CN106153792A

CN106153792A - 一种香加皮的指纹图谱及其质量检测方法

Info

Publication number: CN106153792A
Application number: CN201510128555.9A
Authority: CN
Inventors: 鄂秀辉; 李丽; 何毅; 宋兆辉
Original assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: TIANJIN TASLY MODERN TCM RESOURCES CO Ltd; Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2015-03-23
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2035-03-23
Also published as: CN106153792B

Abstract

本发明涉及一种香加皮的有效成分测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备：称取绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品，加甲醇制得混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：取香加皮干燥粉碎，过筛，精密称取，加入甲醇溶液，提取20-50min，放冷，离心，取上清液，即得供试品溶液；(3)测定法：吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中相应成分的含量。

Description

一种香加皮的指纹图谱及其质量检测方法

技术领域：

本发明涉及一种中药的检测方法，特别涉及一种中药香加皮的指纹图谱的建立及有关成分的含量测定方法

背景技术：

香加皮为萝摩科植物杠柳Periploca sepium Bge.的干燥根皮，辛、苦，温；有毒。归肝、肾、心经。具有利水消肿，祛风湿，强筋骨之功效，目前临床上也常用于治疗慢性心衰。香加皮原植物杠柳为野生，未有规范种植基地，药材质量很难控制，其中所含强心苷类物质(杠柳毒苷等)既为有效成分，又为有毒成分，临床应用中亦常出现中毒现象。2010版《中国药典》只对4-甲氧基水杨醛进行了含量测定，指标单一，难以控制香加皮的整体质量。但香加皮在应用中存在着混用严重，误用、过量或长期服用均易产生中毒现象，存在安全隐患。

毒性未受重视。香加皮具有多种药理作用，近年来，香加皮作为传统中药常用于治疗慢性充血性心衰，但在用药中常见不良反应和致死性病例的报道，这与其自身毒性有关。2010版中国药典中虽注明香加皮有毒，但其含量测定项下只有4-甲氧基水杨醛一个指标，此成分是香加皮的主要香气成分，无法代表香加皮的药效和毒性，因此不能对香加皮的质量进行有效控制。近年来，香加皮作为传统中药治疗慢性充血性心衰有其独特优势，目前应用也越来越多，但强心苷安全窗小，药材含量波动大，作用强，一直以来频有中毒现象发生。香加皮的安全监管势在必行。

有毒成分波动大。香加皮原植物杠柳多生于山野、河边、砂质地，采收期为春、秋两季，主产地为山东、山西、河北、河南4省，其中以山西、河南产量最大，此外四川、甘肃、湖南、辽宁、吉林、江苏等地亦有产。产地分布范围大，采收期也有春、秋之别，使得香加皮药材中各成分差异大，质量波动不稳定。

近年来，关于香加皮质控的文献有：同时测定4-甲氧基水杨醛和杠柳毒苷，同时测定4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷和异香草醛。同时测定香加皮中以4-甲氧基水杨醛、绿原酸和杠柳毒苷的含量未报道过。目前对于指纹图谱的研究仅有李丹毅进行了香加皮HPLC指纹图谱研究，针对香加皮化学成分、质量标准等方面的研究多为单一成分为指标的含量测定分析，李丹毅等开展了香加皮指纹图谱的研究，但所建立的HPLC指纹图谱检测时间为80分钟，分析耗时长，损耗试剂多，不利于进行多批次样本的分析。

因此，急需建立一种检测更加全面、更快速的香加皮质量评价方法。

发明内容：

本发明提供一种香加皮有效成分的测定方法、超高液相指纹图谱的建立方法以及采用此方法得到的超高效液相标准对照指纹图谱。

根据本发明所提供的香加皮的有效成分测定方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

称取绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品，加甲醇制得混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备

取香加皮干燥粉碎，过筛，精密称取，加入甲醇溶液，提取20-50min，放冷，离心，取上清液，即得供试品溶液；

(3)测定法：

吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中相应成分的含量。

其中，超高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱选自：C18色谱柱，

流动相：0.1％-1％磷酸水溶液-甲醇流动相，进行梯度洗脱，流动相的流速为0.1-0.5mL/min，柱温30-40℃，

检测波长：220-230nm。

根据本发明的测定方法，步骤(1)中混合对照品溶液中绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷的浓度范围分别为0.332mg·L^-1-33.2mg·L^-1、1.61mg·L^-1-161.1mg·L^-1、0.968mg·L^-1-96.8mg·L^-1。

