CN106047859A - 一种利用丝素蛋白对dna保存的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及DNA保存技术，尤其涉及一种利用丝素蛋白对DNA保存的方法及试剂盒；本发明的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，包括以下步骤：S1、将丝素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥处理得到丝素蛋白涂层基底；S2、将待保存的目标DNA制成DNA溶液，添加至丝素蛋白涂层基底中，然后干燥处理得到样本基底；S3、向样本基底中加入抽提液，抽提后得到目标DNA；本发明的利用丝素蛋白对DNA保存的试剂盒，包括丝素蛋白溶液、多孔基底以及抽提液；本发明的利用丝素蛋白对DNA保存的方法及试剂盒，可快速保存DNA样品，使其在高温以及紫外线照射条件下保持分子结构和功能的完整，并快速抽提DNA用于检测，解决了目前DNA产品的保存只能在低温及避光保存的难题。

Description

一种利用丝素蛋白对DNA保存的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及DNA保存技术，尤其涉及一种利用丝素蛋白对DNA保存的方法及试剂盒。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)是一种双链结构的分子，在生物细胞内，DNA可与蛋白质组成染色体，构成生物体遗传密码，指导生物体内蛋白质的合成以及生命体的运作。DNA被广泛应用于物种研究、身份鉴别、医学开发等领域。但DNA极易受紫外、温度、氧化剂、辐射等的破坏，使得DNA的保存和运输受到了很大的限制，进而导致有关DNA研究和应用上的不便。

为了避免功能损伤，核酸样品通常储存在-80℃冰箱或液氮里(-196℃)。比如生物学家通常用乙醇从生物样本中抽提DNA，溶解在碱性(pH8.5)缓冲液中并保存在低温下，这是由于碱性环境可以抑制酸性依赖的DNA降解过程。但是，低温保存DNA样品给长距离运输带来不便，并大大增加了运输和储藏的成本。据美国相关部门的统计，全美国每年大约有3亿份人类核酸样品需要储藏保存，光购买用于样品储存的冰箱就需要约1.2亿美元的成本，这还不算日常的场地和耗电费用。之前研究人员采用喷雾干燥、喷雾冷冻、冷冻干燥等方法处理DNA样品，用于常温下长时间运输和储藏DNA。虽然这些方法都达到了一定的效果，但很多研究同时指出对于长链DNA分子而言，处理过程中采用的高剪切力会对DNA的天然螺旋结构产生破坏，导致DNA功能损伤。

目前市面上现有的一些DNA存储产品，FTATM card是一种以纤维素为基质的滤纸，在这种纤维素基质滤纸上添加了可以使细胞裂解以及使蛋白质变性的化合物，通过这些化合物，该产品可以将细胞样品中的细胞裂解，使DNA溢出以便保存。经过FTATM card的保存，DNA可被长途运输以及室温下长时间保存。但是，将DNA从这种FTATM card中重新抽提出来的步骤比较麻烦，需要用到一种特殊的DNA抽提液才能将DNA从滤纸中抽提出来。Biomatrica公司所生产的SampleMatrix的主要作用成分则是能在极端环境中生存的节肢动物、虾等体内提取的物质，这些极端生物能够在干燥环境中存活长达120年之久，基于从这些生物中提取的物质的保护，SampleMatrix可以在高温以及紫外破坏条件下保存DNA。但是使用这种产品前，DNA需经过干燥处理，这不利于这种产品的大范围使用。GenVault公司所生产的GenTegra DNA保存产品则是一种内置抗氧化保护和抗菌成分的惰性化学基质。对于GenTegra和SampleMatrix这两种产品来说，DNA均需要存储在一种特质的试管中，并且这两种产品的主要作用成分均不易提取且价格昂贵，这两种产品每管存储DNA的量有限(30ug)。

丝素蛋白是从天然蚕丝纤维中提取出来的天然蛋白质，是由丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸等十八种氨基酸组成的。具有独特的理化性能及良好的生物相容性。丝素蛋白广泛应用于生物医疗、组织工程等领域。现已有人用丝素蛋白材料作为阿霉素、辣根过氧化氢酶、胰岛素等等药物的保存载体，但尚未有用丝素蛋白材料对核酸类物质进行保存的研究。丝素蛋白来源丰富，价格低廉，且丝素蛋白材料可被加工成多元化的材料以及具有可调控的二级结构，利用丝素蛋白材料保存DNA使得DNA在不同领域的应用具有了更广阔的可能性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种物料来源丰富、价格低廉、常温下即可实现、可快速保存DNA样品并使其在高温以及紫外线照射条件下保持分子结构和功能的完整性的利用丝素蛋白对DNA保存的方法及试剂盒。

