CN106138029B - 山木瓜化合物的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药学领域，特别是涉及一种双口山酮类化合物Griffipavixanthone的医药用途及其药物组合物。本发明的双口山酮类化合物Griffipavixanthone可用于防治食管癌。

Description

山木瓜化合物的医药用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种从山木瓜中提取的化合物的医药用途及其药物组合物。

背景技术

食管癌，是世界上致死率较高的恶性肿瘤之一。中国为世界上食管癌的主要发生国家之一，其发生率与日俱增。食管癌主要有两种主要形式：食管鳞癌和食管腺癌。其中，食管鳞癌占已知食管癌数量的90％。食管癌的主要致死原因为转移，其主要转移部位为肺，肝，骨等部位。尽管人们寻找大量的方法治疗食管癌，但因转移的复杂性而见效甚微。故，针对食管癌的治疗在世界上成为了难题。

藤黄属植物在我国有21种，分布于广东，广西，云南等南部省区。研究表明，藤黄属植物是寻找抗肿瘤候选药物的重要源泉。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种山木瓜中提取的双口山酮化合物Griffipavixanthone的新的医药用途及其药物组合物。

具体地说，本发明的第一方面是提供了式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐在制备预防或治疗食管癌转移的药物中的应用：

在一优选例中，所述的式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐是作为唯一的原料药应用于预防或治疗食管癌转移的药物的制备中。

在另一优选例中，所述的食管癌选自人食管癌细胞Eca109或人食管癌细胞KYSE150。

在另一优选例中，所述的食管癌转移为食管癌的肺转移。

本发明的第二方面是提供了式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐在制备预防或治疗食管癌的药物中的应用。

在一优选例中，所述的式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐是作为唯一的原料药应用于预防或治疗食管癌的药物的制备中。

在另一优选例中，所述的食管癌选自人食管癌细胞Eca109或人食管癌细胞KYSE150。

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。

附图说明

图1为Griffipavixanthone及阳性对照索拉菲尼(Sorafeinib,SFB)抑制人食管癌Eca109和KYSE150细胞株划痕迁移的显微镜照片。

图2为不同浓度的Griffipavixanthone抑制人食管癌细胞Eca109和KYSE150小室迁移24小时后的统计分析图(**P<0.01,***P<0.001)，纵轴为穿孔的细胞百分比(与对照组相对比)，横轴为Griffipavixanthone的浓度。

图3为不同浓度的Griffipavixanthone抑制人食管癌细胞Eca109和KYSE150小室迁移24小时后染色图。

图4为Griffipavixanthone抑制人食管癌细胞Eca109和KYSE150小室侵袭24小时后的统计分析图(*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001)，纵轴为穿过基底膜的细胞百分比(与对照组相对比)，横轴为Griffipavixanthone(GPX)的浓度。

图5为不同浓度的Griffipavixanthone作用Eca109和KYSE150细胞24小时后的抑制人食管癌细胞侵袭的染色图。

图6为Griffipavixanthone作用48小时后抑制Eca109和KYSE150食管癌细胞克隆增殖的染色图。

图7a、7b、7c和7d为Griffipavixanthone及索拉菲尼(阳性对照)作用48小时后诱导Eca109和KYSE150食管癌细胞G2/M周期阻滞的流式图。

图8a、8b和8c为不同浓度的Griffipavixanthone及索拉菲尼(阳性对照)诱导Eca109和KYSE150食管癌细胞周期阻滞统计图(*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001)。

图9为尾静脉肺转移模型的动物隔天注射Griffipavixanthone(20mg/kg)35天后，Griffipavixanthone减少肺结节个数及减少肺结节面积的肺组织及其HE染色图。

图10为尾静脉肺转移模型的动物隔天注射Griffipavixanthone(20mg/kg)35天后，体内肺结节个数的统计图(*P<0.05，**P<0.01)。

图11为尾静脉肺转移模型的动物隔天注射Griffipavixanthone(20mg/kg)35天后，肺重统计图(*P<0.05，**P<0.01)。

具体实施方式

本发明的问世部分是基于这样一个发现：从藤黄属植物山木瓜中提取的双口山酮化合物Griffipavixanthone可以显著抑制食管癌细胞的生长、迁移和侵袭。因此，该化合物有望开发成为一种预防或者治疗食管癌的药物。

