CN106153762B - 一种鉴定指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法，具体涉及一种基于微波辅助提取技术和液相色谱串联质谱技术快速鉴定指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法。解决了现有鉴定精麻药物的方法中存在的样品局限性问题，提供一种新的思路。该方法开创性的在常压下利用微波进行辅助，提取固化/硬质生物检材中痕量抗精神分裂症用药体内分析标志物，并利用液相色谱串联质谱技术进行复核国际与欧盟标准的确证分析，方法反应条件温和，总释放效率高，精密度高，特异性强，选择性强；并且本发明方法，无需过夜，无需特殊设备，耗时短，简便快速。

Description

一种鉴定指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法
技术领域
本发明涉及一种鉴定的方法，具体涉及一种鉴定指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法，尤其涉及一种基于微波辅助提取技术和液相色谱串联质谱技术快速鉴定指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法。
背景技术
近年来，在国家食药监局、卫生行政部门和公安机关的合力管控下，麻醉药品和精神药品的生产、销售、使用环节得到有力监控，2014年《国家药物滥用监测年度报告》数据显示，医疗用麻醉药品、精神药品滥用情况均处在下降趋势。然而，游离于国家管制的精麻药品之外的新精神活性物质(如抗精神分裂症用药)对公共健康构成了一定的现实威胁，此类药物在法律层面上讲不属于毒品范畴，却能够影响人的思维、情感和意志等心理过程，继而改变个体的行为及活动，长期服用会产生耐药性和依赖性，过量使用易引起中毒，严重者导致死亡。在涉及药物辅助犯罪如麻醉抢劫、迷奸案件时，常需对所涉药物进行认定，药物在体内代谢快，而此类案件中，受害人往往报案间隔长，到案时药物的血、尿浓度常不能检出而无法提供有价值的信息。因此，解决这一难题的唯一途径可通过富角蛋白检材分析，检测指甲或毛发中常见的抗精神分裂症用药体内分析标志物，提供精麻药物的滥用、非法使用的证据。
富角蛋白检材是目前法庭科学领域的新型生物样品，泛指指甲或毛发这种生物硬质检材，其取材方便无创、易保存运输、目标物稳定、检测时限长，能反映较长摄药史等优点使其成为摄毒、涉药案件的热门检材和研究焦点，具有广阔的应用前景。目前对于指甲样品中的药物提取方法主要为化学手段(如酸水解、碱消化、醇浸提)。根据实验室之前对指甲释放效率的研究，化学手段在指甲分析中存在反应条件剧烈、总释放效率低、方法精密度差等缺点，不适用于指甲这种硬质检材的分析。本实验室跳过化学法处理生物检材的思维定势，首创物理法(冷冻研磨联合超声浴技术，已获专利ZL201210007109.9)分析指甲中的用药相关标志物。通过始终处于-196℃的冷冻研磨技术，保证用药相关标志物在提取过程中不被破坏或分解，并利用粉碎后的微米级指甲粒径，从细胞水平增加了硬质生物检材与提取剂的接触面积，有效提高指甲中用药相关标志物的分析效能、准确度及精密度。但冷冻研磨联合超声浴技术耗时长(>3小时)，需要特殊设备(如抗超低温研磨管、恒定频率超声浴装置)，成本较高(冷冻时需要用到大量液氮)。
微波辅助提取技术是一种利用微波自有的穿透性、选择加热特性、非电离性、极低的热惯性等特殊性质进行小分子提取的新技术，并逐渐成为近年来样品前处理的热点技术。在微波场中，对微波吸收能力的差异，使基质中的待提取物从基质中分离，并进入介电常数低于基质的提取剂中。对生物基质而言，微波能会打开并破坏细胞结构，以离子迁移和偶极子转动而引起分子运动的形式将其中的小分子释放出来。
尽管微波辅助提取技术已在生物检材分析中有所应用，但由于提取剂受热后会转化为气相，使得提取装置内压力增大，故生物检材的微波辅助提取技术通常需要耐高压设备；同时提取剂往往不能直接分析，需增设二次提取步骤，间接降低了提取效能，增加了方法的不确定度。本专利方法不同于其他提取技术，采用含特定缓冲盐的水基质为释放剂/提取剂，在常压下进行微波加热，无需特殊耐压装置，集释放、提取于一体，提取后可直接进样分析，运用于富角蛋白检材中能有效减少预处理时间和有机溶剂的使用量；此外，微波加热的特点大大避免了样品局部受热的不均匀性，从而降低药物分解概率，同时提高指甲中药物的释放效率。
