CN106103821A - 含有活性酯基的纤维制造用组合物及使用该纤维的细胞培养支架材料 - Google Patents

含有活性酯基的纤维制造用组合物及使用该纤维的细胞培养支架材料 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供纤维制造用组合物、将该组合物进行纺丝而得到的纤维、以及使用该纤维的细胞培养支架材料，所述纤维制造用组合物用于制造适合于将对细胞的粘附·增殖·分化等有效的物质固定化、并且保持耐有机溶剂性的纤维。一种纤维制造用组合物，其含有：(A)包含通式(1)表示的单元结构及通式(2)表示的单元结构的高分子化合物，(B)交联剂，(C)酸化合物，以及(D)溶剂。式(1)及(2)中的各符号如说明书中所述。

Description

含有活性酯基的纤维制造用组合物及使用该纤维的细胞培养 支架材料
技术领域
本发明涉及含有在侧链上具有活性酯基和羟基的高分子化合物、交联剂、酸化合物及溶剂的纤维制造用组合物，将该组合物进行纺丝(优选地，进一步加热)而得到的在耐有机溶剂性方面优异的纤维，以及使用该纤维的细胞培养支架材料(cell culturescaffold material)。
背景技术
对于生物体内的骨髓、基底膜而言，细胞在由胶原等纳米量级的纤维状结构构成的细胞外基质中生长、增殖。因此，为了提供细胞医疗、再生医疗中必要的细胞，需要在生物体外高效地培养细胞的细胞培养用支架材料。对于这样的细胞培养支架材料而言，优选尽可能地模拟环绕细胞的生物体内环境。
在将细胞在生物体外培养的情况下，以往进行了如下研究：将从生物体提取的胶原等基质构成物质加工成胶体或海绵状结构体，并将其作为培养用的支架(日文：足場)(参见专利文献1)。然而，关于主要由蛋白质形成的这些来源于生物体的物质，存在以下问题：不能耐受高压灭菌釜、γ射线等的灭菌处理，或相对于使用之前的长期保存而言的稳定性问题；以及力学强度、形态稳定性等问题。另外，这些胶原等来源于生物体的物质通常是从牛、猪等动物提取的，因此，存在从这些动物混入感染性物质的危险性。
因此，最近也在进行如下研究：代替从生物体提取的物质，而将合成高分子用作材料，制作发泡体、胶体、纤维等结构体，将其作为培养支架(参见专利文献2～专利文献5)。特别地，公开了将包含N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)丙烯酸酯酯单体、亲水性单体、及交联剂的合成聚合物应用于细胞培养基材表面的方案(参见专利文献6)。
其中，通过被称为静电纺丝法(electrospinning)的一边施以高压一边吹喷纤维的方法，由具有纳米量级的纤维直径的纳米纤维(nanofiber)构成的结构体作为细胞培养支架材料而受到瞩目。在该纳米纤维上，进行了许多在保持用于细胞医疗、再生医疗的功能细胞、多能干细胞的未分化性的状态下培养的尝试(参见非专利文献1～非专利文献3)。然而，对于这样的来源于合成高分子的纤维而言，赋予细胞粘附性、细胞增殖性是困难的，并不能说其模拟了生物体内的环境。
为了改善上述方面，还研究了将包含RGD的细胞粘附性肽固定化而得的纳米纤维(参见非专利文献4)。该情况下，虽然将细胞粘附性肽固定化于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯这样的包含活性酯基的合成高分子上，但为了使高分子不溶解于水，使用考虑了亲·疏水性的共聚物进行了研究。因此，NHS的导入量受限，可固定化的细胞粘附物质的量也受限，结果细胞培养支架材料的细胞粘附性也受限。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭62-502936号公报
专利文献2：日本特开昭62-122586号公报
专利文献3：日本特开2003-265593号公报
专利文献4：日本特开2005-60570号公报
专利文献5：日本特开2007-325543号公报
专利文献6：美国专利第8362144号说明书
非专利文献
非专利文献1：Biomaterials 26p5158(2005)
非专利文献2：Tissue Eng.11p1149(2005)
非专利文献3：Cytotechnology 64p701(2012)
非专利文献4：Journal of Biomedical Materials Research A 100A p794(2012)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种纤维制造用组合物、将该组合物进行纺丝而得到的纤维、以及使用该纤维的细胞培养支架材料，所述纤维制造用组合物用于制造能够将对细胞的粘附·增殖·分化等有效的物质固定化、并且保持耐有机溶剂性、耐液体培养基性的纤维。
用于解决问题的手段
本申请的发明人进行了潜心研究，结果发现，将含有在侧链上具有活性酯基和羟基的高分子化合物、交联剂、酸化合物及溶剂的纤维制造用组合物进行纺丝而制造的纤维，能够将对细胞的粘附·增殖·分化等有效的物质固定化，另外还具有充分的耐有机溶剂性、进而具有作为细胞培养支架材料的优异性能。
另外，本申请的发明人发现，由于上述纤维制造用组合物的纺丝是将在侧链上具有活性酯基和羟基的高分子化合物与交联剂及酸化合物一同纺丝，因此，高分子化合物中所含的羟基彼此介由交联剂而发生交联反应，由此高分子化合物彼此交联，结果，能够得到具有耐有机溶剂性、耐液体培养基性的纤维。
另外，本申请的发明人发现，将本发明的纤维制造用组合物进行纺丝而制造的纤维通过进行加热处理，呈现出更加优异的耐有机溶剂性、耐液体培养基性。
基于这些发现，本申请的发明人完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种纤维制造用组合物，含有：
(A)包含通式(1)表示的单元结构及通式(2)表示的单元结构的高分子化合物，
(B)交联剂，
(C)酸化合物，以及
(D)溶剂。
(式(1)中，
R1表示氢原子或甲基，
Q1表示酯键或酰胺键，
R2表示至少1个氢原子被羟基取代的碳原子数为1～10的烷基或碳原子数为6～10的芳香族烃基。)
(式(2)中，
R3表示氢原子或甲基，
Q2表示活性酯基。)
[2]根据上述1所述的组合物，其中，上述Q2由通式(5)表示。
(式(5)中，
Q3表示N-琥珀酰亚胺基、对硝基苯基或五氟苯基。)
[3]根据上述[1]或[2]所述的组合物，其中，上述高分子化合物的重均分子量为1,000～1,000,000。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的组合物，其中，上述溶剂为极性溶剂。
[5]一种纤维的制造方法，包括将上述[1]～[4]中任一项所述的组合物进行纺丝的工序。
[6]根据上述[5]所述的方法，其中，上述纺丝为静电纺丝。
[7]根据上述[5]或[6]所述的方法，其中，包括在70～300℃的范围内对经纺丝而得的纤维进行加热的工序。
[8]根据上述[5]～[7]中任一项所述的方法，其中，还包括将细胞粘附物质固定化的工序。
[9]一种纤维，其是通过上述[5]～[8]中任一项所述的方法制造的。
[10]一种细胞培养支架材料，包含上述[9]所述的纤维。
发明的效果
根据本发明，可提供下述纤维制造用组合物、将该组合物进行纺丝而得到的纤维、以及使用该纤维的细胞培养支架材料，所述纤维制造用组合物用于制造能够将对细胞的粘附·增殖·分化等有效的物质固定化、并且保持耐有机溶剂性、耐液体培养基性的纤维。通过将对细胞的粘附·增殖·分化等有效的物质固定化，所述纤维可呈现出作为细胞培养支架材料的更优异的功能。
附图说明
[图1]为将通过静电纺丝法由实施例1的纤维制造用组合物得到的纤维于180℃加热处理10分钟之后的SEM照片。
[图2]为将通过静电纺丝法由实施例4的纤维制造用组合物得到的纤维于80℃加热处理24小时之后的SEM照片。
[图3]为将通过静电纺丝法由实施例4的纤维制造用组合物得到的纤维于180℃加热处理30分钟之后的SEM照片。
[图4]为将通过静电纺丝法由实施例1的纤维制造用组合物得到的纤维于180℃加热处理10分钟之后、在乙醇中浸渍处理10秒后的SEM照片。
