CN106148211B - 一株低产乙醛的啤酒酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株低产乙醛的啤酒酵母及其应用，属于微生物领域。所述啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2016年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12781，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。乙醛产量较出发菌株降低了近90％，达到2.17mg/L。并且在乙醛产量降低的同时，高级醇和挥发酯含量在正常范围内，醇酯比在4‑5之间，保证了啤酒风味的协调性特征。

Description

一株低产乙醛的啤酒酵母及其应用
技术领域
本发明涉及一株低产乙醛的啤酒酵母及其应用，属于微生物领域。
背景技术
啤酒是历史最悠久的酒精饮料之一。我国啤酒行业发展日趋成熟，发展方向也由重数量向着重质量转变。然而我国的啤酒质量至今还和国外的优质啤酒有着一定差距，这成为制约国内啤酒企业进一步发展的主要因素。啤酒中的风味物质对其口感和香气起着极其重要的作用，醛类是啤酒中存在的主要羰基化合物，其中乙醛是啤酒中含量最高的挥发性醛类，占啤酒中总醛的60％。乙醛的含量直接影响着啤酒的风味和老化，其含量过高会给啤酒带来恶劣的青草味，并会缩短啤酒风味的保鲜期，甚至饮用后会引起人体的不良反应。
如何降低啤酒中乙醛含量是啤酒行业关注的热点之一，虽然学者们提出了很多控制乙醛含量的措施，然而多数的工艺控制措施是针对某些企业自身的菌种、发酵工艺提出的，没有普遍适用性，同样的措施应用于不同的菌种、不同的工艺条件下可能会出现不同甚至相反的结果。与此同时，对于酵母菌株的改造基本也都是通过分子手段，构建工程菌以达到降低乙醛的目的，但是考虑到食品安全，这些工程菌是不被消费者所接受，不能应用于工业生产的。乙醛在啤酒中主要来自酵母代谢，因此，获得低产乙醛酵母才是降低啤酒中乙醛含量的根本途径。因此，建立一种行业内通用的技术手段，在保证食品安全的前提下有效降低乙醛含量是当前啤酒行业急需解决的问题之一。
乙醛在啤酒酿造过程典型的生物代谢途径如图1所示。由图1可以看出，影响乙醛含量的关键酶有丙酮酸脱氢酶、乙醛脱氢酶(ALDH)及乙醇脱氢酶(ADH2)等，其中ALDH和ADH2是酵母乙醛代谢途径中的关键酶。乙醇经ADH2代谢为乙醛，再经乙醛脱氢酶代谢为乙酸。酶的抑制剂可特异性地作用于酶的特殊基团或者活性中心，合理的选择抑制剂可大幅度提高筛选菌株的效率。若抑制或降低ADH2活性，使乙醇流向乙醛的代谢流减弱，可以令乙醛含量降低；4-甲基吡唑可以与ADH2的酶活性中心结合，从而抑制乙醇的代谢。戒酒硫是乙醛脱氢酶的抑制剂之一，一定浓度的戒酒硫能部分或全部抑制乙醛脱氢酶的活性，从而使乙醛不能氧化为乙酸。在以乙醇为唯一碳源的培养基中，乙酸一旦不能形成，酵母的代谢流就无法进行下去，酵母则不会生长。不同酵母菌株分泌ALDH和ADH2的酶活水平高低不同，催化乙醛的能力不同，最终表现在发酵产物中乙醛的终浓度有所差别。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2016年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12781，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述酵母形状近似于圆形，直径大小介于1.5-3.0微米；在YPD固体培养基表面生长48个小时后，即能长出直径大小约2.5毫米左右的菌落，菌落乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐，质地均匀，半透明，易挑取，有酒香味。
所述酵母是由出发菌株经常压室温等离子体诱变(ARTP)后，稀释涂布于甲吡唑-戒酒硫-乙醇抗性平板，挑取长出的菌落，在高浓乙醛环境中进化筛选后得到具有较强的乙醛还原能力的啤酒酵母。
在含有甲吡唑和戒酒硫的以乙醇为唯一碳源的培养上，戒酒硫通过抑制ALDH酶的活性进而抑制酵母的生长，而只有突变具有高ALDH酶活性的酵母可以代谢乙醛而正常生长，其代谢乙醛能力强，从而使乙醛含量降低；甲吡唑能与酵母中ADH2特异性结合，从而阻止了乙醇向乙醛的转化，使代谢产生的乙醛流向合成乙醇或乙酸的方向。最后，通过向培养基中添加高浓度的乙醛，使酵母长期处在一个高乙醛浓度的环境中进化出较强的乙醛还原能力，进一步降低乙醛产量，增强优选菌株的遗传稳定性。甲吡唑和戒酒硫双抑制剂平板与高浓度乙醛培养基驯化相结合可以更加高效地筛选出低产乙醛酵母菌，减少了菌株选育的盲目性。
本发明提供的一株低产乙醛的酿酒酵母CGMCC No.12781，其发酵后乙醛含量可低达2.17mg/L。
生物材料保藏