本发明第一方面提供一种利用丝素蛋白对DNA保存的方法，包括以下步骤：

S1、将丝素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥处理得到丝素蛋白涂层基底；

S2、将待保存的目标DNA制成DNA溶液，添加至丝素蛋白涂层基底中，然后干燥处理得到样本基底；

S3、向样本基底中加入抽提液，抽提后得到目标DNA。

应当说明的是，本发明中所指的“目标DNA”，指的是从目的生物中提取出的欲进行保存的DNA样品。“DNA”又称去氧核糖核酸，是一种双链结构分子，由脱氧核糖核苷酸组成，其可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作。应当说明的是，本发明中的“DNA”应包括但不限于单链DNA、闭环DNA、连接DNA、双链DNA、互补DNA，其中，双链DNA为通俗意义中的真核生物的遗传物质，应当包括动物、植物、真菌等的染色体DNA，以及线粒体、叶绿体等细胞器中的DNA。

另外，单链DNA(single－stranded DNA)大部分DNA以双螺旋结构存在，但一经热或碱处理就会变为单链状态。某些噬菌体粒子内含有单链环状的DNA，这样的噬菌体DNA在细胞内增殖时则形成双链DNA。

闭环DNA(closed circular DNA)没有断口的双链环状DNA，亦称为超螺旋DNA。由于具有螺旋结构的双链各自闭合，结果使整个DNA分子进一步旋曲而形成三级结构。另外如果一条或二条链的不同部位上产生一个断口，就会成为无旋曲的开环DNA分子。从细胞中提取出来的质粒或病毒DNA都含有闭环和开环这二种分子。

连接DNA(Linker DNA)，为核小体中除147bp核心DNA外的所有DNA。

互补DNA(cDNA,complementary DNA)：构成基因的双链DNA分子用一条单链作为模板，转录产生与其序列互补的信使RNA分子，然后在反转录酶的作用下，以mRNA分子为模板，合成一条与mRNA序列互补的单链DNA，最后再以单链DNA为模板合成另一条与其互补的单链DNA，两条互补的单链DNA分子组成一个双链cDNA分子.因此，双链cDNA分子的序列同转录产生的mRNA分子的基因是相同的.所以一个cDNA分子就代表一个基因.但是cDNA仍不同于基因，因为基因在转录产生mRNA时，一些不编码的序列即内含子被删除了，保留的只是编码序列，即外显子.所以cDNA序列都比基因序列要短得多，因为cDNA中不包括基因的非编码序列---内含子。

应当说明的是，本发明所指的多孔基底，因具有较高比表面积，其作用在于，通过多孔结构，支撑和吸附丝素蛋白溶液中的有效成分以及DNA溶液中的有效成分，而加入抽提液之后，又可实现纤维表面涂层的有效成分的快速分离。其种类应当包括但不限于多孔膜、多孔非织造网、多孔纤维、发泡件等。多孔基底可包含一种或多种聚合物材料或天然纤维。

所述聚合物材料可包括(但不限于)聚烯烃、聚(异戊二烯)、聚(丁二烯)、氟化聚合物、氯化聚合物、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚醚、聚(醚砜)、聚砜、聚苯醚、聚(乙酸乙烯酯)、乙酸乙烯酯的共聚物、聚磷腈、聚(乙烯基酯)、聚(乙烯基醚)、聚(乙烯醇)以及聚(碳酸酯)。

所述天然纤维包括植物纤维、动物纤维、人造纤维、无机纤维等。其中，植物纤维主要组成物质是纤维素，是由植物上种籽、果实、茎、叶等处获得的纤维；动物纤维主要组成物质是蛋白质，分为毛和腺分泌物两类；人造纤维为用纤维素、蛋白质等天然高分子物质为原料，经化学加工、纺丝、后处理而制得的纺织纤维；无机纤维是以矿物质为原料制成的纤维，如玻璃纤维、金属纤维等。

