CN1060872A - 红发夫酵母细胞的球状体融合 - Google Patents

红发夫酵母细胞的球状体融合 Download PDF

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Abstract

本发明提供了红发夫酵母菌株之细胞融合的方 法，从而提供了新的红发夫酵母菌株。

Description

本发明涉及融合红发夫酵母（Phaffia  rhodozyma）球状体的方法及新的红发夫酵母菌株。
虾青素（astaxanthin）（反式3，3′-二羟基-4，4′-二酮-β-β′-胡萝卜素，也称为反式3，3′-二羟基-β，β′-胡萝卜素-4，4′-二酮）是一种广泛分布于植物和动物体内的氧化类胡萝卜素色素。它是主要见于甲壳纲动物和鲑科鱼中的氧化类胡萝卜素色素。虾青素也见于藻类、酵母（如红发夫酵母）、细菌和鸟类动物中。
在商业水产养殖中，期望向鲑科鱼类和甲壳动物的食物中加入虾青素，以赋予见于固有鲑科鱼类、甲壳纲动物及鸟类动物中的不同粉红颜色。据信给商业水产养殖生产的鲑科鱼和甲壳动物赋予不同的粉红颜色对于鼓励消费者接受它们是很重要的。目前还没有虾青素的经济来源。
用于水产养殖目的之虾青素的一个潜在来源是红发夫酵母。已对红发夫酵母有所了解，其为分类学上具有高虾青素含量的酵母种（其类胡萝卜素色素的约85%是虾青素，N.W.Miller，et  al.，Int.J.Syst.Bacteriol.，Vol.26，P.286（1976））。自80年代以来，Eric  A.Joh  Johnson和其他研究者就已开发利用这种酵母作为鲑科鱼和甲壳动物的食物添加剂。
由于没有能产生高水平虾青素的红发夫酵母菌株而阻碍了使用红发夫酵母作为虾青素之商业开源的开发工作。目前可得到的红发夫酵母菌株，一般每克细胞产生30至3000μg虾青素。但遗憾的是具有高虾青素产率的红发夫酵母菌株生长速度极慢，而不适于商业性生产发酵。此此，期望开发既能高水平产生虾青素又有所期生长速度的红发夫酵母菌株（从而可提供高的总产率）。
目前得到改良之红发夫酵母菌株的方法，只有通过反复多次诱变。但反复多次诱变所产生的红发夫酵母菌株有许多对商业发酵有毒的突变。因此每次成功地诱变都给改善红发夫酵母菌株带来新的困难。这一问题不能利用传统的交配技术来解决，因为有关红发夫酵母的有性繁殖尚不明了。如果能用一种技术产生红发夫酵母球状体，即可能以球状体融合技术代替传统的交配技术作为改善红发夫酵母菌株的方法。但红发夫酵母具有坚韧的细胞壁，而阻碍了研究者制备适用于细胞融合的红发夫酵母原生质球状体。
因此，期望建立能以高水平产生虾青素的新的红发夫酵母菌株。
还期望建立一种产生适用于细胞融合之红发夫酵母球状体的方法。
进而期望建立一种融合红发夫酵母球状体的方法。
因此本发明的一个目的是提供以高水平产生虾青素的红发夫酵母菌株。
本发明的另一个目的是提供一种产生适用于细胞融合的红发夫酵母球状体。
本发明的再一个目的是提供一种融合红发夫酵母球形体的方法。
本发明的其他方面、目的及几个优点将会从整个说明书中看出。
根据本发明，发明人已发现了一个稳定的红发夫酵母融合菌株，当其在适当生长条件下，于摇瓶中培养时可产生大约1430μg/g至大约1660μg/g（干重）的虾青素和大约2350μg/g至2950μg/g（干重）的总类胡萝卜素，并提供至少24%（干重）的产率;基于5天摇瓶检验，其生产能力约为4500μg/1至8600μg/l，其中菌株被培养在利于该菌株接近最佳生长的适当条件下。
根据本发明，发明人还发现了产生适用于细胞融合之红发夫酵母球状体的方法，包括在适当条件下使存活的有细胞壁的红发夫酵母细胞与有效量的得自Trichoderma  harzianium的适当消化酶制剂接触，以利于除去所说的细胞壁并形成活的红发夫酵母球状体。
在本发明的另一实施方案中，发明人还发现了融合红发夫酵母细胞的方法，该方法包括
（a）在适当条件下，使用细胞壁的活红发夫酵母细胞与有效量的得自harzianium木霉的适当酶制剂接触，以利于除去所说的细胞壁并形成活的红发夫酵母球状体;
（b）以一种有利于一个或多个球状体之细胞壁融合的方式处理所说的球状体。
红发夫酵母菌株的细胞融合提供了一种使具有弱生长特征之红发夫酵母的高虾青素生产菌株恢复为强生长特性的方法。因此发现形成红发夫酵母细胞融合的方法为连续改善发夫酵母细胞菌株提供了较容易的途径。因为以前的研究者不能除去红发夫酵母细胞的特征性坚韧细胞壁，所以不可能融合红发夫酵母细胞菌株。发明人已发现，可利用得自真菌harzianium木霉的酶制剂有效地形成红发夫酵母的球状体。利用这些制剂有可能第一次形成红发夫酵母球状体并用这些球状体完成细胞融合。