进而，本发明的第一方面是提供了式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐在制备预防或治疗食管癌转移的药物中的应用

较优选地，所述的式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐是作为唯一的原料药应用于预防或治疗食管癌转移的药物的制备中。

较优选地，所述的食管癌选自人食管癌细胞Eca109或人食管癌细胞KYSE150。

较优选地，所述的食管癌转移为食管癌的肺转移。

本发明的第二方面是提供了式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐在制备预防或治疗食管癌的药物中的应用。

较优选地，所述的式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐是作为唯一的原料药应用于预防或治疗食管癌的药物的制备中。

较优选地，所述的食管癌选自人食管癌细胞Eca109或人食管癌细胞KYSE150。

如本领域的技术人员所知，本发明的双口山酮化合物Griffipavixanthone具有如下化学结构式：

分子式C₃₆H₂₈O₁₂，分子量652.62，CAS号：219649-95-3

本发明的Griffipavixanthone可通过本领域的常规方法从藤黄属植物山木瓜枝Garcinia esculenta Y.H.等中提取获得，亦可通过商业途径购买或者利用市售原料，或通过现有技术中传统的化合物合成方法合成获得。本领域的普通技术人员根据现有公知技术可以合成本发明的上述化合物。合成的本发明的上述化合物可以进一步通过柱色谱法、高效液相色谱法或结晶等方式进一步纯化。其纯度均符合药用标准。

本发明的上述化合物包括但不限于其旋光异构体、外消旋体和其他混合物。在那些情况下，单独的对映体或非对映体，即光学活性形式可通过不对称合成或通过外消旋体的拆分而获得。外消旋体的拆分例如可通过常规方法如在拆分剂存在的情况下的结晶或使用例如手性高压液相色谱(HPLC)柱的色谱法来实现。另外，这种化合物包括Z-和E-形式(或顺式和反式形式)的具有碳碳双键的化合物。在本文的上述化合物以多种互变异构形式存在的情况下，其包括化合物的所有互变异构形式。这种化合物还包括多晶型物和包合物的晶体形式。

本发明的上述化合物还包括其晶体和无定形形式，所述形式包括化合物的例如多晶型物、假多晶型物、溶剂合物、水合物、未溶剂合的多晶型物(包括无水物)、构象多晶型物和无定形形式，以及它们的混合物。“晶体形式”、“多晶型物”和“新型形式”在本发明中可以互相交换使用，且旨在包括本发明化合物的所有晶体和无定形形式，所述形式包括例如多晶型物、假多晶型物、溶剂合物、水合物、未溶剂合的多晶型物(包括无水物)、构象多晶型物和无定形形式，以及它们的混合物，除非指的是一种特定的晶体或无定形形式。本发明的化合物还包括所述化合物的药用形式，所述形式包括螯合物、非共价络合物、前药及其混合物。

“药用盐”包括但不限于与无机酸的盐，如盐酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐、硝酸盐以及类似的盐；以及与有机酸的盐，如苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、2-羟乙基磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐和烷羧酸盐如乙酸盐、其中n＝0～4的HOOC-(CH₂)n-COOH以及类似的盐。类似地，药用阳离子包括但不限于纳、钾、钙、铝、锂和铵。

另外，如果本发明的上述化合物作为酸加成盐而获得，则通过使酸盐的溶液碱化可获得游离碱。相反，如果产物是游离碱，则按照由碱性化合物制备酸加成盐的常规程序，通过将游离碱溶解于合适的有机溶剂中并用酸对所述溶液进行处理可以产生加成盐，特别是药用加成盐。本领域的技术人员会确认可用于制备无毒的药用加成盐的多种合成方法。

本发明的Griffipavixanthone可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的Griffipavixanthone及可药用载体。较佳的，本发明的药物组合物含有0.1～99.9％重量百分比的作为活性成分的本发明的Griffipavixanthone。“可药用载体”不会破坏本发明的Griffipavixanthone的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。

所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。

其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。

本发明的Griffipavixanthone以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。

本发明的Griffipavixanthone以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

实施例1从山木瓜中提取获得Griffipavixanthone

1.1实验材料

山木瓜枝于2010年8月采集于中国云南怒江。由周元川教授鉴定为Garciniaesculenta Y.H.L的枝。植物标本存放于上海中医药大学中药学院(植物标本号：20100801)。

