CN1061091C - 以叶绿素分子作连接子构建基因探针的方法 - Google Patents
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Abstract
用叶绿素分子(chlorophyll)作为连接子把蛋白质等生物活性分子与核酸共价交联来构建的基因探针，可广泛地应用于分子生物学研究、生化分析、临床检测等生命科学研究与应用的各个领域。由此法构建基因探针具有操作简便，稳定性好，成本低廉，易于长期保藏等特点，是一种应用前景广泛的生命科学研究工具。
Description
本发明涉及一种以叶绿素(Chlorophyll)分子作为连接子构建基因探针的方法。属生物工程技术领域。
在生物学、医学的基础和应用研究的各个领域中，都涉及到抗原、抗体、多肽、激素等各种蛋白质分子、核酸分子的微量或超微量测定技术。1992年Takshi Sano等把免疫学方法和聚合酶链反应(PCR)结合起来(Immuno-PCR：Very Sensitive Antigen Detection by Means ofSpecific Antibody-DNA Conjugates．Takshi Sano．″Science″Vol．2581992．10．2)，利用链霉抗生物素-蛋白A融合蛋白作为连接子构建基因探针，建立了一种高度灵敏的抗原-抗体检测法：免疫-聚合酶链反应(lmmuno-PCR)．1995年中国专利″一种抗体／蛋白A-DNA探针的构建方法″(专利申请号：95111578．2)中，作者曾采用化学方法以聚乙亚二胺(PEI)作交联剂，把蛋白质(如抗原Ag或抗体Ab)直接连接到DNA分子上，这一方法虽然克服了Sano的免疫-聚合酶链反应(lmmuno-PCR)构建基因探针的缺点，但连接反应需在有机溶剂中进行，而且反应时间长(18-20小时)，往往引起基因探针中蛋白质活性的降低，影响其稳定性。
本发明的目的在于推出一种以广泛存在于绿色植物体中的叶绿素分子作为连接子构建基因探针的方法，以便使免疫-聚合酶链反应(Lmmuno-PCR)技术真正应用于临床诊断。
本发明涉及到以叶绿素分子作连接子构建基因探针的方法，其中之一为蛋白质基因探针，蛋白质包括抗原、抗体、多肽、激素，其特征在于该方法包括两个必需的步骤：首先是利用叶绿素分子中的酯键与经特异性限制性核酸内切酶作用后的双链DNA分子中的游离氨基反应形成酰胺键，从而将叶绿素分子定向地共价结合在双链DNA分子上；其次是通过叶绿素分子的极性头部在一定波长和强度的光激活下与蛋白质共价交联，形成蛋白质-DNA的基因探针。该方法的全部步骤罗列如下：
第1步 用分析纯的无水乙醇提取纯化植物叶片总叶绿素分子；
第2步 用碱变性法提取纯化质粒pNC3 DNA分子；
第3步 取10μg pNC3 DNA溶于60μl反应体积的反应液中，加入EcoRI 2u／μg DNA，在温度为37℃的环境中反应2-3小时，使EcoRI酶切pNC3 DNA分子，直到消化完全；
第4步 用等体积按酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1的比例混合的PH值为7．8-8．0的有机溶剂溶液抽提第3步制备的反应液一次，在温度为4℃的环境中以转速为10000rpm的离心机上进行离心5分钟；
第5步 取第4步制备的水相，按水相体积∶总叶绿素分子乙醇溶液体积为2∶1的比例，在其中加入第1步中提取纯化的总叶绿素分子乙醇溶液，轻轻混合，在温度为50℃的避光环境中反应15分钟；
第6步 在第5步制备的溶液中加入等体积的分析纯的异丙醇，在温度为0℃的避光环境中保持10分钟；
第7步 将第6步制备的溶液在温度为4℃的环境中以转速为10000rpm的离心机上进行离心10分钟，弃去上清液；
第8步 向第7步制备的溶液中加入70％乙醇，然后在温度为4℃的环境中以转速为10000rpm的离心机上进行离心5分钟，弃去上清液；
第9步 将第8步制备的溶液在避光环境中快速真空干燥20-30分钟；
第10步 在第9步制备物中加入PH值为7．2的PBS缓冲液5-10μl，温和摇荡几次，使沉淀完全溶解；
第11步 在第10步制备的溶液中加入按蛋白质∶DNA的克分子数的比例为2∶1的抗原或抗体，在温度为37℃的黑暗环境中反应10分钟；
第12步 在第11步制备的溶液中加入1M的PH值为6．5的醋酸钾，使溶液的PH值为6．8，在温度为37℃的黑暗环境中反应30分钟；
第13步 置第12步制备的反应液于强度为50000-80000Lux波长入为400-700nm的光下反应5分钟；
第14步 在第13步制备的反应液中加入1M NaHCO3溶液，使溶液PH值为7．2-7．4，最终体积为20μl，即得蛋白质-DNA基因探针；
第15步 保藏备用。
本发明的优点如下：
1．由于本发明采用了以叶绿素分子作连接子构建基因探针的方法，完全避免了在交联过程中，蛋白质与有机溶剂的接触，而且反应时间较短，只需45分钟。