适用的harzianium木霉菌株可由美国典型培养物保藏中心（12301 Parklaun Drire，Rockville，Maryland）得到（如ATCC 64986）。可用本领域已知的深层发酵法培养并刺激这些菌株产生消化酶。harzianium木霉消化酶制剂的一个适当来源是Novo Enzymes SP-299-MutanaseTM和NovozymeTMSP-234（一种纯化形式的MutanaseTM）。
用有效量的harzianium木霉消化酶制剂处理存活的红发夫酵母细胞，可基本上除去红发夫酵母细胞壁，而保留以本方法形成之球状体部分的存活性。一般可用本领域已知的适当技术检验红发夫酵母细胞壁的去除，包括用显微镜检查，或光度计监测混浊度，或平皿接种。目前优选的是用光度计监测混浊度的方法来检查细胞壁的去除情况。通常可将样品放入含消化酶制剂的水溶液中，并监测溶液的混浊度，直至观察到混浊度明显降低为止。混浊度降低一般与被消化酶制剂溶解的细胞部分相对应。每100g/升含水红发夫酵母所加消化酶制剂的量一般取决于温度、PH及红发夫酵母的状态。推荐的用量是每100g/升红发夫酵母细胞约使用0.5至5.0单位harzianium木霉消化酶制剂。通常，优选的用量范围为每100g/升红发夫酵母细胞使用1至2单位harzianium木霉消化酶制剂。一单位定义为，当消化酶与红发夫酵母细胞在22℃和PH4.5条件下接触并保温24小时，与对处在对数生长期除去的密度为100g/升的含水红发夫酵母样品，按实施例Ⅴ所述方法用丙酮提取时，提供等价量被释放的虾青素所需要的harzianium木霉消化酶制剂的量。
红发夫酵母细胞与消化酶制剂接触的温度可以是允许消化酶制剂消化酶制剂消化红发夫酵母细胞壁的任何温度。一般温度范围为大约0℃至60℃。本发明实践中优选的温度范围为大约20℃至30℃。
红发夫酵母细胞与消化酶制剂接触的PH可以是允许消化酶制剂消化红发夫酵母细胞壁的任何适当PH。一般红发夫酵母细胞与消化酶制剂接触的PH范围为大约PH4.0至PH5.5，且优选的PH范围是大约PH4.5至PH5.0。
红发夫酵母细胞可在其生活周期的任何时间与得自harzianium木霉的消化酶制剂接触。但较好是红发夫酵母细胞在达到晚期对数生长期或早期静止期后与消化酶接触，特别是在对数生长期后的大约1至10代，且更好是在大约2至4代时与消化酶接触。
可用适当方法混合红发夫酵母细胞的含水悬浮液和harzianium木霉消化酶制剂。一般是使干燥的消化酶制剂与含水红发夫酵母发酵液或含水细胞悬浮液接触并将所说的干消化酶制剂混入溶液中来完成混合步骤。
得自harzianium木霉的消化酶制剂与活红发夫酵母的接触时间应足以基本上除去红发夫酵母细胞的细胞壁。接触时间取决于细胞浓度、PH、温度和所用消化酶制剂的单位数。一般红发夫酵母细胞与得自harzianium木霉之消化酶制剂的接触时间应在大约1至4小时范围内，且接触时间最好是大约2小时。
红发夫酵母球状体融合技术
一旦得到球状体，即可使用常规酵母融合技术融合红发夫酵母球状体。酵母融合技术是本领域技术人员熟知的。实施例1中描述了一种适用的技术。下面讨论的是这可用于红发夫酵母球状体融合之技术的一个实际例子。
在基本上除去了细胞膜之后，由与之接触的消化酶制剂中收集并分离出由此形成的活球状体。从消化酶制剂中除去细胞的适当分离技术包括但不仅限于离心或过滤。用于从与之接触的消化酶制剂中分离出球状体的适当分离技术应有利于球状体的继续存活。可在等渗溶液中适当洗涤红发夫酵母球状体，以利于完全除去消化酶制剂。然后可用适当的分离技术从等渗洗涤液中回收红发夫酵母球状体。
除去红发夫酵母细胞壁之后，必须小心地处理如此形成的球状体，以避免破坏细胞膜。为了避免破坏球状体，最好在完成球状体融合并再生细胞壁之前一直将球状体保存在基本上等渗的溶液中。可用各种缓冲液和葡萄糖、D-甘露醇、D-山梨醇、蔗糖或氯化钾等水溶性无毒性剂制成等渗溶液。等渗溶液中溶质（其至少包括缓冲剂和可溶性无毒性剂）的浓度较好在大约0.5至3M范围内，最好是大约1M。