[图5]为将通过静电纺丝法由实施例4的纤维制造用组合物得到的纤维于80℃加热处理24小时之后、在乙醇中浸渍处理10秒后的SEM照片。
[图6]为将通过静电纺丝法由实施例4的纤维制造用组合物得到的纤维于180℃加热处理30分钟之后、在乙醇中浸渍处理10秒后的SEM照片。
[图7]为将通过静电纺丝法由实施例5的纤维制造用组合物得到的纤维于80℃加热处理24小时之后、在乙醇中浸渍处理10秒后的SEM照片。
[图8]为将通过静电纺丝法由比较例2的纤维制造用组合物得到的纤维于80℃加热处理24小时之后、在乙醇中浸渍处理10秒后的SEM照片。
[图9]为将通过静电纺丝法由比较例4的纤维制造用组合物得到的纤维于180℃加热处理10分钟之后、在乙醇中浸渍处理10秒后的SEM照片。
[图10]为将通过静电纺丝法由实施例4的纤维制造用组合物得到的纤维于180℃加热处理30分钟之后、在液体培养基中浸渍处理7天后的SEM照片。
[图11]为将通过静电纺丝法由比较例1的纤维制造用组合物得到的纤维于180℃加热处理10分钟之后、在液体培养基中浸渍处理7天后的SEM照片。
具体实施方式
1.纤维制造用组合物
本发明的纤维制造用组合物(以下，也称为“本发明的组合物”)的主要特征在于含有：(A)包含通式(1)表示的单元结构及通式(2)表示的单元结构的高分子化合物，(B)交联剂，(C)酸化合物，以及(D)溶剂。
[成分A]
本发明的组合物含有作为成分A的、包含通式(1)表示的单元结构及通式(2)表示的单元结构的高分子化合物(下文中亦称为“成分A的高分子化合物”或简称为“成分A”)。成分A中所含的通式(1)表示的单元结构在侧链上具有羟基，因此，通过将成分A与交联剂及酸化合物一同纺丝，羟基彼此介由交联剂而发生交联反应，由此高分子化合物彼此交联，可得到具有耐有机溶剂性的纤维。另外，成分A中所含的通式(2)表示的单元结构在侧链上具有活性酯基，因此，通过与任意的胺(蛋白质、肽、有机胺等)的亲核加成反应，能够将对细胞的粘附·增殖·分化等有效的物质(细胞粘附物质)固定化。通式(2)表示的单元结构的活性酯基与任意的胺的反应可在纤维制造用组合物的制备时进行，也可在进一步将纤维制造用组合物纺丝之后、加热处理之后进行。
(式(1)中，
R1表示氢原子或甲基，
Q1表示酯键或酰胺键，
R2表示至少1个氢原子被羟基取代的碳原子数为1～10的烷基或碳原子数为6～10的芳香族烃基。)
(式(2)中，
R3表示氢原子或甲基，
Q2表示活性酯基。)
以下详述通式(1)及通式(2)中的各基团的定义。
R1表示氢原子或甲基。
Q1表示酯键或酰胺键，从成分A的高分子化合物在溶剂中的溶解性的观点考虑，优选为酯键。
Q2表示活性酯基。在本发明中，“活性酯基”是指在酯基的一侧具有吸电子性的取代基、由此羰基被活化的(易于受到亲核攻击的)酯基，具体而言，为通式(5)表示的酯基。
式(5)中，Q3表示形成活性酯基的一价有机基团(吸电子性基团)，作为其具体例，可举出N-琥珀酰亚胺基、对硝基苯基及五氟苯基，但从细胞亲和性的观点考虑，优选为N-琥珀酰亚胺基。
R2表示至少1个氢原子被羟基取代的碳原子数为1～10的烷基或碳原子数为6～10的芳香族烃基。该碳原子数为1～10的烷基可以为直链状或支链状中的任意状，作为其具体例，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1-乙基丙基、己基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、辛基、壬基、癸基等。该烷基的碳原子数优选为1～6，更优选为1～4。
另外，作为R2中的至少1个氢原子被羟基取代的碳原子数为6～10的芳香族烃基的“碳原子数为6～10的芳香族烃基”，例如可举出苯基、1-萘基、2-萘基等。
从纤维制造时的交联反应效率、所制造的纤维的细胞亲和性的观点考虑，R2优选为至少1个氢原子被羟基取代的碳原子数为1～10(更优选为1～6，特别优选为1～4)的烷基或至少1个氢原子被羟基取代的苯基。
R3表示氢原子或甲基。
对于通式(1)表示的单元结构而言，优选的是，R1为氢原子或甲基，Q1为酯键，R2为至少1个氢原子被羟基取代的碳原子数为1～10(更优选为1～6，特别优选为1～4)的烷基或至少1个氢原子被羟基取代的苯基。
通式(1)表示的单元结构优选为通式(3)表示的单元结构。
[式(3)中，R4与上述R1的含义相同，R5与上述R2的含义相同。]
通式(2)表示的单元结构优选为通式(4)表示的单元结构。
[式(4)中，R6为氢原子或甲基。]
在成分A的高分子化合物中，对于通式(1)表示的单元结构的组成比和通式(2)表示的单元结构的组成比而言，从合成的容易程度、在溶剂中的溶解性、纤维形成的容易程度、将任意的胺固定化时的效果的观点考虑，优选(通式(1)表示的单元结构)/(通式(2)表示的单元结构)＝(35～95摩尔％)/(5～65摩尔％)。这些单元结构的组成比通过13C-NMR测定。
对于成分A的高分子化合物而言，只要不损害本发明的目的，则也可包含通式(1)表示的单元结构及通式(2)表示的单元结构以外的单元结构，但从成分A的高分子化合物的聚合性的观点考虑，相对于成分A的高分子化合物的全部单元结构，通式(1)表示的单元结构的比例(摩尔％)优选为35～95摩尔％，通式(2)表示的单元结构的比例(摩尔％)优选为5～65摩尔％。另外，从成分A的高分子化合物的聚合性的观点考虑，相对于成分A的高分子化合物的全部单元结构，通式(1)表示的单元结构的比例和通式(2)表示的单元结构的比例的合计(摩尔％)优选大于90摩尔％，更优选为95摩尔％以上，特别优选为100摩尔％。各单元结构相对于成分A的高分子化合物的全部单元结构的比例可由通过13C-NMR测定的各单元结构的组成比算出。
从使用了上述组合物的纤维的耐有机溶剂性的观点考虑，成分A的重均分子量优选为1,000～1,000,000的范围，更优选为5,000～500,000的范围,特别优选为10,000～300,000的范围。本发明中，“重均分子量”是指利用凝胶渗透色谱法(GPC)测定的换算为聚苯乙烯的分子量。
成分A可以通过本身已知的方法或以其为基准的方法来制造。例如，可以通过在适当的溶剂(例如，乙腈等)中、使用适当的聚合引发剂(例如，2,2’-偶氮双(异丁酸)二甲酯等)将与通式(1)表示的单元结构相对应的单体和与通式(2)表示的单元结构相对应的单体聚合等进行制造，但并不限定于此。也可以使用市售品。
作为与通式(1)表示的单元结构相对应的单体，例如可举出(甲基)丙烯酸-2-羟基乙酯(例如，CAS号：868-77-9的化合物)、(甲基)丙烯酸-2-羟基丙酯(例如，CAS号：923-26-2的化合物)、(甲基)丙烯酸-4-羟基丁酯(例如，CAS号：2478-10-6的化合物)、N-羟甲基(甲基)丙烯酰胺(例如，CAS号：923-02-4的化合物)、N-(2-羟乙基)(甲基)丙烯酰胺(例如，CAS号：5238-56-2的化合物)、N-(2-羟丙基)(甲基)丙烯酰胺(例如，CAS号：26099-09-2的化合物)、对羟基(甲基)丙烯酰苯胺(p-hydroxy(meth)acrylic anilide)(例如，CAS号：19243-95-9的化合物)等，优选为(甲基)丙烯酸-2-羟基乙酯或(甲基)丙烯酸-2-羟基丙酯，最优选为(甲基)丙烯酸-2-羟基丙酯。
需要说明的是，本发明中，“(甲基)丙烯酸酯化合物”是指丙烯酸酯化合物和甲基丙烯酸酯化合物两者。例如，(甲基)丙烯酸是指丙烯酸和甲基丙烯酸两者。
作为与通式(2)表示的单元结构相对应的单体，优选为(甲基)丙烯酸对硝基苯基酯(例如，CAS号：16522-41-1的化合物)、(甲基)丙烯酸五氟苯基酯(例如，CAS号：13642-97-2的化合物)、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(CAS号：38862-24-7的化合物)、甲基丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯(CAS号：38862-25-8的化合物)，最优选为甲基丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯。