本发明最优选的对照品溶液的制备方法为：分别取绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品适量，精密称定，甲醇溶解，摇匀，制成质量浓度分别为33.2mg·L^-1、161.1mg·L^-1、96.80mg·L^-1的混合对照品贮备液，存贮于4℃冰箱中备用。精密量取混合对照品贮备溶液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为含量测定用混合对照溶液，绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷质量浓度分别为16.62mg·L^-1、8.05mg·L^-1、4.84mg·L^-1，存贮于4℃冰箱中备用。

根据本发明，流动相为0.1％磷酸水溶液-甲醇，梯度程序如下：

根据本发明的实施方式之一，梯度程序优选为：0～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇；13～19min,57％～90％甲醇；19～20min,90％甲醇。

根据本发明的另一实施方式，梯度程序可以为：

根据本发明的测定方法，所述步骤(3)中溶液的进样量可以为0.5-2μL。

根据本发明，最优选的色谱条件为：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流动相0.1％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱：0～3min,10％～25％B；3～8min,25％～37％B；8～11.5min,37％～45％B；11.5～13min,45％～57％B；13～19min,57％～90％B；19～20min,90％B。流速0.3mL·min^-1；检测波长220nm；柱温35℃；进样量1μL。3种成分的理论塔板数均不低于6000，此色谱条件检测时间短，信息量丰富，亦用于指纹图谱的分析，对照品及样品图谱见附图1。

根据本发明的测定方法，所述步骤(2)中提取方法可以为超声提取、回流提取或索氏提取。

根据本发明所提供的方法，步骤(2)中香加皮的称样量为0.125g-1.000g。

根据本发明，最优选的供试品溶液的制备方法为：样品干燥粉碎，分别取各样品粉末(过三号筛)0.25g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入30％甲醇溶液20mL，超声提取40min(功率500W，频率40kHz，水温在25℃以下)，放冷，30％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，取适量至离心管中，于15000r·min^-1下高速离心10min，取上清液，即得。

供试品的提取时间会影响最终图谱的出峰情况，40min的出峰个数最多，信息丰富，而提取时间低于10min则提取不完全。因此，在步骤(2)中最优选的提取时间为40min。

根据本发明的测定方法，采用该方法得到的指纹图谱相对保留时间为：

本发明的另一目的是提供一种香加皮超高液相指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

分别取绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品，加甲醇溶解制成质量浓度分别为0.332mg·L^-1-33.2mg·L^-1、1.61mg·L^-1-161.1mg·L^-1、0.968mg·L^-1-96.8mg·L^-1的混合对照品贮备液。

(2)供试品溶液的制备

取香加皮干燥粉碎，过筛，精密称取，加入30％甲醇溶液，采用超声提取、回流提取或者索氏提取40min，放冷，离心，取上清液，即得供试品溶液。

(3)获得色谱图

以对照品溶液作为参照物，将供试品溶液和对照品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，

其中，所述超高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱选自：C18色谱柱，

流动相：0.1％磷酸水溶液-甲醇流动相，进行梯度洗脱。梯度程序为0～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇；13～19min,57％～90％甲醇；19～20min,90％甲醇。流动相的流速为0.3mL/min，柱温35℃。

检测波长：220nm。

香加皮药材的UPLC图参见附图1。

(4)生成对照指纹图谱：

选择合格的多批香加皮样品的指纹图谱，以绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷峰为参比峰，得到17个共有峰的图谱，(参见附图2)按中位数法计算生成标准对照指纹图谱(参见附图3)，其中，指纹图谱相对保留时间为：

本发明优选的方法、色谱条件和溶剂提取方法，是经过筛选得到的，筛选过程如下：

1仪器与试药

1.1仪器超高效液相色谱系统(ACQUITY UPLC，美国Waters公司，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、TUV检测器、Empower2工作站)，电子天平(XS205，瑞士METTLER TOLEDO公司)，粉碎机(MF10，德国IKA公司)，高速冷冻离心机(ST16R，美国Thermo公司)，Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)，超声波清洗器(KQ-500DV，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2药品与试剂杠柳毒苷(批号111793-200901，纯度93.8％)，4-甲氧基水杨醛(批号110790-201303，纯度98.8％)，绿原酸(批号110753-201314，纯度96.6％)对照品均来源于中国食品药品检定研究院。甲醇(色谱纯，德国Merck公司)，磷酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，超纯水(Milli-Q制备)。