为了诱导原生质球状体融合，应使用能促进细胞膜之间粘附和融合的试剂如聚乙二醇处理球状体。因为聚乙二醇对球状体是毒性的，所以球状体只能与之接触有限的时间。一般在合理时间内，与球状体接触的聚乙二醇浓度应是以诱导融合，但又要使用足够低的浓度以避免过多的球状体死亡。在其本上等渗的溶液中提供的聚乙二醇浓度较好为大约100g/升至300g/升，更好是每升与球状体接触的等渗溶液中约含200g聚乙二醇。聚乙二醇与球状体接触的时间长短取决于单位体积内的细胞数目及期望达到的融合程度（如接触时间较长，每单位体积细胞浓度较高，则更可能发生三个或更多个细胞的多细胞融合）。在本发明的实践中，聚乙二醇与球状体的接触时间较好是大约10至20分钟，更好是15分钟左右。然后用等渗溶液洗融合的球状体并离心回收之。
融合的球状体被回收后，必须将其置于有利于该融合之红发夫酵母的细胞壁再生的适当条件下。一种利于红发夫酵母细胞壁再生的适当技术是将融合的球状体铺敷在平皿上的等渗表面琼脂中。铺敷红发夫酵母须稍加小心。因为红发夫酵母细胞是温度敏感性的，所以表面琼脂应是低熔点的，或者以一个能迅速冷却的很薄层加入。因为期望在琼脂中形成的菌落穿透表面琼脂并与空气接触，所以最好以很薄层使用琼脂。只有穿透表面琼脂并与空气接触的菌落才能表现出红发夫酵母细胞的特征性类胡萝卜素颜色（这样将有利于鉴定有用菌落）。在本发明的实践中，表面琼脂下面的底层或支持层琼脂最好是等渗的。可使用常规微生物学技术分离融合后形成的菌落并根据虾青素产生情况、菌株稳定性及生长特征筛选之。
下表所示数据表明，有可能利用选择之红发夫酵母菌株间的原生质球状体融合来改良该菌株，提供显著改良了的红发夫酵母融合菌株。这些融合菌株与亲代菌株PC8055相比，表现有明显改善的虾青素生产率和改善的生长特性。
表Ⅰ
Phillips培养物 虾青素1
保藏号  NRRL登记号  （μg/l）
PC8055＊Y-10291 1268
PC81662Y-18730 8200
PC81682Y-18731 7636
PC81702Y-18732 7706
PC82392Y-18733 8568
PC82432Y-18734 7661
＊亲代菌株为67-210，也即PC·8055，该菌株已经保藏，并且公众可从地址在Peoria，Illinois的United States Depactment of Agrjculture，Agri-cultural Research Service，Northern Regiononal Research Centre得到，其保藏登记号为NRRLY-10291。
1用实施例Ⅱ中所述的方法检测虾青素含量。菌株生长于实施例Ⅱ中所述的条件下。
2有相应NRRL保藏登记号的分离的基本上纯的红发夫酵母菌株已根据布达佩斯条约保藏于United States Depart-ment of Agriculture，Agricultural Research Service，Northern Regional Research Centre1815 North University Street，Pedria，Illinois 61604。
使用本发明的红发夫酵母菌株PC8166、PC8168、PC8170、PC8239和PC8243，可因提高了虾青素（即反式3，3′-二羟基-4，4′-二酮-β-β′-胡萝卜素-4，4′-二酮）产生的水平而提高虾青素生产率。当在适当生长条件下摇瓶中培养时，这些菌株增加的虾青素生产率大约为4500μg/l至8600μg/l。在上述条件下，这些菌株的虾青素生产率较好是大约5600μg/l至8600μg/l，且最好是大约7600μg/l至8600μg/l。当在摇瓶中培养时，这些菌株提高的虾青素生产率也可导致虾青素生产水平增加，基于干重，其增加范围为大约1430μg/g至1660μg/g。当在摇瓶中培养时，所产生的虾青素水平较好是约为1515μg/g至1660μg/g（基于干重）。所观察到的生产率也可转换成总胡萝卜素生产率的增加，其增加范围为大约2350μg/g至300μg/g胡萝卜素（基于干重）。所产生的胡萝卜素量较好为大约2460μg/g至2950μg/g胡萝卜素（干重）。
在摇瓶中的适当生长条件限定为使红发夫酵母培养在强力搅拌的摇瓶中，生长5天后达到最大比生长速率所需的条件。本发明红发夫酵母菌株在摇瓶内的适当生长条件包括利用本申请实施例中所限定的摇瓶试验生长培养基（Shake  Flask  Assay  Growth  Medium），并在强力搅拌下于20℃至22℃之间培养菌株（如实施例Ⅱ所述）。
发酵