1.2实验方法

山木瓜枝干燥后粉碎(4kg)，用石油醚渗滤提取(5×20L，每次2天)。将提取液合并后减压浓缩至干，得到石油醚部位(组份I，40g)。渗滤提取剩下的药渣用80％乙醇热回流提取(v/v，5×20L)。将提取液合并后减压浓缩至干，残渣用水溶解(5L)，形成混悬液，然后用乙酸乙酯萃取(5×5L)，分别得到组份II(50g，乙酸乙酯部位)和III(萃取剩下的水部位)。提取剩下的药材用蒸馏水热回流提取(5×20L)得到组份IV。

乙酸乙酯部位经MCI吸附后(组份II)，依次用30％，60％，90％，100％EtOH和EtOAc洗脱，分别得到组份IIA-IIE。其中组份IIC(14g)用C₁₈柱进行分离，用MeOH-H₂O(60:40-100:0)进行梯度洗脱，通过TLC点板合并得到9个组份(IIC1-IIC9)。组份IIC6进一步用C18进行分离，MeOH-H₂O梯度洗脱(45:55-100:0)得到组份IIC6a-IIC6d。组份IIC6c用Sephadex LH-20进行纯化，甲醇梯度洗脱得到化合物Griffipavixanthone(108mg)。

1.3实验结果

从山木瓜中分离得到的化合物Griffipavixanthone，经核磁及质谱检测，化学结构如式(Ⅰ)所示：

实施例2Griffipavixanthone抑制人食管癌细胞划痕迁移

2.1实验材料

人食管癌细胞Eca109购自上海中国科学院生化细胞所，KYSE150由上海复旦大学癌症中心赠予。

RPMI1640购自美国Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司，索拉菲尼购自Selleck Chemicals公司。

2.2实验方法

人食管癌细胞Eca109和KYSE150用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基，于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

人食管癌细胞Eca109和KYSE150于对数生长期接种于24孔板(1×10⁵个细胞/孔)，等细胞单层长满后，用100μl枪头划痕，计为0小时，同时加入不同浓度的药物和索拉菲尼(20μM/孔)，分别于36和12小时候后观察，并在显微镜下成像。

2.3实验结果

结果如图1所示，Griffipavixanthone与索拉菲尼都能够显著性地抑制Eca109和KYSE150细胞划痕迁移，说明Griffipavixanthone能够浓度依赖性地抑制人食管癌细胞Eca109和KYSE150迁移。

实施例3Griffipavixanthone抑制人食管癌细胞小室迁移。

3.1实验材料：

RPMI1640购自美国Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。

Transwell购自于美国Corning公司。

3.2实验方法：

人食管癌细胞Eca109和KYSE150用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培液基，于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

人食管癌细胞Eca109和KYSE150(5×10⁴个细胞/孔)接种于小室(8μm孔径)上室中。上室无血清，下室10％血清。药物与细胞作用24小时后，取出小室，弃培养基，用棉签轻轻地擦去上室未迁移细胞，固定于4％多聚甲醛，用0.1％结晶紫染色，并于显微镜下计数，照片如图3所示。实验数据均用平均值±标准误差表示，采用SPSS18.0统计软件进行分析，以One-Way ANOVA方式进行方差分析，两两比较采用Student’s t-test法，**P<0.01，***P<0.001为具有统计学显著性差异标准。

3.3实验结果

结果如图2和图3所示，Griffipavixanthone于5，10，15，20μM浓度下，能够浓度依赖性地抑制Eca109和KYSE150细胞小室迁移。

实施例4Griffipavixanthone抑制人食管癌细胞侵袭

4.1实验材料：

RPMI1640购自美国Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。

Transwell购自于美国Corning公司。Matrigel购自于美国BD公司。

4.2实验方法：

人食管癌细胞Eca109和KYSE150用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培液基，于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

细胞迁移实验所用小室(8μm孔径)用Matrigel孵育2h后，人食管癌细胞Eca109(1×10⁵个细胞/孔)接种于无血清小室上室中，下室10％血清。细胞在药物作用于24小时后，取出小室，弃培养基，用棉签轻轻地擦去上室未侵袭细胞，固定于4％多聚甲醛，用0.1％结晶紫染色，并在显微镜下计数。实验数据均用平均值±标准误差表示，采用SPSS18.0统计软件进行分析，以One-Way ANOVA方式进行方差分析，两两比较采用Student’s t-test法，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001为具有统计学显著性差异标准。