合适的多孔基底可能具有各种形状和大小，如膜状、纸张、发泡件等。

滤纸大多由棉质纤维组成，其表面有无数小孔可供液体粒子通过，而体积较大的固体粒子则不能通过，滤纸具有较好的固体粒子过滤、大分子吸附等功能，且生产成本较低、获取较为便捷。由于多孔基底所涉及的材质众多，而滤纸具有前述优势，本发明中所述的多孔基底优选为滤纸，作为较为适宜的实施方式，并在本发明后续内容中做进一步说明，其它材质的多孔基底不再赘述。然而应当说明的是，凡是能够实现上述功能的多孔基底，均应落入本发明的保护范围。

进一步的，所述步骤S2中的DNA溶液，与丝素蛋白溶液混合后再添加至丝素蛋白涂层基底中。

具体的，所述步骤S1和S2中的丝素蛋白溶液浓度范围为1-30％。应当说明的是，丝素蛋白溶液制备完成后，通常浓度为7-8％，经浓缩后可达30％，由于丝素蛋白溶液的浓度在较大范围内，均体现出对DNA的保护效果，因此本发明中所述丝素蛋白溶液浓度范围为1-30％。

具体的，所述丝素蛋白溶液的浓度范围为3-6％。

具体的，所述步骤S1中丝素蛋白溶液的浓度与步骤S2中丝素蛋白的浓度相等。

进一步的，所述步骤S2中的DNA溶液，与丝素蛋白溶液和TBE缓冲液混合后再添加至丝素蛋白涂层基底中。TBE是一种凝胶电泳缓冲液。它具有良好的导电性并且有利于DNA分子迁移。TBE是由EDTA、Tris以及硼酸所组成。实验表明TBE能够帮助丝素蛋白材料更好的保存DNA。

进一步的，所述步骤S1中将丝素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥处理之后，还包括甲醇、乙醇、丙醇或多元醇浸泡后干燥处理的步骤，以得到丝素蛋白涂层基底。多元醇是指分子中含有三个或三个以上羟基的醇类，醇类的作用在于，诱导丝素蛋白的无规卷曲(silk I)转变为β-折叠(silk II)，这种转变能够减少材料的溶解性并能增加降解时间和机械强度。由于甲醇的挥发性和蛋白变性能力较强，有利于浸泡后的干燥处理，在本发明后续实施例中，优选采用甲醇。

应当说明的是，本发明中所述的抽提液应包括浓盐法、阴离子去污剂发、苯酚抽提法、水抽提法中所采用的各种试剂，例如各种缓冲液，如Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等，凡是能够实现将DNA自多孔基底上抽提的抽提液，均应落入本发明的保护范围。由于本发明的目的在于保护已获取的DNA样品，步骤S3的抽提过程为二次抽提，其中杂质成分较少，本发明中优选的抽提液为超纯水、Tris-HCl缓冲液、或PBS缓冲液。

本发明第二方面提供一种利用丝素蛋白对DNA保存的试剂盒，包括丝素蛋白制剂和多孔基底，所述丝素蛋白制剂包括丝素蛋白冻干粉、丝素蛋白溶液中的一种或多种，所述多孔基底为不包含丝素蛋白的多孔基底、或经过添加丝素蛋白溶液后干燥处理制得的丝素蛋白涂层基底。

应当说明的是，本发明中所述的试剂盒，可以多种实现形式，1)丝素蛋白冻干粉+多孔基底，使用时将丝素蛋白冻干粉配制成丝素蛋白溶液，并将部分丝素蛋白溶液添加至多孔基底然后干燥处理以备用；2)丝素蛋白溶液+多孔基底，使用时，将部分丝素蛋白溶液添加至多孔基底然后干燥处理以备用；3)丝素蛋白溶液+丝素蛋白涂层基底，无需前期准备工作，直接使用即可。

进一步的，还包括甲醇、乙醇、丙醇或多元醇、或者所述多孔基底为经过添加丝素蛋白溶液后干燥处理并经甲醇、乙醇、丙醇或多元醇浸泡后干燥处理的丝素蛋白涂层基底。本发明中所述的试剂盒，可以在使用时自行添加甲醇等醇类后干燥处理，也可将丝素蛋白涂层基底经醇类浸泡后干燥处理后密封保存。