红发夫酵母是用于工业发酵的相对新的微生物。红发夫酵母发酵领域的几个研究者已观察到，如果提供过量的糖形式存在的碳源，将会使醇或醛的积聚量达到对发夫酵母有毒性的水平。因此这些研究者建议在提供有限量碳源的条件下培养红发夫酵母细胞。但限制碳源量将使依赖碳源之红发夫酵母的虾青素产率降低，并释放出可在发酵容器内引起过多泡沫产生的化合物。存在这些泡沫生成化合物就必须使用消泡剂来避免发酵容器溢流。然而，使用消泡剂又会降低每个细胞的虾青素产率。
我们已发现，在含有红发夫酵母细胞和营养素的发酵液中保留稍为过量的至少一种适当的碳源物质。能易于控制醇及醛的产生并避免泡沫形成。另外存在稍为过量的碳源也可增加细胞生长速度和虾青素产率。
在改善虾青素和细胞产率中，特别重要的是当红发夫酵母细胞处于接种和对数生长期之间的过渡期时，在培养基中维持可检测之过量的至少一种适当的碳源。最好在接种后的过渡期至对数生长期的实质性阶段使红发夫酵母细胞与可检测之过量的至少一种适当碳源接触。
所提供的可检测之过量的至少一种适当碳源应能在红发夫酵母发酵期间有效地避免过多泡沫形成，而且不产生生长抑制或毒性水平的醇或醛。在由含水红发夫酵母细胞和营养素组成的发酵液中可检测到的稍为过量的至少一种碳源，含量较好为大约1.0g/升至20mg/升，且最好为大约1.0g/升至5.0g/升。应控制发酵液中稍为过量的至少一种适当的碳源，以避免产生过多的醇和醛。发酵液中醇的量较好应在大约0.0g/升至3.0g/升范围内。发酵液中醛的量较好应在大约0.0g/升至1.0g/升范围内。
可使用多种不同的碳源和/或营养素源，按液体连续或分批给料方式进行红发夫酵母发酵。培养红发夫酵母的适当碳源包括但不仅限于选自琥珀酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、丙酮酸盐、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、玉米糖浆、水解淀粉及其两种或多种合用的碳源。培养红发夫酵母的优选碳源是选自琥珀酸盐、葡萄糖及两者合用的碳源。红发夫酵母的适当营养或培养基源可包括至少一种氮源、至少一种磷酸盐源、至少一种矿物质如铁、铜、锌、镁、锰、钙及其他微量元素源，且必要时还包括维生素（如生物素、泛酸和硫胺素）。
可从各种不同的来源得到所说的至少一种碳源的营养素，或者其可由单一来源如甘蔗废糖蜜。但最好是有限定之特征的至少一种碳源和/或营养素源。表2中列出了已证明特别有效的至少一种碳源及营养素组合物。
表2
碳源和营养素
每升水中含有的成分
葡萄糖  10-100（g/l）
H3PO4（85%） 0.16-2.7（ml/l）
CaSO4·2H2O 0.011-0.8（g/l）
K2SO40.171-1.3（g/l）
MgSO4·7H2O 0.140-1.56（g/l）
KOH  0.047-0.35（g/l）
生物素  0.006-0.044（mg/l）
硫胺素  0.12-9.8（mg/l）
1酵母浸膏 1.2-6.0（g/l）
2矿物质和微量金属 0.118-9.8（ml/l）
1浸母浸膏商品名为Amberex 1003，其可购自Universal Foods Corporation，Milwaukee，Wisconsin。
2矿物质和微量元素是FeSO4·7H2O（65.0g/l），CuSO4·5H2O（6.0g/l，ZnSO4·7H2O（20g/l）、MnSO4（3.0g/l）和H2SO4（5.0ml/l）。
用于本发明的酵母浸膏包括但不仅限于选自AmberexTM1003（Universal Foods Corporation）和BactoTMYeast Extract（Difco Laboratories Incorpoorated）的酵母浸膏。
用于本发明的微量元素一般是适于酵母生长且其用量不足以限制红发夫酵母的生长速度或虾青素产生，它们包括但不仅限于选自钴和钼的微量元素。
发酵温度一般约为18℃至22℃，且较好为大约20℃。
在以分批给料方式进行发酵容器内所溶解的氧含量约为10%至80%饱和度，且较好为大均30%至60%饱和度。在连续发酵中，发酵容器内溶解的氧含量一般为大约70%至100%饱和度，且较好为大约70%至80%饱和度。培养红发夫酵母所需的PH一般为大约3.0至5.5，且较好为大约4.5至5.4。
可在含有红发夫酵母细胞的发酵液达到所要求的细胞密度或虾青素含量之后收获细胞。较好使红发夫酵母培养物在静止期保持约4至24小时，且最好保持约8至12小时，以增加虾青素产率。
