGjGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(60):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATjA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(61):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACjCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(62):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCjTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(63):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代。)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCAjG(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(64):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)GjAATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(65):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)CjTTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(66):(向5’-端引入不同于SEQ ID NO:12(48)的40kDa聚乙二醇的SEQ ID NO:12(48)所示的适体的序列)
40PP-Y-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(67):(向5’-端引入不同于SEQ ID NO:12(48)和SEQ ID NO:12(66)的40kDa聚乙二醇的SEQ ID NO:12(48)所示的适体的序列)
40PPPP-Y-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(68):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中在一个位点的T被U(M)取代)
idT-CCU(M)GGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(69):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中在一个位点的T被U(M)取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTU(M)GGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(70):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中在一个位点的T被U(M)取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTU(M)TGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(71):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中在一个位点的T被U(M)取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCU(M)CCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(72):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中在一个位点的T被U(M)取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGU(M)CTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(73):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中在一个位点的T被U(M)取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TU(M)TTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(74):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中在一个位点的T被U(M)取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)U(M)TTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(75):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中在一个位点的T被U(M)取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AAU(M)A(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(76):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAsC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(77):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GsG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(78):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AsACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(79):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AAsCCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(80):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACsCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(81):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCsA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(82):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTsGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(83):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGsGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(84):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGsTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(85):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTsCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(86):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCsTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(87):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTsTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(88):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中两个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACjCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCjTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(89):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGjTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(90):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGjGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(91):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代。)