2．本发明采用的设计是人为地将蛋白质分子定向地连接在双链DNA分子特定的位置上，对PCR扩增没有任何影响，因而增加了PCR的扩增效率和扩增的有效性。
3．本发明所需的试剂均为普通化学试剂，来源广泛，成本低廉，方法简便，无需昂贵的仪器设备，易于推广应用。
4．本发明涉及到的构建基因探针方法具有通用性，同样适用于构建其他生物活性分子的基因探针。
本发明所构建的基因探针可广泛地应用于分子生物学研究、生化分析、临床检测等生命科学研究与应用的各个领域。构建方法具有操作简便，通用性强，所构建的基因探针稳定性好，成本低廉，易于长期保藏等特点，是一种应用前景广泛的生命科学研究工具。
Claims (1)
1．以叶绿素分子作连接子构建基因探针的方法，其中之一为蛋白质基因探针，蛋白质包括抗原、抗体、多肽、激素，其特征在于该方法包括两个必需的步骤：首先是利用叶绿素分子中的酯键与经特异性限制性核酸内切酶作用后的双链DNA分子中的游离氨基反应形成酰胺键，从而将叶绿素分子定向地共价结合在双链DNA分子上；其次是通过叶绿素分子的极性头部在一定波长和强度的光激活下与蛋白质共价交联，形成蛋白质-DNA的基因探针；该方法的全部步骤罗列如下：
第1步 用分析纯的无水乙醇提取纯化植物叶片总叶绿素分子；
第2步 用碱变性法提取纯化质粒pNC3DNA分子；
第3步 取10μg pNC3 DNA溶于60μl反应体积的反应液中，加入EcoRI 2u／μg DNA，在温度为37℃的环境中反应2-3小时，使EcoRI酶切pNC3 DNA分子，直到消化完全；
第4步 用等体积按酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1的比例混合的PH值为7．8-8．0的有机溶剂溶液抽提第3步制备的反应液一次，在温度为4℃的环境中以转速为10000rpm的离心机上进行离心5分钟；
第5步 取第4步制备的水相，按水相体积∶总叶绿素分子乙醇溶液体积为2∶1的比例，在其中加入第1步中提取纯化的总叶绿素分子乙醇溶液，轻轻混合，在温度为50℃的避光环境中反应15分钟；
第6步 在第5步制备的溶液中加入等体积的分析纯的异丙醇，在温度为0℃的避光环境中保持10分钟；
第7步 将第6步制备的溶液在温度为4℃的环境中以转速为10000rpm的离心机上进行离心10分钟，弃去上清液；
第8步 向第7步制备的溶液中加入70％乙醇，然后在温度为4℃的环境中以转速为10000rpm的离心机上进行离心5分钟，弃去上清液；
第9步 将第8步制备的溶液在避光环境中快速真空干燥20-30分钟；
第10步 在第9步制备物中加入PH值为7．2的PBS缓冲液5-10μl，温和摇荡几次，使沉淀完全溶解；
第11步 在第10步制备的溶液中加入按蛋白质：DNA的克分子数的比例为2∶1的抗原或抗体，在温度为37℃的黑暗环境中反应10分钟；
第12步 在第11步制备的溶液中加入1M的PH值为6．5的醋酸钾，使溶液的PH值为6．8，在温度为37℃的黑暗环境中反应30分钟；
第13步 置第12步制备的反应液于强度为50000-80000Lux波长入为400-700nm的光下反应5分钟；
第14步 在第13步制备的反应液中加入1M NaHCO3溶液，使溶液PH值为7．2-7．4，最终体积为20μl，即得蛋白质-DNA基因探针；
第15步 保藏备用。
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1150177A CN1150177A (zh) | 1997-05-21 |
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| CN95113333A Expired - Fee Related CN1061091C (zh) | 1995-11-10 | 1995-11-10 | 以叶绿素分子作连接子构建基因探针的方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN1061091C (zh) |
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1995
- 1995-11-10 CN CN95113333A patent/CN1061091C/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SCIENCEVOL258 1992.10.2 TAKASHISANOATAI * |
Also Published As
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|---|---|
| CN1150177A (zh) | 1997-05-21 |
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