CN106086122A - 一种发酵制备链霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种发酵制备链霉素的方法，其包括如下步骤：步骤1）称取原料，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）发酵制备链霉素。本发明发酵方法使用的培养基各原料配伍合理，成本低廉，可完全取代市场常用培养基，而且链霉菌发酵效率也相应提高。

Description

一种发酵制备链霉素的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵制备链霉素的方法。

背景技术

链霉菌属（streptomyces)，其基内菌丝多分枝，一般横隔稀疏，很少断裂，常产生各种水溶性或脂溶性的色素；气生菌丝比基内菌丝稍粗，为外鞘所包，气生菌丝部分分化成直形、柔曲、钩环状至松敞或紧密螺旋形的孢子丝，时常含50个左右的孢子，短者含5～10个孢子；孢子为节孢子，由菌丝断裂而成，有的脱去外鞘，有的携带外鞘或残余，外鞘决定孢子的表面结构；DNA中的G+C克分子含量为69～76%。本属菌种数最多，分类鉴定比较困难，一般认为孢子丝的形状、孢子的表面结构、孢子的颜色和在有机培养基内是否产生类黑色素是最主要的分类指征。它们在土壤中分布极广，大多在人工培养基上生长茂盛，少数是植物致病菌。因许多种是抗生素的产生菌而且产生抗生素的种类最多而著名（如链霉素）。

链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素。属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。由于链霉素肌肉注射的疼痛反应比较小，适宜临床使用，只要应用对象选择得当，剂量又比较合适，大部分病人可以长期注射（一般2个月左右）。所以，应用数十年来它仍是抗结核治疗中的主要用药。

链霉菌发酵法制备获得链霉素是主要途径，但是培养基的成本制约着企业的发展，目前较多企业采用PDA培养基或酵母葡萄糖培养基，原料成本高，企业的利润大大降低。开发一种低成本的发酵制备链霉素的方法是我们需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术链霉菌发酵成本高的缺陷，提供了一种发酵制备链霉素的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种发酵制备链霉素的方法，其包括如下步骤：步骤1）称取原料，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）发酵制备链霉素。

具体地，所述方法包括如下步骤：

步骤1）称取原料：按照重量百分比取各原料备用：秸秆酶解物7%，马铃薯浸出汁5%，豆粕水解物3%，鱼骨粉水解液2%，葡萄糖2%，麦麸1%，玉米淀粉1%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.03%，氯化钠0.03%，其余为水；

步骤2）制备发酵培养基：将秸秆酶解物，马铃薯浸出汁，豆粕水解物，鱼骨粉水解液，葡萄糖，麦麸，玉米淀粉，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钠依次添加到水中，调pH7.1-7.5，灭菌，冷却即得；

步骤3）发酵制备链霉素：将灰色链霉菌种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中，32℃发酵96小时得到发酵液。。

所述秸秆酶解物按照如下工艺制备而得：

将水稻秸秆投入到粉碎机中进行粉碎得到秸秆粉，然后铺成1cm厚度的平层，然后紫外线照射15min，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡2小时，随后添加占秸秆粉0.5%重量份的纤维素酶，升温至50℃，保持50℃水解12小时，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即得。