进一步的，还包括TBE缓冲液。

进一步的，所述丝素蛋白溶液浓度范围为1-30％。

具体的，所述丝素蛋白溶液的浓度范围为3-6％。

进一步的，所述多孔基底为滤纸。

进一步的，还包括抽提液。本发明中所述试剂盒中的抽提液，应包括浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法、水抽提法中所采用的各种试剂，例如各种缓冲液，如Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等，凡是能够实现将DNA自多孔基底上抽提的抽提液，均应落入本发明的保护范围。由于本发明的目的在于保护已获取的DNA样品，抽提液的作用在于将多孔基底中的DNA二次抽提出来，其中杂质成分较少。因此本发明中所述的试剂盒，可以不包含抽提液，使用时直接采用超纯水，也可包含非超纯水的其它抽提液，如Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，可快速保存DNA样品，使其在高温以及紫外线照射条件下保持分子结构和功能的完整，解决了目前DNA产品的保存只能在低温(-20℃以下)及避光保存的难题。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明第一实施例中丝素蛋白涂层滤纸对DNA保护效果的凝胶电泳图；

图2是本发明第一实施例中丝素蛋白涂层滤纸对DNA保护效果的相对灰度值结果图；

图3是本发明第一实施例中DNA溶液直接滴加在甲醇处理后的丝素蛋白涂层滤纸进行处理后的相对灰度值结果图；

图4是本发明第一实施例中DNA与丝素蛋白混合溶液滴加在甲醇处理后的丝素蛋白涂层滤纸进行处理后的凝胶电泳图；

图5是本发明第一实施例中DNA与丝素蛋白混合溶液滴加在甲醇处理后的丝素蛋白涂层滤纸进行处理后的相对灰度值结果图；

图6是本发明第一实施例中三种温度下加入TBE对DNA保存效果影响的凝胶电泳图；

图7是本发明第一实施例中室温下加入TBE对DNA保存效果影响的相对灰度值结果图；

图8是本发明第一实施例中37℃下加入TBE对DNA保存效果影响的相对灰度值结果图；

图9是本发明第一实施例中45℃下加入TBE对DNA保存效果影响的相对灰度值结果图；

图10是本发明第二实施例中不同温度和时间条件下丝素蛋白对DNA保存效果的凝胶电泳图；

图11是本发明第二实施例中室温在不同时间下丝素蛋白对DNA保存效果的相对灰度值对比结果图；

图12是本发明第二实施例中37℃在不同时间下丝素蛋白对DNA保存效果的相对灰度值对比结果图；

图13是本发明第二实施例中45℃在不同时间下丝素蛋白对DNA保存效果的相对灰度值对比结果图；

图14是本发明第二实施例中各样品经高温破坏后的PCR反应的凝胶电泳图；

图15是本发明第三实施例中三种滤纸样品紫外照射不同时间后的凝胶电泳图；

图16是本发明第三实施例中三种滤纸样品紫外照射不同时间后的相对灰度值对比结果图；

图17是本发明第三实施例中各样品经紫外破坏后的PCR反应的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

本发明一较佳实施例提供一种利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其所涉及的实验方法及实验对比结果具体如下：

1、实验方法

1)再生丝素蛋白溶液的制备

将30克家蚕生丝放入12L含有Na₂CO₃(2.12g/L)的沸水溶液中煮30分钟，期间需要不断搅拌以提高脱胶率。随后用去离子水搓洗煮好后的脱胶丝以去除残余丝胶。将洗好后的蚕丝蛋白纤维平铺于通风橱中通风干燥。取25克干燥过后的蚕丝纤维溶于100mL的LiBr溶液中(9.3M)，随后放入60℃烘箱中4小时，每小时用干净玻璃棒轻轻搅动溶液以确保蚕丝纤维完全溶解。取出溶解后的溶液装入分子截留量为3500的透析袋中用夹子夹紧，随后将透析袋放入不低于1:100比例的去离子水中透析36小时，去离子水每三小时换一次水。用高速离心机以9000r/min的条件离心透析后的溶液20分钟，重复一次离心过程后，获得较干净的丝素蛋白溶液。丝素蛋白溶液可置于4℃冰箱中保存。