发明内容
本发明为了解决现有鉴定精麻药物的方法中存在的样品局限性问题，提供一种基于微波辅助提取和液相色谱串联质谱技术的快速分析指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法。待分析检测的抗精神分裂症用药体内分析标志物分别为喹硫平、7-羟基喹硫平、氯氮平、去甲氯氮平、氟哌啶醇、阿立哌唑、脱氢阿立哌唑、艾司唑仑、三唑仑、α-羟基三唑仑、阿普唑仑、羟基阿普唑仑、地西泮、去甲地西泮、硝西泮、7-氨基硝西泮、氯硝西泮、7-氨基氯硝西泮、唑吡坦、多虑平、阿米替林、卡马西平等。该方法可简便、快速地从指甲基质中提取抗精神分裂症用药体内分析标志物，满足法医毒物分析领域摄毒、涉药相关案件的鉴定和侦破的需要。
为了实现上述目的本发明提供一种鉴定指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法，包括以下步骤：
步骤1：将待检测指甲和氘代内标溶液一同置于聚四氟乙烯离心管内，用微波炉进行微波加热处理；
步骤2：往步骤1处理得到的混合物中加入分析改性剂后，进行涡旋、离心分离处理，得到不含指甲基质的上层清液；
步骤3：对步骤2中得到的上层清液进行液相色谱-串联质谱分析，对待检测指甲中的抗精神分裂症用药体内分析标志物进行确证。
在上述提供的方法中，其中所述的方法还包括对指甲鉴定前的脱污染处理，所述脱污染处理包括对指甲依次用去离子水和丙酮浸洗各两次。指甲在各浸洗液中浸洗时间一般各为2～3min。
在上述提供的方法中，其中所述的微波辅助提取的时间控制在3-5min，提取两次，微波功率为450-800W。优选地，微波加热处理时间为3min，微波功率为700W。
优选地，上述步骤2中分析改性剂为甲醇。
本发明另一方面提供一种鉴定指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法在鉴定精麻药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种鉴定指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法，该方法开创性的在常压下利用微波进行辅助，提取固化/硬质生物检材中痕量抗精神分裂症用药体内分析标志物，并利用液相色谱串联质谱技术进行符合国际与欧盟标准的确证分析，方法反应条件温和，总释放效率高，精密度高，特异性强，选择性强；并且本发明方法，无需过夜，无需特殊设备，耗时短，简便快速。
附图说明
图1是微波辅助提取处理前指甲的激光显微-表面形貌3D图。
图2是微波辅助提取处理后指甲的激光显微-表面形貌3D图。
图3是微波辅助提取处理前指甲的扫描电子显微镜图。
图4是微波辅助提取处理后指甲的扫描电子显微镜图。
图5是微波辅助提取-液相色谱-串联质谱法的总离子流色谱图。
图6是对照实验中碱消化提取法的总离子流色谱图及部分抗精神分裂症用药体内分析标志物的抽离子色谱图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的方法做进一步说明，以便更好理解本发明创造的内容，但实施例的内容并不限制本发明创造要求保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种快速鉴定指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法，先将待检测指甲和内标氯氮平-d4一同置于eppendorf离心管内进行微波加热处理；将微波处理后得到的混合物加入甲醇，涡旋，并进行离心分离；取离心分离后混合物的上层清液，对上层清液进行液相色谱-串联质谱分析。具体步骤如下：
1)样品预处理
对于摄毒、药物者指甲处理前须进行有机溶剂脱污染预处理。
对指甲的预处理按以下步骤进行：将指甲样品用5mL去离子水洗涤三次，每次3分钟；再用5mL丙酮溶液清洗两次，每次2分钟。预处理过的指甲，在自然晾干后剪成细小碎片，待鉴定使用。将微波辅助提取前的指甲样品取其中两份，一份进行激光显微-表面形态分析，另一份喷金后，进行扫描电镜，并记录下扫描电子显微镜图。
2)抗精神分裂症用药体内分析标志物的提取
本实施例中采取微波辅助提取法提取指甲中的衡量抗精神分裂症用药体内分析标志物。