1.3药材样本采集 30批不同来源的香加皮药材均为春季野生采集，样品经中国药科大学中药学院秦民坚教授鉴定，均为萝摩科植物杠柳Periploca sepium Bge.的干燥根皮。药材详细信息见表1。

表1 30批香加皮药材样品信息

3结果

3.1香加皮3种成分含量测定

3.1.1线性关系考察分别精密吸取混合标准品贮备液0.1，0.5，1，2，4，5，6，8mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别将此8种对照品溶液及混合对照贮备液，按2.1项下色谱条件进样分析，进样量均为1μL，测定峰面积。结果以峰面积Y为纵坐标，对照品溶液质量浓度X(mg·L^-1)为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程和线性范围，结果见表2，各成分在各自浓度范围内线性关系良好。

3.1.2定量限与检测限将对照品溶液逐级稀释后，按2.1项下色谱条件进样分析，信噪比(S/N)为3时的质量浓度(mg.L^-1)为检测限(LOD)，信噪比(S/N)为10时的质量浓度(mg.L^-1)为定量限(LOQ)，结果见表2。

表2 3种成分的标准曲线、定量限、检测限

3.1.3精密度试验分别精密吸取混合对照品溶液1μL，在2.1项色谱条件下重复进样6次，以峰面积为指标计算3种成分的RSD(n＝6)，考察精密度。4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷的RSD值分别为1.1％，1.0％，1.7％，仪器精密度良好。

3.1.4重复性试验按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液(样品H1)，2.1项下色谱条件进样分析，以3种成分含量为指标计算RSD，考察方法的重复性。绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷的RSD值分别为0.9％，1.3％，1.9％，重复性良好。

3.1.5稳定性按2.2.2项下方法制备供试品溶液(样本H1)，室温放置，按

2.1项下色谱条件分别在0,1,2,4,8,12,18,24h进样分析，以峰面积值为指标计算3种成分的RSD，考察稳定性。绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷的RSD值分别为1.7％，1.1％，1.5％，表明样品24h内稳定性良好。

3.1.6加样回收率试验取已知含量(样本H1)的香加皮药材样品6份，每份0.125g，精密称定，置于25mL容量瓶中，分别精密加入对照品溶液适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，2.2项下色谱条件进样分析，计算3种成分的加样回收率。绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷平均回收率分别为96.78％，96.49％，99.01％；RSD分别为1.16％，1.24％，1.36％。

3.1.7样品的含量测定按2.2.2项下方法制备30批供试品溶液，按2.2项下色谱条件分别测定30批香加皮样品中绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷的含量，结果见表3。

表3 30批香加皮中3种成分的质量分数(n＝2)

mg.g^-1

注：1.绿原酸；2. 4-甲氧基水杨醛；3.杠柳毒苷。

3.2香加皮的指纹图谱研究

从香加皮的UPLC图可见，香加皮所含成分复杂，受对照品等因素限制，前文中仅对含量较高的绿原酸、4-甲氧基水杨醛和毒性成分杠柳毒苷3种成分进行了含量测定。但仅用几种成分来控制药材质量较片面，香加皮药材中其他成分同样有可能对药材质量产生不同程度的影响。故本发明进一步建立了香加皮的UPLC指纹图谱。

3.2.1指纹图谱方法学

3.2.1.1精密度按2.2.2项下方法制备供试品溶液(样本H1)，按2.1项下色谱条件连续进样6次，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD<0.4％，相对峰面积RSD<2.3％。表明仪器稳定，精密度良好。

3.2.1.2重复性按2.2.2项方法平行制备供试品溶液(样本H1)6份，按2.1

项下色谱条件进样分析，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD<0.5％，相对峰面积RSD<2.6％。表明该方法重复性良好。

3.2.1.3稳定性按2.2.2项方法制备供试品溶液(样本H1)，按2.1项下色谱条件，分别在0,2,4,6,12,24h测定其指纹图谱，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD<1.3％，相对峰面积RSD<2.4％。表明供试品溶液在24h内基本稳定。

3.2.2指纹图谱测定按2.2.2项下方法制备供试品溶液，2.1项下色谱条件测定，记录30批香加皮样品的色谱图(图2)，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对香加皮指纹图谱进行数据处理，确定共有峰17个，生成对照指纹图谱(图3)，各产地香加皮药材指纹图谱与对照指纹图谱比对，相似度结果见表4。