从制造具有适度粗细的纤维的观点考虑，本发明的组合物中的成分A的含有比例优选为5～50重量％，更优选为10～40重量％。
[成分B]
本发明的组合物含有作为成分B的交联剂(下文中亦称为“成分B的交联剂”或简称为“成分B”)。对于成分B而言，通过与后述的成分C并用，使得成分A的羟基彼此介由成分B自身而进行交联，由此可对纤维赋予耐有机溶剂性。
作为成分B的交联剂，例如可举出1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、1,3,4,6-四(丁氧基甲基)甘脲等氨基塑料(aminoplast)交联剂；2,2-双(4-羟基-3,5-二羟甲基苯基)丙烷等酚醛塑料(phenoplast)交联剂；1,6-己二异氰酸酯等异氰酸酯交联剂；1,4-双(乙烯氧基)丁烷等乙烯基醚交联剂；等。
成分B优选为氨基塑料交联剂，优选为1,3,4,6-四(羟甲基)甘脲(CAS号：5395-50-6)、1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲(CAS号：17464-88-9)、1,3,4,6-四(乙氧基甲基)甘脲(CAS号：65952-06-9)、1,3,4,6-四(1-甲基乙氧基)甘脲(CAS号：508220-69-7)、1,3,4,6-四(1,1-二甲基乙氧基)甘脲(CAS号：547744-08-1)或1,3,4,6-四(丁氧基甲基)甘脲(CAS号：15968-37-3)，更优选为1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲。
成分B可以单独使用，也可以并用2种以上。
成分B的交联剂可以通过本身已知的方法或以其为基准的方法来制造。此外，也可以使用市售品。
从与成分A的反应效率的观点考虑，本发明的组合物中的成分B的含有比例优选为0.1～5重量％，更优选为0.2～3重量％。
从制造纤维时的反应效率的观点考虑，本发明的组合物中含有的成分A和成分B的重量比(成分A的重量/成分B的重量)优选为5～65，更优选为5～25。
[成分C]
本发明的组合物含有作为成分C的酸化合物(下文中亦称为“成分C的酸化合物”或简称为“成分C”)。该酸化合物也可以为盐的形态，即，本发明中记为“酸化合物”的术语是也包含盐的概念。对于成分C而言，通过与成分B并用，从而在成分A的羟基彼此介由成分B而进行交联反应时，可以促进该交联反应。
作为成分C的酸化合物，例如可举出磺酸化合物、羧酸化合物等有机酸化合物；盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、氢溴酸等无机酸化合物等。
成分C优选为有机酸化合物，更优选为磺酸化合物。作为磺酸化合物，例如可举出对甲苯磺酸、对甲苯磺酸吡啶鎓(pyridinium p-toluenesulfonate)、三氟甲磺酸等，优选为对甲苯磺酸或对甲苯磺酸吡啶鎓。
成分C可以单独使用，也可以并用2种以上。
成分C的酸化合物可以通过本身已知的方法或以其为基准的方法来制造。此外，也可以使用市售品。
从交联反应速度、交联反应效率的观点考虑，本发明的组合物中的成分C的含有比例优选为0.01～1.0重量％，更优选为0.05～0.5重量％，特别优选为0.07～0.4重量％。
从交联反应速度、交联反应效率的观点考虑，本发明的组合物中含有的成分A和成分C的重量比(成分A的重量/成分C的重量)优选为20～120，更优选为80～115。
[成分D]
本发明的组合物含有作为成分D的溶剂(下文中亦称为“成分D的溶剂”或简称为“成分D”)。
成分D的溶剂只要能至少将上述成分A～C均匀地溶解或分散、且不与各成分反应即可，不受特别限制，但从成分A～C的溶解性的观点考虑，优选为极性溶剂。
作为该极性溶剂，例如可举出水、甲醇、乙醇、2-丙醇、丙二醇单甲基醚、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等，为了实现组合物的纺丝容易性，优选丙酮与二甲基乙酰胺的混合溶剂，其优选的混合比率(重量％)为：丙酮/二甲基乙酰胺＝(90重量％～60重量％)/(10重量％～40重量％)。
成分D可以单独使用，也可以并用2种以上。
只要不明显损害本发明的目的，则本发明的组合物除了含有成分A～D以外，还可以根据需要含有通常用于纤维制造用组合物中的添加剂。作为该添加剂，例如可举出表面活性剂、流变调节剂、药剂、微粒等。
本发明的组合物可通过将上述成分A～D、或将成分A～D及上述添加剂混合而制备。混合方法不受特别限制，可通过本身已知的方法或以其为基准的方法进行混合。
本发明的组合物可用于制造纤维。使用本发明的组合物制造的纤维的种类不受特别限制，例如，用于生物相容性材料(例如，细胞培养支架材料等)等时，优选纳米纤维、微米级纤维(microfiber)等，更优选纳米纤维。本发明中，所谓“纳米纤维”，是指具有纳米量级(例如，1～1000nm)的直径的纤维，此外，所谓“微米级纤维”，是指具有微米量级(例如，1～1000μm)的直径的纤维。
可根据纤维的用途等对使用本发明的组合物形成的纤维的直径进行适当的调整，但从本发明的组合物的浓度、及纺丝的容易程度的观点考虑，优选为1～1000nm，更优选为10～1000nm。本发明中，纤维的直径利用扫描电子显微镜(SEM)进行测定。
2.纤维的制造方法，通过该制造方法制造的纤维
本发明的纤维的制造方法(下文中亦称为“本发明的方法”)的主要特征在于，包括将本发明的组合物进行纺丝的工序。
本发明的组合物的纺丝方法只要能够形成纤维即可，不受特别限制，例如，可举出熔喷法、复合熔融纺丝法、静电纺丝法等，从纤维形成能力的观点考虑，优选静电纺丝法。
静电纺丝法是已知的纺丝方法，可使用已知的静电纺丝装置进行。下述各种条件可根据欲制造的纤维的直径等进行适宜设定：将本发明的组合物从喷嘴(例如，喷针(needle)等)的前端喷出的速度(喷出速度)；施加电压；从将本发明的组合物喷出的喷嘴的前端到接受本发明的组合物的基板之间的距离(喷出距离)等。喷出速度通常为0.1～100μl/min，优选为0.5～50μl/min，更优选为1～20μl/min。施加电压通常为0.5～80kV，优选为1～60kV，更优选为3～40kV。喷出距离通常为1～60cm，优选为2～40cm，更优选为3～30cm。
对于本发明的方法而言，优选地，在将本发明的组合物进行纺丝之后，进一步包括以特定的温度对该经纺丝而得的纤维进行加热的工序。通过以特定的温度对经纺丝而得的纤维进行加热，能够使其呈现出更优异的耐有机溶剂性。
对经纺丝而得的纤维进行加热的温度通常为70～300℃的范围，从成分B的交联剂的反应性、及成分A的高分子化合物的耐热性的观点考虑，优选为80～250℃，更优选为90～200℃。该温度低于70℃时，成分A彼此的交联反应不充分，存在所制造的纤维的耐有机溶剂性变低的倾向；该温度高于300℃时，成分A的高分子化合物自身发生热致分解或溶解等，无法形成纤维。
关于对经纺丝而得的纤维的加热方法，只要能以上述的加热温度进行加热即可，不受特别限制，可以通过本身已知的方法或以其为基准的方法适宜加热。作为该加热方法的具体例，可举出在大气下使用加热板或烘箱等的方法等。
对经纺丝而得的纤维进行加热的时间可根据加热温度等进行适宜设定，但从交联反应速度、生产效率的观点考虑，优选为1分钟～48小时，更优选为5分钟～36小时，特别优选为10分钟～24小时。
通过本发明的方法制造的纤维(下文中亦称为“本发明的纤维”)的种类不受特别限制，例如，用于生物相容性材料(例如，细胞培养支架材料等)等时，优选纳米纤维、微米级纤维等，更优选纳米纤维。
本发明的纤维的直径可根据纤维的用途等进行适宜调整，例如，作为细胞培养支架材料使用时，从细胞培养效率的观点考虑，优选为1～1000nm，更优选为10～1000nm。
本发明的纤维的用途不受特别限制，如后述的实施例所示，本发明的纤维具有优异的耐有机溶剂性，并且具有充分的作为细胞培养支架的功能，所以适合于细胞培养支架材料。