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCjA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(92):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代。)
idT-CCTGGAC(M)GjG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(93):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代。)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AjACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(94):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代。)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AAjCCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(95):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代。)
idT-CCTGGAjC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(96):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代。)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTjCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(97):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代。)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTjCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(98):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)sAATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(99):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AsATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(100):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AAsTA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(101):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATsA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(102):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)sTTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(103):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TsTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(104):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTsTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(105):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)sAACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(106):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)sGG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(107):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CsCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(108):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCsTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(109):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTsGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(110):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGsGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(111):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGsAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(112):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTsCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(113):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCsCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(114):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCsA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(115):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)sG(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(116):(向其中引入硫代磷酸酯的SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)sG(M)-idT
SEQ ID NO:12(117):(向其中引入40kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQID NO:12(77)所示的适体的序列)
40P-Y-CCTGGAC(M)GsG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(118):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中两个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(119):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中三个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCjTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(120):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTjGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(121):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTjTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(122):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTjTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(123):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TjTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(124):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AjATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(125):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AAjTA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(126):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCjA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(127):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCjCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(128):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTGGjAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(129):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CCTjGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(130):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CjCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(131):(向其中引入40kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQID NO:12(92)所示的适体的序列)
40P-Y-CCTGGAC(M)GjG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(132):(SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中10个位点被P-甲基核苷酸取代)
idT-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(133):(向其中引入40kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQID NO:12(119)所示的适体的序列)
40P-Y-CCTGGAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCjTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(134):(向其中引入40kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQID NO:12(132)所示的适体的序列)
40P-Y-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(135):(SEQ ID NO:12(132)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基-2’甲氧基核苷酸取代)
idT-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)j-idT
SEQ ID NO:12(136):(SEQ ID NO:12(132)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基-2’甲氧基核苷酸取代)
idT-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)jG(M)-idT
SEQ ID NO:12(137):(SEQ ID NO:12(132)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基-2’甲氧基核苷酸取代)
idT-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)jG(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(138):(SEQ ID NO:12(132)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基-2’甲氧基核苷酸取代)
idT-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AjATA(M)C(M)jTjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(139):(SEQ ID NO:12(132)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基-2’甲氧基核苷酸取代)
idT-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AjATA(M)jC(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(140):(SEQ ID NO:12(132)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基-2’甲氧基核苷酸取代。)
idT-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)jAjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(141):(SEQ ID NO:12(132)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基-2’甲氧基核苷酸取代)
idT-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)jG(M)AjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(142):(SEQ ID NO:12(132)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基-2’甲氧基核苷酸取代)
idT-CjCTGGjAC(M)GjG(M)jAACjCA(M)G(M)AjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(143):(SEQ ID NO:12(132)所示的适体的序列，其中一个位点被P-甲基-2’甲氧基核苷酸取代)