4.3实验结果

结果如图4和图5所示，Griffipavixanthone于5，10，15，20μM浓度下能够浓度依赖性地抑制Eca109和KYSE150细胞侵袭。实验数据均用平均值±标准误差表示，采用SPSS18.0统计软件进行分析，以One-Way ANOVA方式进行方差分析，两两比较采用Student’s t-test法，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001为具有统计学显著性差异标准。

实施例5Griffipavixanthone抑制人食管癌克隆增殖

5.1实验材料：

RPMI1640购自美国Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。

5.2实验方法：

人食管癌Eca109和KYSE150细胞用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培液基，于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

将人食管癌细胞Eca109(500个细胞/孔)和KYSE150(250个细胞/孔)接种于6孔板中。Griffipavixanthone或者索拉菲尼(20μM/孔)作用48小时后，细胞继续在培养箱中培养7天。在第7天，细胞用4％多聚甲醛固定，用0.1％结晶紫染色，并于显微镜下拍照呈像。

5.3实验结果

结果如图6所示，Griffipavixanthone于5，10，15，20μM浓度下能够抑制Eca109和KYSE150的克隆增殖，相同结果也可以在索拉菲尼组观察到。说明Griffipavixanthone能够浓度依赖性地抑制人食管癌细胞增殖。

实施例6Griffipavixanthone诱导人食管癌细胞周期阻滞

6.1实验材料：

RPMI1640购自美国Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。

6.2实验方法：

人食管癌Eca109和KYSE150细胞用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培液基，于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

将人食管癌细胞Eca109和KYSE150(2×10⁵个细胞/孔)接种于6孔板中。待Griffipavixanthone或者索拉菲尼(20μM/孔)作用48小时后，收集细胞，固定于70％乙醇中，在4℃冰箱中过夜。细胞用含RNaseA酶的PI在37℃中孵育30分钟，并用流式细胞仪观测分析。

6.3实验结果

结果如图7(a、b、c、d)和图8(a、b、c)所示，Griffipavixanthone于5，10，15，20μM浓度下能够诱导Eca109和KYSE150细胞G2/M周期阻滞，与索拉菲尼的效果一致，说明Griffipavixanthone能够通过诱导G2/M期阻滞，从而浓度依赖性地抑制人食管癌细胞增殖。实验数据均用平均值±标准误差表示，采用SPSS18.0统计软件进行分析，以One-WayANOVA方式进行方差分析，两两比较采用Student’s t-test法，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001为具有统计学显著性差异标准。

实施例7Griffipavixanthone抑制体内食管癌的肺转移

7.1实验材料：

RPMI1640购自美国Hyclone公司，胎牛血清，青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。

Bouin’s solution购自美国Sigma公司。

7.2实验方法：

人食管癌KYSE150细胞用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培液基，于37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

将人食管癌KYSE150细胞(1×10⁶个细胞/只)尾静脉注射于6周龄雄性裸鼠体内。将小鼠随机分为三组，每组8只，隔天腹腔注射溶剂对照(DMSO)、Griffipavixanthone(20mg/kg)和5-FU(20mg/kg)。35天后，将肺从体内取出，称重，用Bouin’s solution固定，切片，HE染色，并统计肺结节个数。

7.3实验结果

结果如图9、10和11所示，Griffipavixanthone于20mg/kg浓度下显著地抑制KYSE150体内肺转移，能使肺结节个数减少，肺重和肺结节面积变小。说明Griffipavixanthone可以抑制食管癌细胞体内转移。实验数据均用平均值±标准误差表示，采用SPSS18.0统计软件进行分析，以One-Way ANOVA方式进行方差分析，两两比较采用Student’s t-test法，*P<0.05，**P<0.01，为具有统计学显著性差异标准。

本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。

Claims (7)

1.式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐在制备预防或治疗食管癌转移的药物中的应用：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐是作为唯一的原料药应用于预防或治疗食管癌转移的药物的制备中。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的食管癌选自人食管癌细胞Eca109或人食管癌细胞KYSE150。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的食管癌转移为食管癌的肺转移。

5.式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐在制备预防或治疗食管癌的药物中的应用：

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的式(Ⅰ)化合物，或其可药用盐是作为唯一的原料药应用于预防或治疗食管癌的药物的制备中。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的食管癌选自人食管癌细胞Eca109或人食管癌细胞KYSE150。