丝素蛋白溶液的浓度可以利用蒸发称重法测定，具体操作如下：将干燥后的称量皿标号后称重为W₀(g)，加入1mL丝素蛋白溶液在称量皿中，用电子天平称重为W₁(g)，将称量皿放入60℃烘箱干燥6小时候后每隔20min称重一次直至称量皿重量不再改变时记录数据为W₂(g)，依据以下公式可得到丝素蛋白溶液的浓度。

浓度(％)＝[(W₂-W₀)/(W₁-W₀)]×100

2)DNA溶液的制备

本发明所用总DNA是从人成纤维细胞中提取而来，在提取DNA前，需要将成纤维细胞培养至三代以上以保证其细胞活力。细胞培养完成后需要用细胞计数器计算细胞数量，估算出5x10⁶个细胞。依据DNA提取试剂盒使用手册(e.Z.N.A Tissue DNA Kit，OMEGA,中国)，用200μLPBS缓冲液(4℃，pH＝7.4)对细胞进行吹打重悬，随后向细胞悬液中加入25μL的细胞裂解酶使细胞裂解，用移液枪将细胞悬液吹打数次后置于65℃水浴锅中孵育五分钟以使细胞完全裂解。随后向裂解后的混合液中加入220μL的BL缓冲液并斡旋均匀后放入70℃的水浴锅中孵育十分钟。待混合液冷却到室温后继续加入220μL无水乙醇并以最大的速度涡旋均匀，随后将混合液移至DNA收集柱中(收集柱已经与2mL收集管组合)。用8000rpm/min的速度对收集柱进行一分钟离心。离心完成后丢弃下层收集管，向收集柱中继续加入500μL洗脱缓冲液后以8000rpm/min离心一分钟。随后将收集柱转移到一个新的2mL离心管中并滴加700μL DNA清洗缓冲液后继续离心一分钟。重复这一过程后将收集柱转移到一个新的2mL离心管中，以12000xg/min的速度高速离心两分钟使得收集柱内的乙醇完全挥发。最后，在收集柱内加入100μL经过70℃预热后的DNA洗脱液，用10000xg/min的速度对收集柱进行离心，离心管中得到的溶液即为抽提出来的DNA，DNA溶液可放置于-20℃冰箱内保存。

3)从细胞中抽提DNA浓度以及质量的确定

从细胞中抽提出的DNA的浓度是由酶标仪(Synergy H1,BioTek,美国)。测取260nm和280nm的吸光度通过公式计算得来。DNA浓度主要由以下公式确定：c(ng/μL)＝A260×50×稀释倍数。根据A260/A280的比值可以得到抽提DNA的纯度，当比值为1.7-1.9时，可认为DNA的纯度在85％-95％范围内。DNA的质量主要是用基于目标基因(ZNF750)的PCR以及ZNF750基因测序两个手段进行评估。

4)丝素蛋白涂层滤纸的制作及抽提

首先将化学分析试纸(新星，杭州，中国)按照二十四孔板中孔径尺寸剪成大小一致的滤纸小圆片(直径14mm)后，分别将这些滤纸小圆片放入二十四孔细胞培养板中(Corning costar，中国)。将丝素蛋白溶液分别稀释成浓度为1％-30％(w/v)的工作浓度。为了制作丝素蛋白涂层滤纸，需将100μl 1-30％(w/v)丝素蛋白溶液加入在二十四孔板中的滤纸。随后将所有样品放入通风橱中通风干燥，待二十四孔板中滤纸干燥完全后每孔分别加入100μl超纯水并于常温下孵育5分钟，用镊子挤压二十四孔板中滤纸以抽提丝素蛋白溶液。根据同等条件下获得的丝素蛋白浓度标准曲线，用酶标仪对含丝素蛋白的抽提溶液进行浓度测定(280nm)。本发明中定义丝素蛋白抽提回收率为：

5)DNA从丝素蛋白涂层滤纸中的抽提

DNA分子将会通过两种方式嵌入丝素蛋白涂层滤纸：直接在丝素蛋白涂层滤纸中加入DNA以及将丝素蛋白涂层滤纸进行后处理后加入DNA。

方法一：直接在丝素蛋白涂层滤纸中加入DNA溶液。将丝素蛋白溶液用超纯水分别稀释成1、3、6％，用超纯水将从细胞中抽提出的DNA原始溶液稀释成96ng/μL。将40μL不同浓度(1％-6％)的丝素蛋白溶液与40μL DNA溶液混合均匀后，将混合液加入到对应的分别经不同浓度(1％-30％)丝素蛋白涂层的滤纸小圆片中。随后将二十四孔板放入通风橱中通风干燥，待二十四孔板中滤纸全部干燥完全后，每个样品加入80μL的超纯水对DNA进行抽提。此种方法简称为silk/DNA+filter。