idT-CjCTGGjAC(M)jGjG(M)AACjCA(M)G(M)AjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(144):(向其中引入40kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQID NO:12(135)所示的适体的序列)
40P-Y-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)j-idT
SEQ ID NO:12(145):(向其中引入40kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQID NO:12(139)所示的适体的序列)
40P-Y-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AjATA(M)jC(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(146):(向其中引入40kDa聚乙二醇替代5’-端idT的SEQID NO:12(141)所示的适体的序列)
40P-Y-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)jG(M)AjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(147):(SEQ ID NO:12(134)所示的适体的序列，其中3个位点被P-甲基-2’甲氧基核苷酸取代
40P-Y-CjCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)jG(M)AjATA(M)jC(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)j-idT
SEQ ID NO:12(148):(SEQ ID NO:12所示的适体的序列，其进行甲氧基-修饰并且向3’-端引入idT)
CCTGGAC(M)GG(M)AACCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NOs:12(1)-12(148)的所有核酸都通过化学合成产生。测量这些核酸是否表现出自分泌运动因子抑制活性。
反应溶液的量设为36μL，并且测量方法如下述。向添加了14:0LPC(用溶液A制备)至0.5mM的终浓度的人血库血清(human pool serum)(由Kohjin Bio Co.，Ltd.制备)(33μL)中加入溶解在溶液A中的适体(3μL)(终血清浓度约92％)，并且将混合物在37℃加热。3小时后，加入100mM EDTA溶液(4μL)，以中断自分泌运动因子活性，并且测量LPA浓度。LPA浓度通过Kishimoto等(Kishimoto，Clinica Chimica Acta 333，59-69，2003)的方法测量。用在添加了溶液A替代适体的血清中产生的LPA浓度作为对照(L0)，根据下式，由在添加了适体的血清中的LPA浓度(L)确定每种适体的抑制率。
抑制率＝(L0-L)/L0)x100
在37℃加热3小时的样品的自分泌运动因子活性抑制率(LPA产生抑制率)显示在表5中。在LPA测定中，SEQ ID NOs:12(1)-12(4)、12(6)-12(9)、12(12)-12(25)、12(27)-12(41)所示的适体在5μM的浓度表现出不少于50％的高抑制活性。在LPA测定中，SEQ ID NOs:12(42)-12(49)所示的适体在1μM的浓度表现出不少于50％的高抑制活性。在LPA测定中，SEQ ID NOs:12(50)-12(57)所示的适体在0.2μM的浓度表现出不少于50％的高抑制活性。在LPA测定中，SEQ ID NOs:12(58)-12(68)、12(75)-12(78)、12(80)-12(88)、12(90)-12(92)、12(95)-12(96)、12(98)-12(104)、12(106)-12(131)所示的适体在0.1μM的浓度表现出不少于50％的高抑制活性。在LPA测定中，SEQ ID NOs:12(132)-12(135)、12(137)、12(139)、12(141)、12(144)-12(147)所示的适体在0.025μM的浓度表现出不少于50％的高抑制活性。从前述表明这些适体具有针对血清中的自分泌运动因子的磷脂酶D活性的抑制活性。
[表5-1]
适体针对自分泌运动因子的抑制活性
[表5-2]
适体针对自分泌运动因子的抑制活性(续)
[表5-3]
适体针对自分泌运动因子的抑制活性(续)
LPA产生抑制率(％)表示在加入适体后3小时LPA产生的抑制率。
以与实施例1相同的方式，通过NNP2抑制性测定测量SEQ ID NO:12(148)是否显示自分泌运动因子抑制活性。结果，发现其具有由6.8nM的IC50值所示的高抑制活性。
实施例6：证实自分泌运动因子适体的特异性
通过表面等离子体共振方法验证SEQ ID NO:12(48)所示的适体是否具有针对FGF2(PeproTech)的结合活性。对于测量，使用GE Healthcare制造的Biacore T100，并且通过下文所示的方法进行测量。将大约2700RU的自分泌运动因子固定在CM4芯片的传感器芯片表面上，并且通过使用氨基偶联试剂盒将FGF2固定在流动池3上(大约1100RU)。以20μL/min的流速，注入制备成0.3μM的核酸(20μL)作为分析物。作为运行缓冲液，使用溶液A。
从测量的结果发现SEQ ID NO:12(48)所示的适体不结合FGF2(图3)。这表明本发明的适体特异性结合自分泌运动因子。
实施例7：自分泌运动因子适体对肺纤维化的作用
向博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠中腹膜内施用实施例4中制备的SEQ ID NO:12(48)所示的适体，并且验证其作用。
在麻醉下，向ICR品系SPF小鼠(10周龄，雄性，Charles River LaboratoriesJapan，Inc.)气管内施用以PBS制备的770μg/mL的博来霉素(50μL)。从博来霉素施用的次日起，以100μL的单一剂量每天腹膜内施用一次溶解在含有1mM氯化镁的PBS中的自分泌运动因子适体溶液或仅含有1mM氯化镁的PBS(赋型剂组)。适体的剂量是两个剂量的1和3mg/kg/天。未治疗的对照组也饲养相同的测试期。在自博来霉素施用起的第21天，结束检测，分离肺，并且将左肺低温保存以用于羟脯氨酸测量。羟脯氨酸用BioVision，Inc.的羟脯氨酸比色测定试剂盒进行检测。
结果显示在图4中，结果显示为6–7只小鼠的平均值±标准误差。相对于赋型剂组，在所有适体施用组中发现对病理学的抑制。
从上文表明SEQ ID NO:12(48)所示的适体可用作肺纤维化的治疗药物。
实施例8：测量自分泌运动因子抑制活性
通过下述方法评价SEQ ID NOs:12(144)和12(149)所示的适体是否抑制自分泌运动因子的溶血磷脂酶D活性。作为自分泌运动因子的底物，选择14:0溶血磷脂酰胆碱(LPC，Avanti)(以下称作LysoPLD抑制性测定)。LPC被自分泌运动因子的溶血磷脂酶D活性水解，并且分解成溶血磷脂酸(LPA)和胆碱。胆碱被胆碱氧化酶氧化，以提供过氧化氢。在过氧化氢和过氧化物酶的存在下，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(TOOS)和4-氨基安替比林(4-AA)进行氧化缩合反应，该反应显出可以检测到的紫色。
对于反应，使用96孔平板(聚丙烯96孔，由BMbio制造)，并且反应混合物的量是60μL。作为反应溶液，使用溶液A。在溶液A(20μL)中制备核酸，并且向其中加入在溶液A(30μL)中调节的4mM 14:0LPC，并将它们彻底混合。制备用溶液A稀释的10μL自分泌运动因子(12.5ng)并且加入其中。将包含反应混合物的平板在37℃加热以起始反应。自分泌运动因子在反应溶液中的终浓度是2.1nM，并且最终底物浓度为2mM。按下述评价自分泌运动因子的溶血磷脂酶D活性。将15μL反应混合物放置在用于测定的96孔平板(96孔EIA/RIA聚苯乙烯平板，由Costar制造)中，向其中加入溶液B(150μL)，并且将混合物在37℃加热5分钟。溶液B是100mM tris(pH 8.0)、0.5mM TOOS(由DOJINDO制备)，10U/mL过氧化物酶(由TOYOBO制备)和0.01％Triton-X(由Wako制备)的混合溶液。在波长548nm测量吸光度，并且作用空白值。然后，加入溶液C(50μL)，并且测量波长548nm处吸光度随时间的变化。溶液C包含100mMtris(pH 8.0)、10U/mL胆碱氧化酶(由TOYOBO制备)、1mM4-AA(由DOJINDO制备)和0.01％Triton-X。从在加入溶液C后15分钟时的吸光度减去在加入溶液B的时间点时的溶液空白的吸光度(其在较早的时间测量)，由此得到真实的吸光度值。在开始反应后立即(0小时)和在加热至37℃后6小时进行该反应，并且从6小时后的值减去在0小时的真实吸光度，以给出值(D)。没有抑制剂的D值(D0)为100％，由下述等式确定酶活性比率，其中DA是加入抑制剂时的D值。