对细胞的粘附·增殖·分化等有效的担载物质(细胞粘附物质)，可以通过存在于本发明的纤维中的活性酯基、与细胞粘附物质的反应而固定化于上述纤维上。
活性酯基在中性条件下与游离的伯氨基反应。关于伯胺的碱性，烷基胺比芳香族胺强，烷基胺更适合于与活性酯基的反应。当蛋白质及肽介由它们的氨基而以共价键的方式加成到纤维上时，必须为在水系中的反应；当反应溶液的pH为中性至弱碱性区域时，或反应温度为冰冷却条件下至37℃左右时，在短时间内进行反应。在水溶性低的伯胺的情况下，优选溶解在乙醇、二甲基亚砜等有机溶剂中而进行反应。
优选的反应条件为0℃～37℃下1～48小时，更优选为0℃～37℃下1～24小时。
作为可固定化于本发明的纤维的物质(细胞粘附物质)，例如可举出蛋白质、生理活性物质及化合物等。作为所述蛋白质，例如可举出癌胚抗原、扁平上皮癌相关抗原、细胞角蛋白19片段、唾液酸化糖链抗原KL-6、利尿钠肽、肌钙蛋白、肌红蛋白等疾病标记物、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-14(IL-14)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、单核细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、flk2/flt3配体(FL)、白血病细胞抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OM)、促红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子1、2、3、4、5、6、7、8、或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神经细胞生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、蛋白酶连接蛋白(protease nexin)I、蛋白酶连接蛋白II、血小板衍生生长因子(PDGF，platelet-derived growth factorreceptor)、胆碱能分化因子(CDF)、趋化因子、Notch配体(Delta1等)、Wnt蛋白质、血管生成素样蛋白2、3、5或7(Angpt2、3、5、7)、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白质(IGFBP)、多效蛋白(Pleiotrophin)、胰岛素、生长激素等细胞生长因子、以及胶原I至XIX、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白-1至12、层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、nitogen(日文：ニᅡジェン)、腱生蛋白、血小板反应蛋白、血管性血友病因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白多糖、各种钙黏蛋白(cadherin)、桥粒胶蛋白(desmocolin)、桥粒芯蛋白、各种整联蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白、L-选择蛋白、免疫球蛋白超家族、基质胶(Matrigel)、多聚-D-赖氨酸、多聚-L-赖氨酸等细胞粘附因子、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等各种抗体等。
作为所述生理活性物质，例如可举出D-氨基葡萄糖、D-半乳糖胺、神经氨酸、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素等糖类、血清素、去甲肾上腺素、肾上腺素、3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲(DCMU)、莠去津、利谷隆及西玛津等。
作为上述化合物，例如可举出血管紧张素I至IV、缓激肽、血纤肽、利尿钠肽、尿扩张素、鸟苷肽、内皮素1至3、salusin、硬骨鱼紧张肽(urotensin)、催产素、后叶激素运载蛋白、抗利尿激素、促肾上腺皮质激素、黑色素细胞刺激素、内啡肽、促脂素、尿皮素(urocortin)1至3、促黄体生成素释放激素、生长激素释放激素、生长激素抑制素、皮质醇稳定蛋白(cortistatin)、催乳素释放肽、转移抑素(metastin)、速激肽、P物质、神经激肽、endokinin、神经降压素、神经调节肽(neuromedin)、爱森藻肽(日文：ゼニン)、生长素释放肽(ghrelin)、肥胖抑制素(obestatin)、黑色素浓缩激素、食欲肽、神经肽、强啡肽、新内啡肽、内吗啡肽、伤害感受肽(nociceptin)、焦谷氨酰化RF酰胺肽、甘丙肽、胃泌激素、缩胆囊素、胰泌素(secretin)、松弛肽、胰高血糖素、肠高血糖素、肾上腺髓质素、香树素、降钙素、甲状旁腺激素、防御素、胸腺素、YIGSR肽等肽；丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、胱氨酸、羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、二羟基苯丙氨酸、甲状腺素、磷酸丝氨酸、锁链素、β-丙氨酸、肌氨酸、鸟氨酸、肌酸、γ-氨基丁酸、茶氨酸(theanine)、红藻氨酸、软骨藻酸、鹅膏蕈氨酸等氨基酸；2-二甲基氨基乙基胺(CAS号：108-00-9的化合物)、N-(2-羟乙基)乙二胺(CAS号：111-41-1的化合物)、N-(2-氨基乙基)哌嗪(CAS号：140-31-8的化合物)、4-(2-氨基乙基)吗啉(CAS号：2038-03-1的化合物)、1-(2-氨基乙基)-2-咪唑烷酮(CAS号：6281-42-1的化合物)、色胺(CAS号：61-54-1的化合物)、组胺二盐酸盐(CAS号：56-92-8的化合物)、酪胺(CAS号：51-67-2的化合物)、多巴胺(CAS号：51-61-6的化合物)等伯胺；乙二胺二盐酸盐(CAS号：333-18-6的化合物)、1,6-二氨基己烷(CAS号：124-09-4的化合物)、N,N’-双(氨基丙基)哌嗪(CAS号：7209-38-3的化合物)的伯二胺等。
其中，特别优选的细胞粘附物质为层粘连蛋白511、层粘连蛋白521或YIGSR肽。
3.细胞培养支架材料
本发明的细胞培养支架材料的主要特征在于包含本发明的纤维。本发明中，“细胞培养支架材料”是指不对细胞产生不良影响、可进行细胞培养的材料。
对于本发明的细胞培养支架材料而言，例如可举出在玻璃、金属、及聚苯乙烯这样的塑料上吹喷本发明的纤维而得到的细胞培养基材(例如，6孔平底微孔板等)、导入了本发明的纤维的培养袋等。此外，通过介由活性酯基而固定化的物质(细胞粘附物质)，可促进细胞增殖、诱导细胞分化等。
关于使用本发明的细胞培养支架材料培养的细胞，没有特别限制，例如可举出成纤维细胞、骨髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、骨髓细胞、周细胞、树突状细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经系统细胞、神经胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、心脏细胞、食道细胞、肌细胞(例如，平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、胰腺β细胞、黑色素细胞、造血前体细胞、单核细胞、胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎肿瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工多能干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质系干细胞、肝干细胞、胰干细胞、肌肉干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞、及各种细胞株(例如，HCT116、Huh7、HEK293(人胚胎肾细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞株)、HepG2(人肝癌细胞株)、UT7/TPO(人白血病细胞株)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、HT-29、AE-1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five、Vero)等。