方法二：用甲醇对经丝素蛋白涂层的滤纸进行后处理。向二十四孔板中的滤纸中每孔加入100μL的不同浓度丝素蛋白溶液(1％-30％)，随后将二十四孔板放入通风橱通风干燥，待滤纸全部干燥完全后，每个样品加入1mL甲醇浸泡两小时后，继续将二十四孔板放入通风橱通风干燥。将DNA溶液(96ng/μL，40μL)分别注入上述经过甲醇处理的丝素蛋白涂层滤纸中。继续将二十四孔板放入通风橱中干燥，待所有样品均干燥完全后，每个样品中加入80μL超纯水对DNA进行抽提，对抽提液进行后续凝胶电泳测试。本发明中简称此种方法为DNA+PT-filter。将DNA溶液(96ng/μL，40μL)分别与不同浓度(1％-30％)的丝素蛋白溶液(40μL)混合均匀，混合液分别注入经上述甲醇处理过的对应浓度丝素蛋白涂层滤纸中，待所有样品干燥后，每个样品加入80μL超纯水对样品中的DNA进行抽提。本发明中简称此种方法为silk/DNA+PT-filter。

6)利用TBE对DNA保存进行优化

TBE是一种凝胶电泳缓冲液。它具有良好的导电性并且有利于DNA分子迁移。TBE是由EDTA、Tris以及硼酸所组成。EDTA具有螯合镁离子的能力，能够在DNA凝胶电泳过程中抑制DNA酶的活性。Tris常用于配制生物缓冲液。将1xTris-borate-EDTA(TBE)(pH＝8.3),丝素蛋白溶液(3％或6％)和DNA溶液(96ng/μL)按照体积比1:1:1混合均匀。将120μL 3％silk/DNA/TBE混合液直接加入在滤纸中(简称为3％silk/DNA/TBE+filter)；将120μL 6％silk/DNA/TBE混合液加入在经甲醇处理过的6％丝素蛋白涂层滤纸中(简称为6％silk/DNA/TBE+PT-filter)。待所有样品制作完毕，将所有样品放入通风橱中通风干燥直至所有样品完全干燥。每个样品中加入80μL超纯水后孵育五分钟，用镊子对每个样品反复挤压抽提。收集每个样品的抽提液后进行后续实验。

7)凝胶电泳及基于凝胶电泳的定量分析

用电子天平称取0.8g的琼脂糖溶于100mL的0.5xTris-borate-EDTA(TBE)缓冲液中，将溶液至于微波炉中高火加热两分钟直至琼脂糖全部融化于TBE缓冲液中，向加热后的TBE缓冲液中加入10μL Gel RED(BIOTIUM)染色剂并摇晃均匀，将染色后的琼脂糖缓冲液缓缓倒入已经调水平并插入制胶梳的制胶板中静止1个小时待琼脂糖溶液完全凝固后拔出制胶梳，将制好的琼脂糖胶板放入电泳仪器中。为了避免实验过程中造成的人为误差，在每板跑胶时均设置了一个控制组DNA样品(96ng/μL，-80℃)。制胶完成后，每个胶孔上样量为5μL，所有样品在上样前应与DNA loading buffer染色液按体积比为1:5混合均匀。凝胶电泳时间为1.5小时，电压为100V。待凝胶电泳完成后，轻轻的取出琼脂糖胶板，将胶板置于暗室中放在245nm的紫外灯下进行拍照。得到凝胶电泳图片后，用Image J软件对照片进行处理，通过软件的处理，可以得到每个条带的灰度值，定义样品相对灰度值以及样品DNA抽提率如下：