然而，由红发夫酵母细胞会形成对细胞破裂不利的坚韧细胞壁、故不宜使之在静止期保持过长时间。
细胞破裂
鲑科鱼类、甲壳纲动物和鸟类不能利用未破碎之红发夫酵母细胞中的虾青素。为了利用红发夫酵母作为虾青素的食物来源，必须用物理、化学、机械或酶学方法破坏红发夫酵母的细胞壁。红发夫酵母细胞壁对普通溶解方法有很强的抗性。例如，红发夫酵母在三次通过珠粒碾磨机碾磨后只能释放出其中的约40%虾青素（在珠粒碾磨机内通过更多次数不能在实质上增加虾青素的释放）。红发夫酵母只有在三次通过Gaulin  Press碾磨机后才能释放出其中的约95%虾青素（该方法费时而花费的成本高）。在本发明出现之前，也不能证明酶促溶解红发夫酵母是由红发夫酵母细胞中释放虾青素的经济或有效的方法。
申请人已发现，有效量的harzianium木霉消化酶制剂能够消化红发夫酵母的细胞壁。实施例Ⅴ中所述与丙酮提取方法相比较，可测知用该方法几乎可得到存在中红发夫酵母中的全部虾青素。
公众可由美国典型培养物保藏中心（ATCC，12301  Parklawh  Drive，Rockville，Maryland）得到适用的harzianium木霉菌株（如ATCC64986）。可用本领域已知的深层发酵法培养并刺激产生消化酶。harzianium木霉消化酶制剂的一个适当来源是Novo  Enzymes  SP-299-Mutanase。
用有效量的herzianium木霉消化酶制剂处理含有虾青素的红发夫酵母细胞，基本上可得到其中所含有的所有虾青素。一般每100g/升含水红发夫酵母所用消化酶制剂的量依据温度、PH和所用红发夫酵母细胞的状态而定。原则上推荐每100g/升红发夫酵母细胞使用0.2至10.0单位harzianium木霉消化酶制剂。一单位定义为，当消化酶与红发夫酵母细胞在22℃和PH4.5条件下接触并允许保温24小时，与对处在对数生长期除去的密度为100g/升的含水红发夫酵母样品，按实施例Ⅴ所述方法用丙酮提取临，提供等价量被释放的虾青素所需要的harianium木霉消化酶制剂的量。
红发夫酵母细胞与消化酶制剂接触的温度可以是允许消化酶制剂消化红发夫酵母细胞壁的任何温度。一般温度范围约为0℃至60℃本发明实践中优选的温度范围是大约20℃至30℃。
红发夫酵母细胞与消化酶制剂接触的PH可以是允许消化酶制剂消化红发夫酵母细胞壁的任何适当PH。一般红发夫酵母细胞与消化酶接触的PH范围为大约PH4.0至PH5.5，且较好是大约PH4.5至PH5.0。
含虾青素的红发夫酵母细胞可在其生活周期的任何时间与得自harzcanium木霉的消化酶制剂接触。但较好是在红发夫酵母细胞已处在对数生长期之后即与消化酶制剂接触，特别是在对数生长期后约0至72小时，更好是约0至24小时与消化酶接触。
可用任何适当方法混合红发夫酵母细胞的水悬浮液和harzianium木霉消化酶制剂。一般是将干燥的消化酶制剂与含水红发夫酵母发酵液或含水细胞悬液接触并将所说的干消化酶制剂混入溶液中来完成混合步骤。
得自harzianium木霉的消化酶制剂可与含有虾青素的红发夫酵母细胞接触一定时间，以与实施例Ⅴ、A中所述的丙酮提取法相比使之能基本上释放出存在于红发夫酵母细胞内的虾青素。接触时间的长短取决于细胞浓度、PH、温度及所用消化酶的量。一般红发夫酵母细胞与衍生于harzianium木霉之消化酶制剂的接触时间为大约12至24小时，较好是大约24小时。
红发夫酵母细胞的干燥
可在已破坏或以一种使其中的虾青素能作为食物色素添加剂使用的方式消化细胞后，干燥这些红发夫酵母细胞。可使用流化床干燥机、转鼓式干燥机或喷雾干燥机进行干燥。最使使用喷雾干燥法，因为这样可使细胞暴露于高温下的时间短，从而使所存在虾青素不致遭受可能的降解。
干燥后，可用任何适当方法如用旋风分离器回收作为粉末状酵母材料的所得产物，并作进一步处理以用于饲料中、储存或装运。
实施例
菌株
红发夫酵母PC8055  NRRL  Y-10921
红发夫酵母PC8166  NRRL  Y-18730
红发夫酵母PC8168  NRRL  Y-18731
红发夫酵母PC8170  NRRL  Y-18732
红发夫酵母PC8239  NRRL  Y-18733
红发夫酵母PC8243  NRRL  Y-18734
摇瓶试验生长培养基
葡萄糖  20.0g/L
KH2PO410.0g/L
K2HPO45.0g/L
（NH4）2SO41.0g/L
泛酸钙  0.0200g/L
吡多素HCl  0.0125g/L
硫胺素·HCl  0.0100g/L
烟酸  0.0100g/L