对于本发明的细胞培养支架材料而言，可使用本发明的纤维作为原材料的一种，通过本身已知的方法或以其为基准的方法来制造。
实施例
以下，说明本发明涉及的具体例，但本发明不受其任何限定。
[高分子化合物1～6的重均分子量的测定]
下述高分子化合物1～6的重均分子量利用凝胶渗透色谱法(GPC)进行测定。测定中使用的装置、测定条件如下所述。
装置：TOSOH HLC-8320GPC系统
色谱柱：Shodex(注册商标)KF-803L、KF-802及KF-801
柱温：40℃
洗脱液：DMF
流速：0.6ml/分钟
检测器：RI
标准样品：聚苯乙烯
[成分A的高分子化合物的13C-NMR测定]
下述成分A的高分子化合物的单元结构的组成比通过13C-NMR进行测定。测定及分析中使用的装置、条件如下所述。
装置：日本电子株式会社JNM-ECA500、Delta V5.0
测定核：13C门控去耦
累积次数：18000
测定温度：室温
检测峰：69～71ppm(来源于HPMA)、
25～27ppm(来源于NSuMA)
测定溶剂：氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、750uL
样品量：0.1g
弛豫试剂：乙酰丙酮铬(III)、4mg
<合成例(高分子化合物1～6的合成)>
(合成例1：高分子化合物1)
将10.5g的甲基丙烯酸-2-羟基丙酯(HPMA；东京化成工业株式会社制)、1.5g的甲基丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯(NSuMA；东京化成工业株式会社制)、及0.01g的2,2’-偶氮双(异丁酸)二甲酯(MAIB；和光纯药工业株式会社制)溶解在28.3g的乙腈中，在氮气气氛下，滴加至经加热回流的20.2g乙腈中。滴加结束后，在保持加热回流的同时反应17小时。然后，向该反应混合液中添加乙醚从而使聚合物析出。过滤得到聚合物后，在减压下进行干燥，由此得到7.71g高分子化合物1。该高分子化合物1的重均分子量以聚苯乙烯换算计为217,000。通过13C-NMR测定的组成比为HPMA/NSuMA＝91摩尔％/9摩尔％。
(合成例2：高分子化合物2)
将10.6g的甲基丙烯酸-2-羟基丙酯(HPMA；东京化成工业株式会社制)、1.5g的甲基丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯(NSuMA；东京化成工业株式会社制)、及0.72g的2,2’-偶氮双(异丁酸)二甲酯(MAIB；和光纯药工业株式会社制)溶解在30.0g的乙腈中，在氮气气氛下，滴加至经加热回流的21.4g乙腈中。滴加结束后，在保持加热回流的同时反应17小时。然后，向该反应混合液中添加乙醚从而使聚合物析出。过滤得到聚合物后，在减压下进行干燥，由此得到12.0g高分子化合物2。该高分子化合物2的重均分子量以聚苯乙烯换算计为13,000。通过13C-NMR测定的组成比为HPMA/NSuMA＝92摩尔％/8摩尔％。
(合成例3：高分子化合物3)
将33.0g的甲基丙烯酸-2-羟基丙酯(HPMA；东京化成工业株式会社制)、18.0g的甲基丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯(NSuMA；东京化成工业株式会社制)、及0.05g的2,2’-偶氮双(异丁酸)二甲酯(MAIB；和光纯药工业株式会社制)溶解在119.2g的乙腈中，在氮气气氛下，滴加至经加热回流的85.2g乙腈中。滴加结束后，在保持加热回流的同时反应17小时。然后，将该反应混合液浓缩至100ml左右的量，添加乙醚从而使聚合物析出。过滤得到聚合物后，在减压下进行干燥，由此得到36.0g高分子化合物3。该高分子化合物3的重均分子量以聚苯乙烯换算计为182,000。通过13C-NMR测定的组成比为HPMA/NSuMA＝62摩尔％/38摩尔％。
(合成例4：高分子化合物4)
将8.3g的甲基丙烯酸-2-羟基丙酯(HPMA；东京化成工业株式会社制)、7.0g的甲基丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯(NSuMA；东京化成工业株式会社制)、及0.01g的2,2’-偶氮双(异丁酸)二甲酯(MAIB；和光纯药工业株式会社制)溶解在35.7g的乙腈中，在氮气气氛下，滴加至经加热回流的25.5g乙腈中。滴加结束后，在保持加热回流的同时反应17小时。然后，向该反应混合液中添加乙醚从而使聚合物析出。过滤得到聚合物后，在减压下进行干燥，由此得到11.0g高分子化合物4。该高分子化合物4的重均分子量以聚苯乙烯换算计为265,000。通过13C-NMR测定的组成比为HPMA/NSuMA＝50摩尔％/50摩尔％。
(合成例5：高分子化合物5)
将5.5g的甲基丙烯酸-2-羟基丙酯(HPMA；东京化成工业株式会社制)、7.0g的甲基丙烯酸-N-琥珀酰亚胺酯(NSuMA；东京化成工业株式会社制)、及0.01g的2,2’-偶氮双(异丁酸)二甲酯(MAIB；和光纯药工业株式会社制)溶解在29.2g的乙腈中，在氮气气氛下，滴加至经加热回流的20.9g乙腈中。滴加结束后，在保持加热回流的同时反应17小时。然后，向该反应混合液中添加乙醚从而使聚合物析出。过滤得到聚合物后，在减压下进行干燥，由此得到8.9g高分子化合物5。该高分子化合物5的重均分子量以聚苯乙烯换算计为113,000。通过13C-NMR测定的组成比为HPMA/NSuMA＝37摩尔％/63摩尔％。
(合成例6：高分子化合物6)
将10.0g的甲基丙烯酸甲酯(MMA；东京化成工业株式会社制)、及0.01g的2,2’-偶氮双(异丁酸)二甲酯(MAIB；和光纯药工业株式会社制)溶解在23.4g的乙腈中，在氮气气氛下，滴加至经加热回流的16.7g乙腈中。滴加结束后，在保持加热回流的同时反应17小时。然后，向该反应混合液中添加乙醚从而使聚合物析出。过滤得到聚合物后，在减压下进行干燥，由此得到5.3g高分子化合物6。该高分子化合物6的重均分子量以聚苯乙烯换算计为230,000。
对于所述高分子化合物1～5，将在聚合反应后成为均匀的高分子溶液的情况评价为“良好”，将在聚合反应后未成为均匀的高分子溶液的情况评价为“不良”，汇总于表1。
[表1]
<实施例(纤维制造用组合物(溶液)的制备)>
(实施例1)
将0.50g高分子化合物1、0.03g的1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、0.005g的对甲苯磺酸吡啶鎓、0.49g二甲基乙酰胺、及1.48g丙酮混合后，使用混合转子(mix rotor)VMR-5(AS ONE Corporation制)以100rpm搅拌至溶解，得到实施例1的纤维制造用组合物。实施例1的纤维制造用组合物中的高分子化合物1的含有比例为约20重量％。
(实施例2)
将0.70g高分子化合物2、0.04g的1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、0.007g的对甲苯磺酸吡啶鎓、0.31g二甲基乙酰胺、及0.94g丙酮混合后，使用混合转子VMR-5(AS ONECorporation制)以100rpm搅拌至溶解，得到实施例2的纤维制造用组合物。实施例2的纤维制造用组合物中的高分子化合物2的含有比例为约35重量％。