一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2016年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12781，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1乙醛在酵母体内的生物代谢途径。
具体实施方式
平板筛选和液体培养基驯化过程中乙醛含量的测定方法：
利用顶空气相色谱法(HS-GC)对筛选过程中的乙醛含量进行测定，具体操作过程及实验条件如下：
样品处理：向顶空瓶中加入1.8g NaCl，加入4mL滤纸过滤后的酵母发酵液或乙醛标准溶液(20mg/L)，同时加入内部标准溶液3-庚酮1mL(30mg/L)，密封后直接放入顶空自动进样器进行样品采集分析。
HS-GC检测条件：
色谱柱：CP-WAX 52CB 30m，I.D.0.25mm(液膜原标:0.25μm)；载气：N2，流速0.5-1.0mL/min，分流比1:1，尾吹20-30mL/min；氢气：流速40mL/min；空气：流速400mL/min；色谱柱室温度：40℃保留5min，以10℃/min的速度升到180℃保留4min，气化室温度：200℃；检测室温度：250℃
实施例1低产乙醛啤酒酵母的获得
甲吡唑-双硫伦-乙醇抗性平板组分(mg/L)如下：甲吡唑1500，戒酒硫1.0，乙醇20，(NH4)2SO44500，NaCl 100，KH2PO4500，MgSO4·7H2O 500，CaCl2100，酵母膏100，琼脂20。
将戒酒硫浓度固定为1.0mg·L-1后逐级增加甲吡唑浓度以确定复合抑制剂对OD600＝1.5时的酵母致死浓度。在复合筛选培养基上酵母的生长情况显示，戒酒硫与甲吡唑复合培养基在甲吡唑浓度900mg·L-1、双硫仑浓度1.0mg·L-1时已经对稀释倍数10-2以及10-1的酵母完全致死；在甲吡唑浓度1200mg·L-1、戒酒硫浓度1.0mg·L-1时开始对原浓度酵母(OD600＝1.5)产生影响；在甲吡唑浓度1500mg·L-1、戒酒硫浓度1.0mg·L-1时，对原浓度酵母基本致死，所以选取甲吡唑浓度1500mg·L-1、戒酒硫浓度1.0mg·L-1为筛选低产乙醛酵母的复合抗性浓度。
以啤酒酵母为出发菌株，将经ARTP诱变(将稀释过后的菌悬液取20μL涂布于载体表面，将载片放置于载台的凹槽中，分别进行2mm射距照射45s)的酵母菌株扩培后，调整菌悬液浓度OD600＝1.5时涂布于完全致死抑制剂浓度的甲吡唑-双硫伦-乙醇抗性平板，挑取筛选平板上长出的菌落进行发酵实验，结果如表1所示。
表1复合抗性平板上挑取菌落的发酵情况
注：表中仅部分数据，因篇幅有限部分数据未列出。
表1中的菌株是出发酵母经ARTP诱变后在甲吡唑+戒酒硫复合筛选培养基上生长的乙醛含量降低的菌株，各个酵母菌株乙醛代谢量降低幅度有所差异。
实施例2菌株的驯化
以乙醛为唯一碳源的高浓乙醛培养基，组分(mg/L)如下：乙醛800，KH2PO4500，NaCl100，(NH4)2SO45000，MgSO4·7H2O 500，酵母膏100，CaCl2100。
将实施例1中得到的7个菌株置于上述含不同浓度的以乙醛为唯一碳源的液体培养基中，每48-72h转接一次以保证乙醛的浓度，10℃培养30天。驯养后，进行三角瓶发酵，考察其乙醛含量，结果如表2所示。
表2经乙醛培养基驯化培养养后的酵母乙醛产量
注：表中仅部分数据，因篇幅有限部分数据未列出。
由表2可以看出，经高浓乙醛培养基的驯化培养后，酵母乙醛的代谢量进一步降低：5号酵母LAL-8a-LQ的乙醛产量较出发菌株降低了近90％，达到2.17mg/L。将该菌保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号为：CGMCC No.12781。
同时，在保证酵母菌株乙醛产量降低的同时，考虑到啤酒酵母的其他发酵性能，进一步将5号酵母LAL-8a-LQ进行发酵，对风味物质进行检测分析，结果见表4。结果显示，5号酵母菌株在乙醛产量降低的同时，高级醇和挥发酯含量在正常范围内，醇酯比在4-5之间，保证了啤酒风味的协调性特征。
表35号酵母风味物质检测分析(mg/L)
注：试验1、试验2和试验3分别为优选啤酒酵母菌株5的平行发酵试验。

Claims (3)

1.一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2016年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12781，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的酿酒酵母在啤酒酿造中的应用。
3.权利要求1所述的酿酒酵母在制备酒精饮料中的应用。
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