CaCl2·2H2O 0.01g/L
ZnSO4·7H2O 0.0070g/L
氯化血红素  0.005g/L
CuSO4·5H2O 0.0006g/L
MnSO4·2H2O 0.0002g/L
生物素  0.00015g/L
MaZu  DF37C
消泡剂  10.0滴/L
改良的YMA培养基
Bacto酵母浸膏  3.0g/L
Difco麦芽汁  3.0g/L
右旋糖  20.0g/L
琼脂  20.0g/L
水  1.0L
Bio  Lafitte培养基（每升水）
H3PO4（85%） 14.5ml 酵母浸膏 20.0g
CaSO4·2H2O 0.60g 微量金属14.0ml
K2SO49.12g 生物素 8mg
MgSO4·7H2O 7.60g 硫胺素 8mg
KOH  2.60g  MAZU  DF  37C
葡萄糖  40.0g  消泡剂  12滴
1微量金属包括（YTM-4）：
FeSO4·7H2O 16.25g/250ml
CaSO4·5H2O 1.50g/250ml
ZnSO4·7H2O 5.00g/250ml
MnSO4·H2O 0.75g/250ml
H2SO41.25g/250ml
实施例1：球状体融合
在100ml改良的YMA培养基中制备红发夫酵母的培养物并于20℃保温5天。各培养物在无菌离心管内以2.5ml（总体积）当量Klett单位混合并于20℃以12，000g离心10分钟。沉淀团块用含7M山梨醇的100mM灭菌磷酸盐缓冲液（PH4.0）洗两次并重新悬浮于25ml含山梨醇的同样缓冲液中。将所得溶液分成两等份（各10ml）。向一等份内加入0.5ml  10mg/ml  Mutanase（SP299），两份均于室温下保温2小时，然后在冰上冷却。向4.9ml  5%SDS中每等份各加入0.1ml并检测600nm（吸光率（A600），然后在光学显微镜下观察各等分部分，以监测细胞壁去除情况。
于20℃下以120g离心10分钟，由各等分样品中沉淀出球状体，并用含有1M山梨醇10ml灭菌的100mM磷酸盐缓冲液（PH4.0）洗两次。将各等分样品重新轻轻搅拌于1.0ml含有1M山梨醇的100mM磷酸盐缓冲液（PH4.0）中。向其中加入9ml溶于100mM磷酸盐缓冲液（PH4.0）中无菌20%聚乙二醇-3350中并于室温下保温15分钟。
然后于20℃下以120g离心10分钟沉淀出球状体并使用无菌吸管除去PEG。将球状体重新悬浮于10ml含1M山梨醇的改良的Ym培养液中并于室温下保温30分钟。用吸管将各0.1ml等分样品吸加到20个含1M山梨醇之改良YMA平皿的表面上。向各平皿表面上加入10ml含1M山梨醇和1%琼脂（此前保持在42℃）的改良之YM。将细胞混入轻轻旋动的表面琼脂中，然后将平皿置于室温下保温5至10天，提取单个菌落并接种在改良的YMA平皿上，20℃下保温5天并检测虾青素含量。
实施例Ⅱ：融合菌株的虾青素生产量
下表显示实施例1中产生的融合菌株及各菌株在摇瓶中生长5天后所产生之虾青素的水平。各菌株都生长于100ml改良的YM摇瓶内，各摇瓶分别接种1菌环由生长5-10天的旧改良YMA平皿中得到的红发夫酵母培养物。摇瓶在轨道振荡器（行程10cm，200rpm）上20℃保温5天。将10ml摇瓶培养物接种于加在2.8L三折流Fernbach烧瓶内的1000ml摇瓶试验培养基中。样品在轨道振荡器（行程10cm，200rpm）上20℃保温5天后，根据洗过之细胞的干重、虾青素含量（HPLC）和总类胡萝卜素含量（HPLC）进行分析。用下列公式计算细胞产率（基于总葡萄糖浓度）：
(洗过之细胞的干重（g/L）)/(20g/L（葡萄糖浓度）) ×100%
使用下列公式计算容量虾青素产率：
洗过的细胞干重（g/L）×虾青素
（μg/g细胞）
1三个数据点的摇瓶平均值（WCDW/葡萄糖重）（WCDW＝洗过的细胞干重）代表理论上的百分收率（基于20克可利用的碳源）。因此4.94g细胞提供24.7%的收率（即4.94/20×100）。
2数据是只对反式3，3′-二羟基-β，β′-胡萝卜素-4，4′-二酮所作HPLC分析的结果（参见实施例Ⅲ）。
3每升中虾青素微克（μg）数，是按实施例Ⅱ所述用ppm数乘以在摇瓶中生长5天后的细胞浓度而算得的。