2、实验对比结果

1)DNA从丝素蛋白滤纸中的抽提

将40μL DNA分别与40μL不同浓度的丝素蛋白溶液(1、3、6％)混合均匀后，将三种混合液分别滴加在二十四孔板中相对应浓度(1、3、6％)的丝素蛋白涂层滤纸中，将二十四孔板放置通风橱于室温下通风干燥。待所有滤纸样品均干燥完毕后，在每个样品中加入80μL超纯水并孵育5分钟，随后用镊子对这些滤纸样品进行挤压抽提。用凝胶电泳的方法对抽提液中的DNA进行质量以及半定量的分析评估。凝胶电泳结果如图1所示，条带1和2采用对照组标准DNA(96ng/μL)；条带3和4采用总DNA；条带5和6采用1％silk/DNA；条带7和8采用3％silk/DNA；条带9和10采用6％silk/DNA；其中，条带3、5、7、9的样品为经滤纸处理抽提后的样品凝胶电泳结果；条带4、6、8、10为溶液样品直接凝胶电泳结果。条带灰度值对比结果如图2所示，图中SF为silk简称，以下各实施例相同，相对灰度值的计算为经滤纸处理抽提后的样品灰度与溶液样品灰度的比值。从图1和图2可知，含有1、3、6％丝素蛋白的滤纸样品抽提液经凝胶电泳后可看到清晰无降解的条带，而不含丝素蛋白的DNA滤纸样品的条带则明显弱于含丝素蛋白的DNA滤纸样品。3％silk/DNA+filter和6％silk/DNA+filter样品抽提液的相对灰度值分别为0.9和0.7，显著高于(p<0.05)DNA+filter样品抽提率的灰度值。以上结果表明丝素蛋白能够在样品制备以及抽提步骤中对DNA分子有保护作用。

2)甲醇处理丝素蛋白涂层滤纸法保存DNA

甲醇处理丝素蛋白能够诱导丝素蛋白的无规卷曲(silk I)转变为β-折叠(silkII)，这种转变能够减少材料的溶解性并能增加降解时间和机械强度。本实施例分别将DNA和DNA/silk混合液滴加在经过甲醇处理过的丝素蛋白涂层滤纸中(用1毫升的甲醇浸泡1、3、6％丝素蛋白涂层滤纸2小时以诱导β-折叠的形成)，做进一步测试。

将DNA溶液(96ng/μl)不与丝素蛋白溶液混合，直接滴加在甲醇处理后的丝素蛋白涂层滤纸(1、3、6％丝素蛋白处理)中，相对灰度值如图3所示，可见随着处理滤纸的丝素蛋白浓度的提高，丝素蛋白对DNA的保护效果得到一定程度的提高，但是差异并不显著。

将DNA溶液(96ng/μl)与1、3、6％丝素蛋白溶液混合，分别滴加在相应浓度的经甲醇处理过的丝素蛋白涂层滤纸(1、3、6％丝素蛋白处理)中后，凝胶电泳结果和条带灰度值对比结果分别如图4和图5所示，图4中，条带1和2采用对照组标准DNA(96ng/μL)；条带3和4采用总DNA；条带5和6采用1％silk/DNA；条带7和8采用3％silk/DNA；条带9和10采用6％silk/DNA；其中，条带3、5、7、9的样品为经滤纸处理抽提后的样品凝胶电泳结果；条带4、6、8、10为溶液样品直接凝胶电泳结果。图5中，相对灰度值的计算为经滤纸处理抽提后的样品灰度与溶液样品灰度的比值。从图4和图5可知，3％silk/DNA+PT-filter和6％silk/DNA+PT-filter样品抽提液与DNA+filter样品抽提液相比具有明显更高的相对灰度值(0.8)。

比较图3和图5，将丝素蛋白与DNA的混合液加入到经甲醇处理过的丝素蛋白涂层滤纸中，相比于直接将DNA滴加到经甲醇处理的丝素蛋白涂层滤纸中，更加有利于DNA的保存。

基于以上抽提实验中，我们选择了以下两种滤纸样品制备方法来进行后续的稳定性研究：(1)3％silk/DNA+filter；(2)6％silk/DNA+PT-filter。