所述马铃薯浸出汁按照如下工艺制备而得：

将马铃薯去皮，切成块状，然后添加到蒸馏水中，煮沸45min，自然冷却，然后用纱布过滤，收集滤液，即得；其中，块状马铃薯与蒸馏水的质量比为1:3。

所述豆粕水解物按照如下工艺制备而得：

将豆粕投入到反应器中，然后添加两倍重量的浓度为5M的盐酸，300rpm搅拌水解2小时，然后添加氨水，调节溶液的pH为7.1，即得。

所述鱼骨粉水解液按照如下工艺制备而得：

将鱼骨粉置于反应罐中, 加入5M的盐酸，在50℃温度下搅拌水解12小时，搅拌速度为200转/min，反应终止后用氨水中和残余盐酸，控制溶液的pH为7.1，即得。

本发明取得的有益效果主要包括几个方面：

本发明发酵工艺对农业废弃物秸秆进行了粉碎和酶解处理，使得氮、磷、钾、钙、镁以及纤维素多糖等得到有效利用；豆粕属于农业废弃物，其含有大量的蛋白质，脂肪，糖以及维生素等，但是菌株利用率较低，通过不同的生化处理后，提高了各养分的浸出率，菌株利用率大大提高；马铃薯浸出汁中含有菌体生长所需的碳源、氮源以及微量元素；对鱼骨粉进行了水解处理，提高了充足的氮源；提取工艺中采用酸碱中和方式，在平衡pH度的同时，增加了氯化铵氮源的供应量，一举两得；本发明发酵培养基组分采用废弃物物料，成本低廉，实现了变废为宝，提高了工业附加值，企业利润大大提高；本发明发酵工艺中使用的发酵培养基各原料配伍合理，成本低廉，可完全取代市场常用培养基，而且链霉菌发酵效率也相应提高。

具体实施方式

以下将采用具体的实施例来对本发明作进一步的解释，但是不应当看作是对本发明创新精神的限制。

实施例1

一种发酵制备链霉素的方法，其包括如下步骤：

称取原料：按照重量百分比取各原料备用：秸秆酶解物7%，马铃薯浸出汁5%，豆粕水解物3%，鱼骨粉水解液2%，葡萄糖2%，麦麸1%，玉米淀粉1%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.03%，氯化钠0.03%，其余为水；

制备发酵培养基：将秸秆酶解物，马铃薯浸出汁，豆粕水解物，鱼骨粉水解液，葡萄糖，麦麸，玉米淀粉，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钠依次添加到水中，调pH7.1-7.5，121℃保温20分钟灭菌，冷却至32℃，即得；

发酵制备链霉素：将灰色链霉菌 (中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号CICC11002)种子培养液（浓度为1×10⁹cfu/ml）2L接入装有15L发酵培养基的30L发酵罐中，400rpm，通气量2000 L/h，32℃发酵96小时；发酵过程控制：在48-96小时，补加葡萄糖，控制发酵液中葡萄糖的浓度不低于1%质量分数；在48-96小时，控制pH为7.1-7.2；96小时取样进行HPLC测定，链菌素的效价为907U/ml。

所述秸秆酶解物按照如下工艺制备而得：

将水稻秸秆投入到粉碎机中进行粉碎得到秸秆粉，然后铺成1cm厚度的平层，然后紫外线照射15min，紫外线强度为3000uW/cm²，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡2小时，随后添加占秸秆粉0.5%重量份的纤维素酶（酶活力为3000U/g），升温至50℃，保持50℃水解12小时，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状（含水量20%重量份），即得；

所述马铃薯浸出汁按照如下工艺制备而得：

将马铃薯去皮，切成块状，然后添加到蒸馏水中，煮沸45min，自然冷却，然后用纱布过滤，收集滤液，即得；其中，块状马铃薯与蒸馏水的质量比为1:3；

所述豆粕水解物按照如下工艺制备而得：

将豆粕投入到反应器中，然后添加两倍重量的浓度为5M的盐酸，300rpm搅拌水解2小时，然后添加氨水，调节溶液的pH为7.1，即得；

所述鱼骨粉水解液按照如下工艺制备而得：

将鱼骨粉置于反应罐中, 加入5M的盐酸，在50℃温度下搅拌水解12小时，搅拌速度为200转/min，反应终止后用氨水中和残余盐酸，控制溶液的pH为7.1，即得。

对照培养基：酵母膏8.0%，葡萄糖8.0%，玉米淀粉5.0%，磷酸二氢钾1%，硫酸镁0.05%，氯化钠 0.02%，其余为水；采用对照培养基进行发酵，工艺同上，96小时取样进行HPLC测定，链菌素的效价为687U/ml。

同时通过对发酵培养基进行原料成本核算，本发明仅为对照组成本的60%左右，节约了企业投入，提高了企业净收入。

实施例2

一种发酵制备链霉素的方法，其包括如下步骤：

称取原料：按照重量百分比取各原料备用：秸秆酶解物9%，马铃薯浸出汁7%，豆粕水解物5%，鱼骨粉水解液3%，葡萄糖3%，麦麸2%，玉米淀粉2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.05%，氯化钠0.05%，其余为水；

制备发酵培养基：将秸秆酶解物，马铃薯浸出汁，豆粕水解物，鱼骨粉水解液，葡萄糖，麦麸，玉米淀粉，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钠依次添加到水中，调pH7.1-7.5，121℃保温20分钟灭菌，冷却至32℃，即得；