如由PC8166、PC8239和PC8243所证明的，某些融合菌株在虾青素生产上明显地超出了先前生成它们的亲代菌株。然而，PC8168和PC8170等菌株也代表了对它们的亲代菌株的显著改良。用于上述某些融合实验的亲代菌株PC8117和PC8216则不适于大规模发酵生产，因为它们倾向于产生不带色素或带很浅色素的子细胞。但利用PC8117和PC8216经细胞融合所产生的融合细胞不会产生不带色素或只有很浅色素的子细胞因此，由不稳定的高色素生成菌株产生的融合菌株提供了一种连续开发高生产性红发夫酵母新菌株的方法。
实施例Ⅲ：发夫酵母的HPLC色素分析
使用标准相HPLC系统分析红发夫酵母中的类胡萝卜素色素。该系统使用了向正庚烷中提取的步骤，可将正庚烷直接装在标准相层析柱上。
用吸管将0.5ml发夫酵母培养物吸入2.0ml微量离心管中。经在离心管内离心5分钟使细胞沉淀。弃去上清液并加入玻璃珠（Sigma，0.4-0.5mm）复盖留存的沉淀团块。向细胞沉淀物内加入300μl冰醋酸，并在机械振荡器中将其振荡15分钟以破坏细胞。加入1.0ml去离子水，然后再加入0.5ml正庚烷。将离心管放在机械振荡器上振荡10分钟，使类胡萝卜素被提取到上层庚烷相中。在微量离心管中离心5分钟以分离溶剂相。将离心管置于冷处保存备作分析用。注射体积为30μl。
用于虾青素定量分析的HPLC系统是Waters  HPLC系统，该系统包括两个510型泵，一个U6K手工注样器、一个490E可编程序的多波长紫外/可见光检测器、一个680型自动梯度控制器和一个740型记录仪/积分仪。所用的固定相是装在3.9mm×300mm柱内的10μm  Waters  micropor-osil。在最初安装后，泵入加在甲醇中的1.0%（W/V）磷酸溶液，使之以每分钟1ml的流速通过柱，将固定相预处理1小时。流动相是正己烷和丙酮。
分离发夫酵母提取物之所有在470nm有吸收的组分时需要使用梯度程序。层析30分钟得到层析图谱，并经5分钟重新建立初始溶剂浓度比例。也可使用等渗己烷∶丙酮（87∶13）系统层析20分钟完成虾青素的定量分析，而无须在注射下一个样品前平衡柱床。
实施例Ⅳ：虾青素测定
A.虾青素的平皿测定
在改良的YMA平皿上划线接种待检培养物并于20-22℃下通气保温。四天后，用点样器柄或环从各改良YMA培养皿中刮取小块培养物（净重0.1-0.2克）。将细胞重新悬浮于1.0ml去离子蒸馏水中并加于锥形底微量离心管中。
用吸管各取0.1ml细胞悬浮液加入9.9ml去离子蒸馏水中，检测600nm吸光率以确定细胞浓度（洗过的细胞干重（克）/升）。
然后将原细胞悬液（0.9ml）于4℃下以14，000g离心5分钟并弃去上清。加入二甲基甲酰胺使体积准确达到10ml。加入0.25g  450-500微米玻璃珠并至少共涡旋振荡10分钟（中间定时放在ik上冷却）。4℃下以14000g离心沉淀所得细胞碎片和玻璃珠。除去0.5ml上清液并加入1.0ml二甲基甲酰胺。然后检测478nm吸光率。
按下述方法计算虾青素浓度：
假定1μg纯虾青素/L有A478＝176×10-6（1cm光程）
原来1.0ml细胞悬浮液的总虾青素浓度：
〔虾青素〕【μg／L】＝ (A478×稀释因数)/(b×176×10-6)
其中b＝光程长度（cm）（通常为1），
稀释因数＝ (1.5ml)/(0.5ml) × (1.0ml)/(0.9ml) ＝ 3/0.9 ＝3.33
然后按下列公式计算细胞虾青素浓度：
细胞的〔虾青素〕（μg/g）＝ (虾青素浓度（μg/L）)/(细胞浓度（g/L）)
实施例Ⅴ：虾青素测定
A.检测被处理培养液中细胞破裂的分光光度法
得自22份0.2ml被处理之培养液样品的细胞（每升培养液约100g细胞）加在平顶微量离心管（Hermle  Z  230M，National  Labnet  Co.，Woodbridge，N.J.）中，4℃下以14，000g离心5分钟，重新悬浮于1.0ml去离子的蒸馏水中并移入2.0ml锥形底聚丙烯微量离心管内。在聚丙烯管中以14，000g  4℃离心5分钟重新沉淀细胞并弃去上清。向管内各样品中加入丙酮，准确达到1.0ml体积。向一份样品中加入0.25g玻璃珠（450-500微米）并在Vortex，Jr混合器（Scientific  Products，Inc.）上将两管4℃下旋转振荡10分钟。以14，000g  4℃离心5分钟，沉淀玻璃珠和细胞碎片。除去0.5ml等分上清液并加至1.0ml丙酮中检测478nm吸光率。按下列公式计算细胞破碎比例：
(A478（无玻璃珠）)/(A478（玻璃珠）) ×100%
B.在Biolafitte中分批进料培养红发夫酵母