酶活性比率＝(DA/D0)x100
确定抑制50％的酶活性所需要的抑制剂的浓度(IC50)。其结果显示在表6中。表6显示针对自分泌运动因子的LysoPLD抑制活性，并且显示SEQ ID NO:12(144)、SEQ ID NO:12(149)、40N和S32826所示的适体的LysoPLD抑制性测定IC50值(nM)。LysoPLD抑制性测定IC50值(nM)表示2-3次测量的平均值±标准偏差，并且IC50值中的“>1000”意指在多至1000nM的浓度范围内没有发现抑制活性。从表6所示的结果，表明自分泌运动因子适体强烈抑制自分泌运动因子的溶血磷脂酶D活性。另一方面，使用40N阴性对照核酸库和低分子自分泌运动因子抑制剂S32836(SIGMA)进行相似的实验。然而，没有发现抑制活性。SEQ ID NO:12(149)显示如下。
SEQ ID NO:12(149):(SEQ ID NO:12(135)所示的适体的序列，其中从一个位点去除P-甲基)
idT-CCTGGjAC(M)GjG(M)AACjCA(M)G(M)AjATA(M)C(M)TjTTjTGGTCjTCjCjA(M)G(M)G(M)j-idT
[表6]
SEQ ID NO: LysoPLD抑制性测定IC50值(nM)
12(144) 1.6±0.2
12(149) 6.1±2.8
40N >1000
S32826 >1000
实施例9：适体的修饰
在实施例5中，制备其中仅有一个位点被P-甲基-修饰的改变的形式，并且在LPA产生抑制实验中证实抑制活性。结果，发现通过向SEQ ID NO:12(24)所示的适体的第12个C和第13个C之间的磷酸基团应用P-甲基-修饰，改善了活性。由于第12个C和第13个C是共有序列的一部分，因此，假定甲基直接与自分泌运动因子反应，以改善抑制活性。因此，研究引入大于甲基并且具有高疏水性的官能团是否进一步改善抑制活性。
通过化学合成制备SEQ ID NO:12(24)所示的适体，其中在第12个C和第13个C之前的磷酸基团被修饰。其序列显示在SEQ ID NOs:12(150)-12(152)中。除非另外指明，各种序列为以5’至3’方向显示的脱氧核糖核苷酸。核苷酸中的括号表示在2’-位的修饰，M表示甲氧基。CαC、CβC和CγC表示磷酸结构部分的修饰，并且分别表示P-异丙氧基化、P-丙氧基化和P-丁氧基化(见下述结构式)。末端修饰中的idT表示反向-dT。
P-异丙氧基核苷酸
P-丙氧基核苷酸
P-丁丙氧基核苷酸
SEQ ID NO:12(150):SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中在第12个C与第13个C之间的磷酸基团被P-异丙氧基取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACαCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(151):SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中在第12个C与第13个C之间的磷酸基团被P-丙氧基取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACβCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
SEQ ID NO:12(152):SEQ ID NO:12(24)所示的适体的序列，其中在第12个C与第13个C之间的磷酸基团被P-丁氧基取代)
idT-CCTGGAC(M)GG(M)AACγCA(M)G(M)AATA(M)C(M)TTTTGGTCTCCA(M)G(M)G(M)-idT
通过与实施例1相似的NPP2测定，研究SEQ ID NOs:12(150)-12(152)的适体是否表现出自分泌运动因子抑制活性。其IC50值显示在表7中。结果，这些适体表现出由不超过1nM的IC50值所证明的高抑制活性。
[表7]
针对自分泌运动因子的NPP2抑制活性(IC50值)
SEQ ID NO: LysoPLD抑制性测定IC50值(nM)
12(150) 0.17±0.0013
12(151) 0.32±0.0021
12(152) 0.23±0.013
IC50值表示2-3次测量的平均值±标准偏差。
[工业适用性]
本发明的适体或复合物可以用作用于诸如纤维化的疾病的药物、或诊断剂或试剂。本发明的适体和复合物还可以用于自分泌运动因子的纯化和浓缩、自分泌运动因子的标记以及自分泌运动因子的检测和定量。
本申请是基于在日本提交的专利申请号2014-067289(申请日期：2014年3月27日)，其内容完整地结合在本文中。

Claims (22)

1.结合自分泌运动因子的适体，其包含由下式(I)所示的核苷酸序列：
CGGAACC-N1-GGTC (I)
其中N1表示任意的3-11个核苷酸。
2.结合自分泌运动因子的适体，其包含由下式(II)所示的核苷酸序列：
X3X1CGGAACC-N1-GGTCX2X4 (II)
其中N1表示任意的7-11个核苷酸，X1、X2、X3和X4分别是任意的核苷酸，并且X1与X2和X3与X4中的至少一对形成沃森-克里克碱基对。
3.根据权利要求2所述的适体，其中X1是A，X2是T，X3是G，并且X4是C。
4.结合自分泌运动因子的适体，其包含下述(a)、(b)或(c)所示的核苷酸序列：
(a)选自SEQ ID NOs:4–14、16、20–25、27和29的核苷酸序列；
(b)选自SEQ ID NOs:4–14、16、20–25、27和29的核苷酸序列，其中，在CGGAACC-N1-GGTC中，其中N1表示任意的3-11个核苷酸，除CGGAACC和GGTC所示的序列之外的一个或多个核苷酸被取代、缺失、插入或添加；或
(c)与选自SEQ ID NOs:4–14、16、20–25、27和29的核苷酸序列具有不少于70％的同一性的核苷酸序列(排除CGGAACC-N1-GGTC中由CGGAACC和GGTC所示的序列，其中N1如上述定义)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的适体，其中N1是AGAATACTTTT所示的核苷酸。
6.结合自分泌运动因子的适体，其具有下式(IV)所示的潜在的二级结构：
其中X1、X2、X3和X4分别是任意的核苷酸，并且X1与X2和X3与X4中的至少一对形成沃森-克里克碱基对。
7.根据权利要求6所述的适体，其中X1是A，X2是T，X3是G，并且X4是C。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的适体，其具有不少于30的碱基长度。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的适体，其中各个核苷酸的脱氧核糖的2’-位的氢原子是相同的或不同的并且是未取代的或被选自由氟原子和甲氧基组成的组的原子或基团取代。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的适体，其中包含在所述适体中的磷酸基团是相同的或不同的并且分别是未取代的或是P-烷基化的或P-烷氧基化的。
11.结合自分泌运动因子的适体，其包含下式(I)所示的核苷酸序列：
CGGAACC-N1-GGTC (I)
其中N1表示任意的3-11个核苷酸，并且
向所述核苷酸序列的C与C之间的磷酸基团中引入疏水基团。
12.根据权利要求11所述的适体，其中上述疏水基团是烷基或烷氧基。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的适体，其中至少一个核苷酸是被修饰的。
14.根据权利要求13所述的适体，其被反向dT或聚乙二醇修饰。
15.根据权利要求14所述的适体，其中所述反向dT或聚乙二醇结合所述适体的5’-端或3’-端。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的适体，其中包含在所述适体中的至少一个磷酸基团被硫代磷酸化或二硫代磷酸化。
17.包含权利要求1-16中任一项的适体和功能性物质的复合物。
18.根据权利要求17所述的复合物，其中述功能性物质是亲和性物质、标记物质、酶、药物、毒素或药物递送载体。
19.包含权利要求1-16中任一项的适体或权利要求17或18的复合物的药物。
20.包含权利要求1-16中任一项的适体或权利要求17或18的复合物的抗纤维化剂。
21.自分泌运动因子检测探针，其包含权利要求1-16中任一项的适体或权利要求17或18的复合物。
22.自分泌运动因子的检测方法，其包括使用权利要求1-16中任一项的适体或权利要求17或18的复合物。
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