表4 30批香加皮药材UPLC指纹图谱共有峰的相似度

4指纹图谱结合成分含量的质量对比分析

4.1直观分析分析表3中数据发现，河南省与山西省样品中3个成分均有不同程度的差异，其中杠柳毒苷在2省中的差异尤为明显，RSD相差2倍以上，说明与河南省相比，山西省杠柳毒苷含量差异较小，毒性成分含量较稳定，安全性较高。分析表4中数据，同样发现与河南相比，山西省样品相似度数据较集中，说明基于指纹图谱数据直观分析，山西省香加皮质量较均一。

4.2显著性差异分析为了更客观地分析4个指标(绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷和相似度)在河南省、山西省之间的差异，采用SPSS 19.0统计软件，对两个省中的4个指标进行了统计学显著性差异分析。4个指标不能同时满足正态分布(Shapiro-Wilk test)和方差齐次(Levene’s test)，均采取非参数检验(Kolmogorov-Smirnov test)，显著性水平为0.05。结果显示，杠柳毒苷含量在河南、山西省间有显著性差异，其余3个指标无显著性差异，与直观分析结果一致。《中国药典》2010年版规定香加皮的含测指标只有4-甲氧基水杨醛，而上述分析发现，仅此一种成分无法有效反映和控制香加皮的真实质量和毒性。为了验证已建立的香加皮质量评价方法，同时进一步说明2省香加皮的内在品质差异，本发明运用多种统计学方法对数据进行分析，确保结果准确可靠。

4.3系统聚类分析以表3中30份样品的3种成分含量、各成分含量比值和表4相似度为变量，采用SPSS 19.0统计软件对样品进行聚类分析。采用利差平方和法(Ward法)，以欧式距离平方(Squared euclidean distance)作为样品测度，聚类树状图见图4。

由系统聚类树状图可以看出，30批香加皮样品被分为两类，与样品原产地基本一致。表明两产区香加皮基于3种成分(绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷)及相似度的综合评价数据有差异，此评价方法可用于香加皮药材的质量评价及比较。

4.4主成分分析在聚类分析的基础上，对原变量进行主成分分析。提取2个主成分PC1和PC2，累计贡献率为72.69％，其中PC1贡献38.51％，PC2贡献34.17％。PC1主要反映了绿原酸、相似度、绿原酸与4-甲氧基水杨醛的含量比。PC2主要反映了4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷、4-甲氧基水杨醛与杠柳毒苷的含量比、杠柳毒苷与绿原酸的含量比。基本可以说明各指标的所有信息。根据两主成分(PC1、PC2)的得分系数，计算每个样本PC1、PC2的得分变量值，并绘出PC1、PC2得分变量的散点图，见图5。

从图5中可以看出，30个样品被分为2组，与聚类分析结果一致。同时由图可知，与河南省相比，山西省样本分布较集中，与直观分析结果一致，进一步说明山西省香加皮质量较均一。

本发明运用UPLC同时测定香加皮中3种成分，并建立了香加皮UPLC指纹图谱。检测成分在20min内即可达到较好分离和测定，较HPLC指纹图谱的80min，大大缩短了分析时间，且信息量大，可同时进行成分定量及指纹图谱研究，对于大样本量的分析更有优势，因此更适合工业化大生产的检测。

在流动相的选择上，加入磷酸可以改善拖尾，且酸性条件下可见峰个数明显增加，信息更丰富。因乙腈洗脱能力较强，乙腈-磷酸水体系对极性差异小的成分间分离效果不理想，故本发明尝试采用甲醇-磷酸水进行梯度洗脱，结果显示分离效果明显提高。考察不同酸浓度及两相比例，最终确定甲醇-0.1％磷酸水为最佳流动相进行梯度洗脱。

本发明在多样本量的基础上，分析了产量较高的山西、河南产香加皮中3种成分的变化，通过统计学对比，发现杠柳毒苷含量在两省中有显著性差异。由于杠柳毒苷具有强心作用，同时又为毒性成分，所得数据可为临床正确安全地选用香加皮提供一定参考依据。30批样品的UPLC指纹图谱，除H3、H11以外，相似度均在0.9以上，说明从指纹图谱角度看，2省香加皮药材质量有差异也有共性，指纹图谱可用于香加皮的质量研究，但单独使用在阐明差异方面尚显不足。综合以上两方面，建立“指纹图谱+多成分含量测定”评价方法，运用聚类分析(HCA)和主成份分析(PCA)综合多方面信息系统探讨2省香加皮质量的差异，验证本发明评价方法的可行性。聚类分析将30个供试品分成了2大类，与生药学鉴定结果基本一致，同时主成份分析也进一步精确验证了此分类结果，且可直观看出，山西省较河南省质量分布更集中，较稳定。