将红发夫酵母的新鲜培养物接种在发酵器中。最好以下述方法接种：由平皿上提取菌落并移入100ml摇瓶内保温72小时。然后将100ml摇瓶的内容物移入1000ml摇瓶中保温72小时。再将1000ml摇瓶内容物移入发酵器内。使用的摇瓶培养基包含0.6%酵母浸膏、0.6%麦芽汁、0.2%葡萄糖。发酵器初始容积为10升，PH＝5.2，温度20℃。
4天发酵期间的PH值控制在4.5和5.2之间（使用氨水和磷酸）、温度控制在19℃和21℃之间（使用冷水浴）、且百分溶解氧（DO）保持在50%和100%之间（必要时增加搅拌速度至最大1000rpm，空气流量最大增加至2体积/分钟）。
发酵的前100个小时要保持稍为正值葡萄糖含量（0.1%至0.3%）。发酵器内初始葡萄糖消耗之后，开始由50%葡萄糖进料池（1750葡萄糖+1750g H2O，灭菌）进料。一般最初进料速度要慢，此后逐渐加快。进料过程中用LC监测葡萄糖浓度。然后在限制葡萄糖的条件下发酵（测不到葡萄糖）。在加入1750g葡萄糖后的24小时，发酵液内即测不到葡萄糖。
注意：为控制泡沫形成，须每升工作体积加入3-4滴MaZu  DF  37C消泡剂。

Claims (21)

1、稳定的红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)融合细胞株，当在摇瓶中于适当条件下培养时，该菌株产生约1430μg/g至1660μg/g虾青素，约2350μg/g至2950μg/g总类胡萝卜素，且基于干重提供至少24%的收率，同时基于5天摇瓶培养物测定，产率为大约4500μg/L至8600μg/L，其中菌株被培养在利于该菌株达到差不多最佳生长的适当条件下。
2、根据权利要求1的菌株，其中该菌株基于5天摇瓶测定提供约7600μg/L至8600μg/L的产率，其中该菌株被培养在利于其达到差不多最佳生长的适当条件下。
3、根据权利要求1的菌株，其中该菌株的百分收率为大约25%至28%。
4、保藏在NRRL登记号为Y-18730的红发夫酵母菌株。
5、保藏在NRRL登记号为Y-18731的红发夫酵母菌株。
6、保藏在NRRL登记号为Y-18732的红发夫酵母菌株。
7、保藏在NRRL登记号为Y-18733的红发夫酵母菌株。
8、保藏在NRRL登记号为Y-18734的红发夫酵母菌株。
9、生产适用于细胞融合之红发夫酵母原生质球状体的方法，其包括在适当条件下使带有细胞壁的活红发夫酵母细胞与有效量的得自Trichoderma  harzianium的适当消化酶制剂接触，以利于除去所说的细胞壁并形成活的红发夫酵母球状体。
10、根据权利要求9的方法，其中消化酶制剂选自于Novo  Enzyme  SP-299-Mutanase和Novozyme  SP-234。
11、根据权利要求9的方法，其中红发夫酵母细胞在PH范围大约为PH4.5至5.0的条件下与适当的消化酶制剂接触。
12、根据权利要求9的方法，其中与消化酶制剂接触的红发夫酵母细胞至少达到了其生长周期的晚期对数生长期。
13、根据权利要求9的方法，其中红发夫酵母细胞与消化酶制剂接触约2小时。
14、融合红发夫酵母细胞的方法，其包括
a）使带有细胞壁的活的红发夫酵母细胞在适当条件下与得自harzianium木霉的适当消化酶制剂接触，以除去所说的细胞壁并形成活的红发夫酵母球状体;
b）以有利于一个或多个球状体融合的方式处理所说的球状体。
15、根据权利要求14的方法，其中消化酶制剂是Novo  Enzyme  SP-299-Mutanase和Novozyme  SP-234。
16、根据权利要求14的方法，其中红发夫酵母细胞在大约PH4.5至PH5.0的范围内与适当的消化酶制剂接触。
17、根据权利要求14的方法，其中与消化酶制剂接触的红发夫酵母细胞至少已达到了其生长周期的晚期对数生长期。
18、根据权利要求14的方法，其中红发夫酵母细胞与消化酶制剂接触约2小时。
19、根据权利要求14的方法，其中在等渗溶液中洗涤除去所说的细胞壁后所形成的活的红发夫酵母球状体，以除去其中所说的消化酶制剂，然后以一种有利于一个或多个球状体融合的方式处理所说的球状体。
20、根据权利要求14的方法，其中有利于融合的处理所说的球状体的方式是使所说的球状体与含有有效量聚乙二醇的等渗溶液接触10分钟至大约20分钟。
21、根据权利要求14的方法，其中有利于融合的方式是使所说的球状体与含有20%聚乙二醇的等渗溶液接触。
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