步骤具体为：取剪碎后的指甲样品，准确称取20mg，置于eppendorf离心管中，加入内标氯氮平-d4100μL，置于微波炉，700W加热处理两次，每次3分钟，中间间隔5分钟以使体系冷却。取出后静置恢复至室温，加入400μL甲醇，涡旋，12000r/min离心30s。取上清液200μL直接进样。微波辅助提取后，指甲结构被破坏，指甲中的分析物得以释放出来。取微波辅助提取后的指甲两份，一份进行激光显微-表面形态分析，另一份喷金后，进行扫描电镜，并记录下扫描电子显微镜图。
3)液相色谱-串联质谱分析
本实施例中液相色谱和串联质谱反应条件如下：
a.液相色谱条件
色谱柱：ResteckAllure PFPP五氟苯基柱(100mm×2.1mm，5μm)，前接ZorbaxExtend-C18Narrow-bore保护柱(2.1×12.5mm，5μm)。流动相由20mmol/L乙酸铵缓冲液(A)与含20mmol/L乙酸铵的甲醇溶液(B)所组成，流动相A和B组分的体积比在0～1min之间为40:60，在1～1.5min之间为40:60变至15:85，在1.5～4.5min之间为15:85，在4.5～5min之间为15:85变至5:95，在5～7.5min之间为5:95，在7.5～9min之间为5:95变至40:60；流速：0.4mL/min；进样量：10μL。
b.串联质谱条件
电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式/ESI+，采用多反应监测模式/MRM检测。离子喷雾电压(IS)：5kV；碰撞气氮气(CAD)：5psi(1psi≈6.9kPa)，气帘气(CUR)：30psi；雾化气(GS1)：40psi，辅助气(GS2)：60psi；离子源温度(TEM)：500℃。
各化合物的质谱参数见表1，选用两对母离子/子离子对进行定性分析，其中第一对离子对用于定量分析。微波辅助提取-液相色谱-串联质谱法的总离子流图如附图5所示。
表1液相色谱-串联质谱参数
实施例2
采用美容指甲钳沿服药患者指甲边缘剪下后，保存于洁净干燥的牛皮纸包中，于室温下避光保存。指甲样品用5mL去离子水洗涤三次，每次3分钟；再用5mL丙酮溶液清洗两次，每次2分钟。室温下晾干。将预处理过的指甲剪成细小碎片。取指甲碎片样品，准确称取20mg，置于eppendorf管中，加入内标氯氮平-d4100μL，置于微波炉，700W加热处理两次，每次3分钟，中间间隔5分钟以使体系冷却。取出后静置恢复至室温，加入400μL甲醇，涡旋，12000r/min离心30s。取上清液200μL直接进样。将样品进行上述液相色谱-串联质谱分析，得到实验数据如下：在20mg指甲粉末中检出11750pg/mg浓度的卡马西平，368pg/mg浓度的氯氮平和174pg/mg浓度的去甲氯氮平。
实施例3
采用美容指甲钳沿服药患者指甲边缘剪下后，保存于洁净干燥的牛皮纸包中，于室温下避光保存。指甲样品用5mL去离子水洗涤三次，每次3分钟；再用5mL丙酮溶液清洗两次，每次2分钟。室温下晾干。将预处理过的指甲剪成细小碎片。取指甲碎片样品，准确称取20mg，置于eppendorf管中，加入内标氯氮平-d4100μL，置于微波炉，700W加热处理两次，每次3分钟，中间间隔5分钟以使体系冷却。取出后静置恢复至室温，加入400μL甲醇，涡旋，12000r/min离心30s。取上清液200μL直接进样。将样品进行上述液相色谱-串联质谱分析，得到实验数据为：20mg指甲粉末中检出5590pg/mg浓度的卡马西平，2240pg/mg浓度的氯氮平和1705pg/mg浓度的去甲氯氮平，检出氟哌啶醇的浓度大于检出限，小于定量限；检出地西泮的浓度大于检出限，小于定量限，去甲地西泮无法检出。
实施例4
采用美容指甲钳沿同一服药患者指甲边缘剪下后，保存于洁净干燥的牛皮纸包中，于室温下避光保存。指甲样品用5mL去离子水洗涤三次，每次3分钟；再用5mL丙酮溶液清洗两次，每次2分钟。室温下晾干。将预处理过的指甲剪成细小碎片。取剪碎的指甲碎片样品，准确称取20mg，置于eppendorf管中，加入内标氯氮平-d4100μL，置于微波炉，700W加热处理两次，每次3分钟，中间间隔5分钟以使体系冷却。取出后静置恢复至室温，加入400μL甲醇，涡旋，12000r/min离心30s。取上清液200μL直接进样。将样品进行上述液相色谱-串联质谱分析。得到实验数据为：20mg指甲中检出阿立哌唑的浓度约为51.8～168.9pg/mg，脱氢阿立哌唑的浓度约为2340～9000pg/mg。