UPLC“指纹图谱+多成分含量测定”评价方法说明了两省香加皮药材质量有差异，通过本发明可以为香加皮的产地选择、临床应用及质量快速评价提供参考指导作用。在此基础上，若将药效、毒性与物质基础结合起来，深入开展谱效学研究，则更有利于阐明中药作用机制，为完善香加皮的质量评价体系，确保用药安全提供进一步保障。

本发明运用UPLC同时测定香加皮中3种成分，并建立了香加皮UPLC指纹图谱。检测成分在20min内即可达到较好分离和测定，较HPLC指纹图谱的80min，大大缩短了分析时间，且信息量大，可同时进行成分定量及指纹图谱研究，对于大样本量的分析更有优势。

在流动相的选择上，加入磷酸可以改善拖尾，且酸性条件下可见峰个数明显增加，信息更丰富。因乙腈洗脱能力较强，乙腈-磷酸水体系对极性差异小的成分间分离效果不理想，故本发明尝试采用甲醇-磷酸水进行梯度洗脱，结果显示分离效果明显提高。考察不同酸浓度及两相比例，最终确定甲醇-0.1％磷酸水为流动相进行梯度洗脱。

附图说明

图1香加皮药材的UPLC图

A.对照品；B.样品；峰1.绿原酸；峰2.4-甲氧基水杨醛；峰3.杠柳毒苷。图230批香加皮的UPLC指纹图谱

图3香加皮的对照指纹图谱

图4河南省、山西省香加皮系统聚类分析

图5样品主成分得分变量散点图

图6根据本发明实施例1所得色谱图

图7根据本发明实施例2所得色谱图

图8根据本发明实施例3所得色谱图

图9根据本发明实施例4所得色谱图

图10根据本发明实施例5所得色谱图

图11根据本发明实施例6所得色谱图

图12根据本发明实施例7所得色谱图

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

(1)对照品溶液制备

分别取绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品适量，精密称定，甲醇溶解，摇匀，制成质量浓度分别为33.24mg·L^-1、161.1mg·L^-1、96.80mg·L^-1的混合对照品贮备液，存贮于4℃冰箱中备用。精密量取混合对照品贮备溶液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为含量测定用混合对照溶液，绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷质量浓度分别为16.62mg·L^-1、8.05mg·L^-1、4.84mg·L^-1，存贮于4℃冰箱中备用。

(2)供试品溶液制备

香加皮样品(表1之S5号样品)干燥粉碎，分别取各样品粉末(过三号筛)0.25g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加入30％甲醇溶液20mL，30％甲醇提取40min(功率500W，频率40kHz，水温在25℃以下)，放冷，30％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，取适量至离心管中，于15000r·min^-1下高速离心10min，取上清液，即得。

(3)测定，生成对照指纹图谱

吸取混合对照品溶液和供试品溶液(S5)，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图(参见附图6)计算供试品中相应成分的含量(参见表5)。

表5

色谱条件为：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流动相0.1％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱程序见表6。流速0.3mL·min^-1；检测波长220nm；柱温35℃；进样量1μL。

表6

根据上述条件得到的指纹图谱相对保留时间参见表7。

表7

实施例2

(1)对照品溶液制备

同实施例1

(2)供试品溶液制备

香加皮样品为表1之H6号样品，其他部分同实施例1。

(3)测定，生成对照指纹图谱

吸取混合对照品溶液和供试品溶液(H6)，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图(参见附图7)计算供试品中相应成分的含量(参见表8)。

表8

色谱条件为：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流动相0.2％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱程序见表9。流速0.4mL·min^-1；检测波长225nm；柱温30℃；进样量0.5μL。

表9

根据上述条件得到的指纹图谱相对保留时间参见表10。

表10

实施例3

(1)对照品溶液制备

同实施例1

(2)供试品溶液制备

香加皮样品为表1之H4号样品，其他部分同实施例1。

(3)测定，生成对照指纹图谱

吸取混合对照品溶液和供试品溶液(H4)，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图(参见附图8)计算供试品中相应成分的含量(参见表11)。

表11

色谱条件为：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流动相0.3％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱程序见表12。流速0.4mL·min^-1；检测波长225nm；柱温33℃；进样量0.8μL。