(实施例3)
将0.23g高分子化合物3、0.01g的1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、0.002g的对甲苯磺酸吡啶鎓、0.50g二甲基乙酰胺、及1.52g丙酮混合后，使用混合转子VMR-5(AS ONECorporation制)以100rpm搅拌至溶解，得到实施例3的纤维制造用组合物。实施例3的纤维制造用组合物中的高分子化合物3的含有比例为约10重量％。
(实施例4)
将0.60g高分子化合物3、0.03g的1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、0.006g的对甲苯磺酸吡啶鎓、0.59g二甲基乙酰胺、及1.77g丙酮混合后，使用混合转子VMR-5(AS ONECorporation制)以100rpm搅拌至溶解，得到实施例4的纤维制造用组合物。实施例4的纤维制造用组合物中的高分子化合物3的含有比例为约20重量％。
(实施例5)
将0.40g高分子化合物3、0.06g的1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、0.004g的对甲苯磺酸吡啶鎓、0.38g二甲基乙酰胺、及1.15g丙酮混合后，使用混合转子VMR-5(AS ONECorporation制)以100rpm搅拌至溶解，得到实施例5的纤维制造用组合物。实施例5的纤维制造用组合物中的高分子化合物3的含有比例为约20重量％。
(实施例6)
将0.50g高分子化合物4、0.03g的1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、0.005g的对甲苯磺酸吡啶鎓、0.49g二甲基乙酰胺、及1.48g丙酮混合后，使用混合转子VMR-5(AS ONECorporation制)以100rpm搅拌至溶解，得到实施例6的纤维制造用组合物。实施例6的纤维制造用组合物中的高分子化合物4的含有比例为约20重量％。
(实施例7)
将0.50g高分子化合物5、0.03g的1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、0.005g的对甲苯磺酸吡啶鎓、0.49g二甲基乙酰胺、及1.48g丙酮混合后，使用混合转子VMR-5(AS ONECorporation制)以100rpm搅拌至溶解，得到实施例7的纤维制造用组合物。实施例7的纤维制造用组合物中的高分子化合物5的含有比例为约20重量％。
(比较例1)
将0.70g高分子化合物3、0.007g的对甲苯磺酸吡啶鎓、0.70g二甲基乙酰胺、及2.09g丙酮混合后，使用混合转子VMR-5(AS ONE Corporation制)以100rpm搅拌至溶解，得到比较例1的纤维制造用组合物。比较例1的纤维制造用组合物中的高分子化合物3的含有比例为约20重量％。
(比较例2)
将0.70g高分子化合物3、0.035g的1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲、0.69g二甲基乙酰胺、及2.07g丙酮混合后，使用混合转子VMR-5(AS ONE Corporation制)以100rpm搅拌至溶解，得到比较例2的纤维制造用组合物。比较例2的纤维制造用组合物中的高分子化合物3的含有比例为约20重量％。
(比较例3)
将0.70g高分子化合物3、0.70g二甲基乙酰胺、及2.10g丙酮混合后，使用混合转子VMR-5(AS ONE Corporation制)以100rpm搅拌至溶解，得到比较例3的纤维制造用组合物。比较例3的纤维制造用组合物中的高分子化合物3的含有比例为约20重量％。
(比较例4)
将0.26g高分子化合物6、0.003g的对甲苯磺酸吡啶鎓、1.70g二甲基乙酰胺、及0.96g丙酮混合后，使用混合转子VMR-5(AS ONE Corporation制)以100rpm搅拌至溶解，得到比较例4的纤维制造用组合物。比较例4的纤维制造用组合物中的高分子化合物6的含有比例为约8.9重量％。
实施例1～7、比较例1～4的纤维制造用组合物的构成示于表2-1及2-2。
[表2-1]
[表2-2]
注)PL-LI：1,3,4,6-四(甲氧基甲基)甘脲；PyPTS：对甲苯磺酸吡啶鎓；DMAc：二甲基乙酰胺
[利用静电纺丝法进行的纤维的制造]
在下述试验例1～4中，使用Esprayer ES-2000(Fuence Co.,Ltd.制)，利用静电纺丝法实施纤维的制造。将纤维制造用组合物注入1ml的锁式(lock-type)玻璃注射器(ASONE Corporation制)中，并安装针长为13mm的锁式金属制喷针24G(Musashi engineering,Inc.制)。从喷针前端到接受纤维的基板之间的距离(喷出距离)为20cm。施加电压为25kV，喷出速度为10μl/min。
[纤维形态的确认方法]
在下述试验例1～4中，纤维形态的确认通过下述方法进行：利用离子溅射仪(E-1030，Hitachi High-Technologies Corporation制)在纤维上进行1分钟的Pt-Pd蒸镀后，使用扫描电子显微镜(SEM)(S-4800，Hitachi High-Technologies Corporation制)以10,000倍的放大倍率进行观察。
纤维形态得以维持时，评价为“良好”，没有维持纤维形态时，评价为“不良”。
[纤维直径的测定方法]
在下述试验例1～4中，纤维直径(纤维的粗细)的测定通过下述方法进行：使用扫描电子显微镜(SEM)(S-4800，Hitachi High-Technologies Corporation制)，拍摄放大倍率为10,000倍的图像并保存后，使用附带的长度测量工具进行。
＜试验例1：加热处理及溶剂耐性试验＞
将实施例1～7及比较例1～4的纤维制造用组合物在制备后立即利用静电纺丝法在铝箔上进行纺丝，然后以表3所示的条件对得到的纤维实施加热处理，对加热处理后的纤维形态进行确认。结果示于表3。
将实施例1～7及比较例1～4的纤维制造用组合物在制备后立即利用静电纺丝法在铝箔上进行纺丝，然后将以表4所示的条件进行了加热处理的纤维在乙醇中浸渍10秒钟，然后再次确认纤维形态，并测定纤维直径。结果示于表4。
将实施例4及比较例1～3的纤维制造用组合物在制备后立即利用静电纺丝法在铝箔上进行纺丝，然后将以表5所示的条件进行了加热处理的纤维在作为液体培养基的ISCOVE’S MODIFIED DULBECCO’S MEDIUM(Sigama corporation制)中浸渍7天，然后，经过水洗及乙醇清洗，再次确认纤维形态，并测定纤维直径。结果示于表5。
[表3]
(加热处理后的纤维形态)
[表4]
(加热处理→乙醇浸渍后的纤维形态及纤维直径)
[表5]
(加热处理→液体培养基浸渍后的纤维形态及纤维直径)
(纤维剥离；所形成的纤维从铝箔剥离消失。)
由表3的结果可知，使用实施例1～7及比较例1～4的纤维制造用组合物、通过静电纺丝法制造的纤维，在仅进行了加热处理的情况下，均为良好的形态，而与NSuMA/HPMA组成比、高分子化合物的分子量及高分子化合物的含量、以及交联剂的含量无关。
由表4的结果可知，使用实施例1～7的纤维制造用组合物制造的纤维，即便在加热处理后进一步在乙醇中浸渍10秒钟后，也显示出良好的形态。对于实施例7而言，虽然显示出良好的纤维形态，但观察到了宽范围的纤维直径。此外，由实施例4及实施例5的结果可知，即便加热处理中的加热温度为80℃，也显示出良好的纤维形态。
由表5的结果可知，使用实施例4的纤维制造用组合物制造的纤维，即便在细胞培养用液体培养基中浸渍7天后，也显示出良好的纤维形态。
即，在将本发明的纤维制造用组合物进行纺丝从而制造纤维的情况下，为了制成显示出良好的纤维形态、并且耐有机溶剂性及耐培养基性优异的纤维，优选以80℃以上的温度进行加热处理。