实施例5对照试验
由于碱消化法能够完全解构指甲结构，理论上认为该样品处理方法对指甲中目标物的释放最为完全，因此选用碱消化法与本发明的微波辅助提取方法进行对照实验。采集一定数量的指甲，分别采用碱消化和微波辅助提取法处理，并对碱消化法与本发明提取方法进行比较，结果列于表2。实验表明，碱消化法反应条件剧烈，对部分抗精神分裂症用药体内分析标志物尤其是苯二氮卓类物质的原药具有分解作用，难以检出(见附图6，6(A)为使用碱消化提取法的抗精神分裂症用药体内分析标志物的总离子流色谱图，6(B)、(C)、(D)分别为佐匹克隆、硝西泮和氯硝西泮的抽离子色谱图)。本发明的微波辅助提取方法提取步骤简便快速、提取分析物分解较少，适合于实际案列中判断指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的快速鉴定，且操作简便、成本低。
表2对照试验中碱消化法与本发明提取方法的比较
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种鉴定指甲中抗精神分裂症用药体内分析标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将待检测指甲和氘代内标溶液一同置于聚四氟乙烯离心管内，用微波炉进行微波加热处理；
步骤2：往步骤1处理得到的混合物中加入分析改性剂后，进行涡旋、离心分离处理，得到离心分离后混合物的上层清液；
步骤3：对步骤2中得到的上层清液进行液相色谱-串联质谱分析，对待检测指甲中的抗精神分裂症用药体内分析标志物进行确证；
其中，所述抗精神分裂症用药体内分析标志物包括喹硫平、7-羟基喹硫平、氯氮平、去甲氯氮平、氟哌啶醇、阿立哌唑、脱氢阿立哌唑、艾司唑仑、三唑仑、α-羟基三唑仑、阿普唑仑、羟基阿普唑仑、地西泮、去甲地西泮、硝西泮、7-氨基硝西泮、氯硝西泮、7-氨基氯硝西泮、唑吡坦、多虑平、阿米替林和卡马西平；
其中，所述液相色谱条件如下：
色谱柱：Resteck Allure PFPP五氟苯基柱，规格为100mm×2.1mm，5μm，前接ZorbaxExtend-C18 Narrow-bore保护柱，规格为2.1×12.5mm，5μm；流动相由流动相A：20mmol/L乙酸铵缓冲液与流动相B：含20mmol/L乙酸铵的甲醇溶液所组成，流动相A和B组分的体积比在0～1min之间为40:60，在1～1.5min之间为40:60变至15:85，在1.5～4.5min之间为15:85，在4.5～5min之间为15:85变至5:95，在5～7.5min之间为5:95，在7.5～9min之间为5:95变至40:60；流速：0.4mL/min；进样量：10μL；
其中，所述串联质谱条件如下：
电喷雾离子源，正离子扫描模式/ESI+，采用多反应监测模式/MRM检测；离子喷雾电压：5kV；碰撞气氮气：5psi，气帘气：30psi；雾化气：40psi，辅助气：60psi；离子源温度：500℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中待检测指甲被鉴定前还需要进行脱污染处理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脱污染处理步骤包括依次用去离子水和丙酮浸洗待检测指甲各两次。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述待检测指甲在去离子水和丙酮中浸洗时间均为2～3min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中微波加热处理时间为3-5min，处理两次，微波功率为450-800W。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中微波加热处理时间为3min，微波功率为700W。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的分析改性剂为甲醇。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法在鉴定精麻药物中的应用。
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