表12

根据上述条件得到的指纹图谱相对保留时间参见表13。

表13

实施例4

(1)对照品溶液制备

同实施例1

(2)供试品溶液制备

香加皮样品为表1之H4号样品，其他部分同实施例1。

(3)测定，生成对照指纹图谱

吸取混合对照品溶液和供试品溶液(H4)，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图(参见附图9)计算供试品中相应成分的含量(参见表14)。

表14

色谱条件为：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流动相0.5％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱程序见表15。流速0.5mL·min^-1；检测波长230nm；柱温38℃；进样量1μL。

表15

根据上述条件得到的指纹图谱相对保留时间参见表16。

表16

实施例5

(1)对照品溶液制备

同实施例1

(2)供试品溶液制备

香加皮样品为表1之H2号样品，其他部分同实施例1。

(3)测定，生成对照指纹图谱

吸取混合对照品溶液和供试品溶液(H2)，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图(参见附图10)计算供试品中相应成分的含量(参见表17)。

表17

色谱条件为：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流动相1％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱程序见表18。流速0.2mL·min^-1；检测波长220nm；柱温40℃；进样量1.8μL。

表18

根据上述条件得到的指纹图谱相对保留时间参见表19。

表19

实施例6

(1)对照品溶液制备

同实施例1

(2)供试品溶液制备

香加皮样品为表1之H2号样品，其他部分同实施例1。

(3)测定，生成对照指纹图谱

吸取混合对照品溶液和供试品溶液(H2)，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图(参见附图11)计算供试品中相应成分的含量(参见表20)。

表20

色谱条件为：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流动相1％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱程序见表21。流速0.4mL·min^-1；检测波长230nm；柱温40℃；进样量2μL。

表21

根据上述条件得到的指纹图谱相对保留时间参见表22。

表22

实施例7

(1)对照品溶液制备

同实施例1

(2)供试品溶液制备

香加皮样品为表1之H2号样品，其他部分同实施例1。

(3)测定，生成对照指纹图谱

吸取混合对照品溶液和供试品溶液(H2)，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图(参见附图12)计算供试品中相应成分的含量(参见表23)。

表23

色谱条件为：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)。流动相0.4％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脱程序见表24。流速0.3mL·min^-1；检测波长220nm；柱温35℃；进样量1.5μL。

表24

根据上述条件得到的指纹图谱相对保留时间参见表25。

表25

Claims

1.一种香加皮的有效成分测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

(2)供试品溶液的制备

(3)测定法：

吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中相应成分的含量；

其中，所述超高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱选自：C18色谱柱，

检测波长：220-230nm。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，其中，步骤(1)中混合对照品溶液中绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷的浓度范围分别为0.332mg·L^-1-33.2mg·L^-1、1.61mg·L^-1-161.1mg·L^-1、0.968mg·L^-1-96.8mg·L^-1。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，流动相为0.1％磷酸水溶液-甲醇，梯度程序如下：

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，梯度程序如下：0～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇；13～19min,57％～90％甲醇；19～20min,90％甲醇。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，梯度程序如下：

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中，溶液的进样量为0.5-2μL。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中提取方法为超声提取、回流提取、索氏提取。

8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中香加皮的称样量为0.125g-1.000g。

9.根据权利要求1所述的测定方法，采用该方法得到的指纹图谱相对保留时间为：

10.一种香加皮超高液相指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

分别取绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷对照品，加甲醇溶解制成质量浓度分别为0.332mg·L^-1-33.2mg·L^-1、1.61mg·L^-1-161.1mg·L^-1、0.968mg·L^-1-96.8mg·L^-1的混合对照品贮备液；

(2)供试品溶液的制备

取香加皮干燥粉碎，过筛，精密称取，加入30％甲醇溶液，采用超声提取、回流提取或者索氏提取40min，放冷，离心，取上清液，即得供试品溶液；

(3)获得色谱图

其中，所述超高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱选自：C18色谱柱，

流动相：0.1％磷酸水溶液-甲醇流动相，进行梯度洗脱，梯度程序为0～3min,10％～25％甲醇；3～8min,25％～37％甲醇；8～11.5min,37％～45％甲醇；11.5～13min,45％～57％甲醇；13～19min,57％～90％甲醇；19～20min,90％甲醇；流动相的流速为0.3mL/min，柱温35℃，

检测波长：220nm；

(4)生成对照指纹图谱：

选择合格的多批香加皮样品的指纹图谱，以绿原酸、4-甲氧基水杨醛、杠柳毒苷峰为参比峰，得到17个共有峰的图谱，按中位数法计算生成标准对照指纹图谱，其中，指纹图谱相对保留时间为：