另外表明，在通过上述条件进行了静电纺丝的情况下，所制造的纤维的纤维直径取决于成分A的高分子化合物的重均分子量、和纤维制造用组合物中的成分A的高分子化合物的含有比例。因此，通过调整成分A的高分子化合物的重均分子量、及纤维制造用组合物中的成分A的高分子化合物的含有比例，可以得到所期望的纤维直径的纤维。
<试验例2：细胞培养评价1>
利用静电纺丝法将实施例1及比较例4的纤维制造用组合物进行纺丝后，在得到的纤维上进行了细胞培养评价。需要说明的是，下文中，CO2培养箱中的CO2的浓度(％)用气氛中的CO2的体积％表示。
[实施例1的纤维的制造]
利用静电纺丝法将实施例1的纤维制造用组合物进行纺丝，向玻璃基板上吹喷20分钟后，于180℃加热处理30分钟。作为玻璃基板，使用了微型盖玻片(Micro Cover Glass)(Matsunami Glass Ind.,Ltd.制)(Φ32mm，厚度为约0.5mm)。将得到的纤维用乙醇清洗并风干后，使用扫描电子显微镜(SEM)确认纤维形态。由实施例1的纤维制造用组合物得到的纤维的纤维直径为约430nm。
需要说明的是，下文中，为了方便起见，将对实施例1的纤维制造用组合物进行纺丝而形成了纤维的玻璃基板称为“实施例1的纤维基板”。
[比较例4的纤维的制造]
利用静电纺丝法将比较例4的纤维制造用组合物进行纺丝，向玻璃基板上吹喷20分钟后，于180℃加热处理10分钟。作为玻璃基板，使用了微型盖玻片(Matsunami GlassInd.,Ltd.制)(Φ32mm，厚度为约0.5mm)。将得到的纤维用乙醇清洗并风干后，使用扫描电子显微镜(SEM)确认纤维形态。由比较例4的纤维制造用组合物得到的纤维的纤维直径为约440nm。
需要说明的是，下文中，为了方便起见，将对比较例4的纤维制造用组合物进行纺丝而形成了纤维的玻璃基板称为“比较例4的纤维基板”。
[细胞的制备]
细胞使用了人胚胎肾细胞株HEK293(DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.制)。用于细胞培养的培养基使用了包含10％(v/v)FBS及1％(v/v)NEAA(Non-Essential AminoAcids，非必需氨基酸)(GIBCO公司制)的EMEM(Eagle’s Minimum Essential Medium，伊格尔氏最低限度必需介质)培养基(和光纯药工业株式会社制)。对于细胞，在37℃CO2培养箱内，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，使用直径为10cm的平皿(培养基10mL)静置培养2天以上。接着，使用10mL的PBS对该细胞进行清洗后，添加1mL的胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(和光纯药工业株式会社制)，将细胞剥离并悬浮于10mL上述培养基中。对该悬浮液进行离心分离(Tomy Seiko Co.,Ltd.制，LC-200，1000rpm/3分钟，室温)后，除去上清液，添加上述培养基从而制备细胞悬浮液。需要说明的是，PBS是指磷酸盐缓冲生理盐水(Sigma-Aldrich Japan制)，FBS是指胎牛血清(Biological Industries公司制)。
[基材的灭菌]
向6孔平底微孔板(AS ONE Corporation制)上配置实施例1的纤维基板、比较例4的纤维基板、及作为对照的未处理玻璃基板，添加2mL的70％乙醇，在室温下浸渍5分钟之后风干。
[细胞粘附物质的固定化]
向6孔平底微孔板上配置实施例1的纤维基板，添加2mL的70％乙醇，在室温下浸渍5分钟。将该溶液除去并风干后，向每1个孔中添加2mL的层粘连蛋白521(BioLamina株式会社制)/PBS溶液(20μg/mL)。在37℃培养箱中静置2小时而将层粘连蛋白固定化之后，除去溶液，每1个孔以2mL的PBS清洗2次。
[细胞培养]
向6孔平底微孔板上配置经灭菌的实施例1的纤维基板、比较例4的纤维基板、未处理的玻璃基板、及固定有层粘连蛋白521的实施例1的纤维基板，以2mL培养基清洗2次。之后，各加入2mL已制备成2.0×105个细胞/孔的HEK293(人胚胎肾细胞)的细胞悬浮液，然后在保持5％二氧化碳浓度的状态下，在CO2培养箱内于37℃静置24小时。
[使用WST-8的细胞数计测]
在24小时的细胞培养之后，将各纤维基板及未处理的玻璃基板(对照)的上清液除去，用2mL的PBS进行清洗。除去PBS后，添加1mL包含10％(v/v)FBS及1％(v/v)NEAA(GIBCO公司制)的EMEM培养基，进而添加100μL的WST-8试剂(KISHIDA CHEMICAL Co.,Ltd.制)。在CO2培养箱内于37℃静置100分钟后，将100μL反应溶液转移至96孔平底微孔板中，使用吸收分光计(Molecular Devices,LLC.制，SpectraMax)测定450nm处的吸光度。
各细胞数计测的结果(n＝2的平均值)示于表6。
[表6]
根据表6的结果，可知HEK293细胞在于180℃进行了加热的实施例1的纤维基板上增殖，表明使用实施例1的纤维制造用组合物制造的纤维对生物体无害。另外，在固定有层粘连蛋白521的实施例1的纤维基板上，细胞增殖率提高了约2倍。由此可知，通过在本发明的纤维上固定对细胞培养有效的物质，从而细胞增殖性提高。
<试验例3：细胞培养评价2>
利用静电纺丝法将实施例5的纤维制造用组合物进行纺丝后，在得到的纤维上进行了细胞培养评价。需要说明的是，细胞培养方法基于试验例2进行。
[实施例5的纤维的制造]
利用静电纺丝法将实施例5的纤维制造用组合物进行纺丝，向Φ30mm的聚苯乙烯(PS)基板上吹喷20分钟后，于80℃加热处理24小时。Φ30mm的PS基板是利用ACRYSUNDAYCO.,Ltd.制“PlaBan(プラバン)”(商品名；厚度为0.2mm)自己制作的。将得到的纤维用乙醇清洗并风干后，使用扫描电子显微镜(SEM)确认纤维形态。由实施例5的纤维制造用组合物得到的纤维的纤维直径为约470nm。
需要说明的是，下文中，为了方便起见，将对实施例5的纤维制造用组合物进行纺丝而形成了纤维的PS基板称为“实施例5的纤维基板”。
[细胞粘附物质的固定化]
向6孔平底微孔板上配置实施例5的纤维基板，向每1个孔中添加2mL的YIGSR肽(BEX CO.,LTD.制)/PBS溶液(0.05重量％)。在室温下浸渍24小时从而将肽固定化之后，除去溶液，每1个孔以2mL的PBS清洗2次。
[基材的灭菌]
向6孔平底微孔板(AS ONE Corporation制)上配置实施例5的纤维基板、固定有肽的实施例5的纤维基板、及作为对照的未处理PS基板，添加2mL的70％乙醇，在室温下浸渍5分钟之后风干。
[细胞培养]
向6孔平底微孔板上配置经灭菌的实施例5的纤维基板、固定有肽的实施例5的纤维基板、及作为对照的未处理PS基板，以2mL培养基清洗2次。之后，各加入2mL已制备成2.0×105个细胞/孔的HEK293(人胚胎肾细胞)的细胞悬浮液，然后在保持5％二氧化碳浓度的状态下，在CO2培养箱内于37℃静置24小时。
[使用WST-8的细胞数计测]
在24小时的细胞培养之后，将进行了细胞培养的实施例5的纤维基板、固定有肽的实施例5的纤维基板及未处理的PS基板(对照)的上清液除去，用2mL的PBS进行清洗。除去PBS后，添加1mL包含10％(v/v)FBS及1％(v/v)NEAA(GIBCO公司制)的EMEM培养基，进而添加100μL的WST-8试剂(KISHIDA CHEMICAL Co.,Ltd.制)。在CO2培养箱内于37℃静置100分钟后，将100μL反应溶液转移至96孔平底微孔板中，使用吸收分光计(Molecular Devices,LLC.制，SpectraMax)测定450nm处的吸光度。
各细胞数计测的结果(n＝2的平均值)示于表7。
[表7]
由表7的结果可知，与未处理的PS基板上的情况相比，在实施例5的纤维基板上，Hek293细胞以2.5倍更多地增殖。此外，在固定有肽的实施例5的纤维基板上，以4.0倍更多地增殖。由此可知，本发明的纤维具有细胞增殖性；以及通过将对细胞培养有效的物质固定化于本发明的纤维上，从而细胞增殖性提高。