发酵制备链霉素：将灰色链霉菌 (CGMCC No.1692)种子培养液（浓度为1×10⁹ cfu/ml）2L接入装有15L上述制备的发酵培养基的30L发酵罐中，400rpm，通气量2000 L/h，32℃发酵96小时；发酵过程控制：在48-96小时，补加葡萄糖，控制发酵液中葡萄糖的浓度不低于1%质量分数；在48-96小时，控制pH为7.1-7.2；96小时取样进行HPLC测定，链菌素的效价为1086U/ml。

所述秸秆酶解物按照如下工艺制备而得：

将水稻秸秆投入到粉碎机中进行粉碎得到秸秆粉，然后铺成1cm厚度的平层，然后紫外线照射15min，紫外线强度为3000uW/cm²，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡2小时，随后添加占秸秆粉0.5%重量份的纤维素酶（酶活力为3000U/g），升温至50℃，保持50℃水解12小时，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状（含水量20%重量份），即得；

所述马铃薯浸出汁按照如下工艺制备而得：

将马铃薯去皮，切成块状，然后添加到蒸馏水中，煮沸45min，自然冷却，然后用纱布过滤，收集滤液，即得；其中，块状马铃薯与蒸馏水的质量比为1:3；

所述豆粕水解物按照如下工艺制备而得：

将豆粕投入到反应器中，然后添加两倍重量的浓度为5M的盐酸，300rpm搅拌水解2小时，然后添加氨水，调节溶液的pH为7.1，即得；

所述鱼骨粉水解液按照如下工艺制备而得：

将鱼骨粉置于反应罐中, 加入5M的盐酸，在50℃温度下搅拌水解12小时，搅拌速度为200转/min，反应终止后用氨水中和残余盐酸，控制溶液的pH为7.1，即得。

对照培养基：黄豆饼粉8.0%，葡萄糖6.0%，玉米淀粉3.0%，硫酸铵3.0%，磷酸二氢钾0.8%，硫酸镁 0.05%，氯化钠 0.02%，其余为水；采用对照培养基进行发酵，工艺同上，96小时取样进行HPLC测定，链菌素的效价为712U/ml。

同时通过对发酵培养基进行原料成本核算，本发明仅为对照组成本的50%左右，节约了企业投入，提高了企业净收入。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种发酵制备链霉素的方法，其包括如下步骤：步骤1）称取原料，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）发酵制备链霉素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1）称取原料：按照重量百分比取各原料备用：秸秆酶解物7%，马铃薯浸出汁5%，豆粕水解物3%，鱼骨粉水解液2%，葡萄糖2%，麦麸1%，玉米淀粉1%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.03%，氯化钠0.03%，其余为水；

步骤2）制备发酵培养基：将秸秆酶解物，马铃薯浸出汁，豆粕水解物，鱼骨粉水解液，葡萄糖，麦麸，玉米淀粉，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钠依次添加到水中，调pH7.1-7.5，灭菌，冷却即得；

步骤3）发酵制备链霉素：将灰色链霉菌种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中，32℃发酵96小时得到发酵液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述秸秆酶解物按照如下工艺制备而得：

将水稻秸秆投入到粉碎机中进行粉碎得到秸秆粉，然后铺成1cm厚度的平层，然后紫外线照射15min，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡2小时，随后添加占秸秆粉0.5%重量份的纤维素酶，升温至50℃，保持50℃水解12小时，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即得。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述马铃薯浸出汁按照如下工艺制备而得：

将马铃薯去皮，切成块状，然后添加到蒸馏水中，煮沸45min，自然冷却，然后用纱布过滤，收集滤液，即得；其中，块状马铃薯与蒸馏水的质量比为1:3。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述豆粕水解物按照如下工艺制备而得：

将豆粕投入到反应器中，然后添加两倍重量的浓度为5M的盐酸，300rpm搅拌水解2小时，然后添加氨水，调节溶液的pH为7.1，即得。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述鱼骨粉水解液按照如下工艺制备而得：

将鱼骨粉置于反应罐中, 加入5M的盐酸，在50℃温度下搅拌水解12小时，搅拌速度为200转/min，反应终止后用氨水中和残余盐酸，控制溶液的pH为7.1，即得。