<试验例4：细胞培养评价3>
利用静电纺丝法将实施例4及比较例4的纤维制造用组合物进行纺丝后，在得到的纤维上进行了细胞培养评价。需要说明的是，下文中，CO2培养箱中的CO2的浓度(％)用气氛中的CO2的体积％表示。
[实施例4的纤维的制造]
利用静电纺丝法将实施例4的纤维制造用组合物进行纺丝，向玻璃基板上吹喷20分钟后，于180℃加热处理30分钟。作为玻璃基板，使用了微型盖玻片(Matsunami GlassInd.,Ltd.制)(Φ32mm，厚度为约0.5mm)。将得到的纤维用乙醇清洗并风干后，使用扫描电子显微镜(SEM)确认纤维形态。由实施例4的纤维制造用组合物得到的纤维的纤维直径为约450nm。
需要说明的是，下文中，为了方便起见，将对实施例4的纤维制造用组合物进行纺丝而形成了纤维的玻璃基板称为“实施例4的纤维基板”。
[比较例4的纤维的制造]
利用静电纺丝法将比较例4的纤维制造用组合物进行纺丝，向玻璃基板上吹喷20分钟后，于180℃加热处理10分钟。作为玻璃基板，使用了微型盖玻片(Matsunami GlassInd.,Ltd.制)(Φ32mm，厚度为约0.5mm)。将得到的纤维用乙醇清洗并风干后，使用扫描电子显微镜(SEM)确认纤维形态。由比较例4的纤维制造用组合物得到的纤维的纤维直径为约440nm。
需要说明的是，下文中，为了方便起见，将对比较例4的纤维制造用组合物进行纺丝而形成了纤维的玻璃基板称为“比较例4的纤维基板”。
[细胞的制备]
利用D-PBS(-)(Life technologies制)，将小鼠成纤维细胞(MEF；从日本SLC公司制E12.5ICR小鼠采取、制备)、或在Matrigel hESC-qualified matrix(人ESC基质胶)(Corning制)上进行了培养的人ES细胞(H9株)或人iPS细胞(253G1株)清洗2次，然后添加1mL的TrypLE Express并于37℃静置5分钟。将TrypLE Express抽吸除去之后，利用含有最终浓度为10μM的Y-27632(和光纯药株式会社制)的mTeSR1(VERITAS Corporation制)(以下记为mTeSR1/10μM Y27632)培养基将细胞回收。通过吹吸(pipetting)使细胞悬浮液成为单个细胞(single cell)状态之后，以1000rpm/3分钟的转速在室温下进行离心分离。将上清液除去之后，将细胞沉淀再次悬浮在mTeSR1/10μM Y27632培养基中，利用NucleoCounterNC-200(以下，NC-200；ChemoMetecAS制)计测细胞数。
[基材的灭菌]
向6孔平底微孔板(BD Bioscience公司制)上配置实施例4的纤维基板、及比较例4的纤维基板，用1ml的100％乙醇清洗3次后风干。之后，利用1mL的Dulbecco’s ModifiedEagle Medium:Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12；Sigma Aldrich制)溶液清洗3次。
[细胞粘附物质的固定化]
向6孔平底微孔板(BD Bioscience公司制)上配置实施例4的纤维基板、及未处理的玻璃基板，用1ml的100％乙醇清洗3次并风干后，用1ml的D-PBS(-)或DMEM/F-12溶液清洗3次。向实施例4的纤维基板中，添加1mL已用D-PBS(-)将最终浓度调整为100μg/10mL的层粘连蛋白511(BioLamina制)溶液，于37℃静置2小时或于4℃静置一晚后，用1mL的DMEM/F-12溶液清洗1次。向玻璃基板中，添加1mL用DMEM/F-12稀释了75倍的基质胶溶液，于37℃静置2小时或于4℃静置一晚后，用1mL的DMEM/F-12溶液清洗1次。
[细胞培养]
向6孔平底微孔板(BD Bioscience公司制)上配置经灭菌的实施例4的纤维基板、经灭菌的比较例4的纤维基板、固定有层粘连蛋白511的实施例4的纤维基板、及涂布有基质胶(Corning公司制)的玻璃基板，然后，以1.5～2.0×105个细胞/孔的量添加人ES细胞或人iPS细胞的悬浮液。于37℃培养24小时后(培养的第1天)，用1.5mL的mTeSR1/10μM Y27632培养基进行培养基更换。从培养第2天到培养第4天，用1.5mL的mTeSR1培养基进行培养基更换。在培养期间，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，于37℃在CO2培养箱内静置。
[细胞数的计测]
培养4天后，除去培养基，利用D-PBS(-)清洗细胞层。之后，添加0.5mL的TrypLEExpress，于37℃静置1分钟或3分钟。将细胞回收之后，以1000rpm/3分钟的转速进行离心分离，除去上清液。将细胞沉淀再次悬浮在DMEM/F-12溶液中后，用NC-200计测细胞数和存活率。由培养第4天的细胞数/接种的细胞数算出细胞增殖效率。
各细胞的增殖效率的结果(n＝2的平均值)示于表8(人ES细胞)及表9(人iPS细胞)。
[表8]
[表9]
由表8及表9的结果可知，与比较例4的纤维基板相比，实施例4的纤维基板对人ES细胞以及人iPS细胞的培养更加有效。另外可知，固定有层粘连蛋白511的实施例4的纤维基板的细胞增殖率，与涂布有基质胶的玻璃基板的细胞增殖率为相同程度，从而可知向纤维基板上固定细胞粘附物质对于细胞培养是有效的。
此外，由表9的人iPS细胞存活率的结果可知，固定有层粘连蛋白511的实施例4的纤维基板、及实施例4的纤维基板的细胞存活率，比涂布有基质胶的玻璃基板高约20％。由该结果可知，本发明的纤维对于细胞培养而言是有效的。
产业上的可利用性
根据本发明，可提供下述纤维制造用组合物、将该组合物进行纺丝而得到的纤维、以及使用该纤维的细胞培养支架材料，所述纤维制造用组合物用于制造适合于将对细胞的粘附·增殖·分化等有效的物质固定化、并且保持耐有机溶剂性的纤维。所述纤维通过将对细胞的粘附·增殖·分化等有效的物质固定化，可呈现出作为细胞培养支架材料的更优异的性能。
本申请以在日本提出申请的日本特愿2014-027044(申请日：2014年2月14日)为基础，其内容全部包含在本说明书中。

Claims (10)

1.一种纤维制造用组合物，含有：
(A)包含通式(1)表示的单元结构及通式(2)表示的单元结构的高分子化合物，
(B)交联剂，
(C)酸化合物，以及
(D)溶剂；
式(1)中，
R1表示氢原子或甲基，
Q1表示酯键或酰胺键，
R2表示至少1个氢原子被羟基取代的碳原子数为1～10的烷基或碳原子数为6～10的芳香族烃基；
式(2)中，
R3表示氢原子或甲基，
Q2表示活性酯基。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述Q2由通式(5)表示，
式(5)中，
Q3表示N-琥珀酰亚胺基、对硝基苯基或五氟苯基。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述高分子化合物的重均分子量为1,000～1,000,000。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，所述溶剂为极性溶剂。
5.一种纤维的制造方法，包括将权利要求1～4中任一项所述的组合物进行纺丝的工序。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述纺丝为静电纺丝。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，包括在70～300℃的范围内对经纺丝而得的纤维进行加热的工序。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的方法，其中，还包括将细胞粘附物质固定化的工序。
9.一种纤维，其是通过权利要求5～8中任一项所述的方法制造的。
10.一种细胞培养支架材料，包含权利要求9所述的纤维。
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