3)TBE对DNA保存的影响

本发明评估了在丝素蛋白/DNA混合液中加入TBE对DNA保存的影响。所有样品分别放置于不同温度中保存二十四小时后再进行检测。凝胶电泳结果如图6所示，其中，条带1和5采用标准样DNA(96ng/μL)，条带2和6为DNA+filter，条带3和7为3％silk/DNA+filter，条带4和8为6％silk/DNA+PT-filter，所有的滤纸样品均用1xTBE缓冲液进行抽提。在三种不同存储温度下，含有TBE的样品条带明显较不含TBE的样品条带更加清晰明亮。三种不同存储温度(室温、37℃、45℃)下条带灰度值对比结果分别如图7至9所示，例如，存储在45℃中的3％silk/DNA/TBE+filter样品的相对灰度值达到了0.7，而3％silk/DNA+filter仅仅只有0.1(p<0.05)。综合上述实验，TBE能够帮助丝素蛋白材料更好的保存DNA。

实施例二

本发明提供实施例一中利用丝素蛋白对DNA保存的方法，在不同温度下对DNA稳定性的影响结果，其所涉及的实验方法及实验对比结果具体如下：

1、实验方法

1)两种DNA丝素蛋白滤纸膜的制备

以实施例一中的方法分别制作3％silk/DNA+filter样品以及6％silk/DNA+PT-filter样品。待所有滤纸样品制作完毕后用真空封口机对所有样品进行真空封口。最后将各样品分别保存于室温、37℃、以及45℃中。

2)丝素蛋白DNA冻干粉的制备

取40μL DNA溶液分别与40μL浓度为0、3、6％的丝素蛋白溶液混合均匀，将三种溶液放入液氮中冷冻。待所有样品冷冻完成后，将样品放入冻干机中进行冻干。两天后，待所有样品冻干完成后，取出所有样品。

3)PCR反应

上游引物：5'-AATACTGTGCCTCCCAGGGTAT-3'(SEQ ID NO：1)；下游引物：5'-GTACTTACCAGAGGTGGGCAGTG-3'(SEQ ID NO：2)；每个反应包含以下体系：5μL10x PCRBuffer、1μL 10mM dNTPs、1U Taq酶、400nM上游引物、400nM下游引物、5μL模板DNA、ddH₂O。每个反应体系总体积为50μL。PCR反应主要如下表所示：

表1 PCR反应条件

4)切胶纯化以及基因测序

待PCR反应产物凝胶电泳完成后，在紫外灯下小心地用小刀将含有条带的凝胶切下之后放入2mL离心管中。根据切出的凝胶重量，向离心管中加入3倍体积的溶胶缓冲液。将离心管置于50℃水浴锅中孵育10分钟直至凝胶全部溶解。随后将离心管中的溶液转移至切胶纯化试剂盒提供的吸附柱中，用缓冲液反复冲洗吸附柱以去除杂质。待杂质去除完全之后用50μL洗脱液抽提DNA。将抽提纯化后的DNA送至测序公司测序检测(金维智，苏州)。待测序检测完毕后，用NCBI基因库比对测序结果与ZNF750基因。

2、实验对比结果

1)基于凝胶电泳分析的DNA稳定性分析

按照不同方法将DNA保持在丝素蛋白涂层滤纸中，在特定时间取出后每个样品加入80μL超纯水进行抽提，将抽提后的溶液进行凝胶电泳成像。如图10所示，图中条带1、4、7为DNA滤纸样品；条带2、5、8为3％silk/DNA+filter；条带3、6、9为6％silk/DNA+PT-filter，图11至图13为根据图10中各条带灰度计算出的不同温度下(室温、37℃、45℃)在不同时间(3天、10天、40天)的相对灰度值结果，由图10-13可知，不含丝素蛋白的DNA对照样在滤纸中降解迅速。在相同温度、相同时间条件下，6％silk/DNA+PT-filter组样品与3％silk/DNA+filter和对照组相比，具有更好的保存DNA的效果，例如，37℃时，6％silk/DNA+PT-filter组样品依然有清晰条带，其相对灰度值为0.4，明显高于3％silk/DNA+filter(0.3)和对照组(0.1)。

2)经丝素蛋白保存的DNA的PCR反应

Zinc finger protein 750(ZNF750)即锌指蛋白750基因，其通过抑制原始基因而诱导分化基因来控制上皮内稳态，该基因的突变可能引起癌症或是牛皮癣。本发明对ZNF750基因(531bp)PCR扩增反应以验证经丝素蛋白保存过的DNA的活性。

如图14所示，各条带采用的样品为：条带1为DNA ladder，条带2为存储于-80℃的控制组DNA(96ng/μL)；条带3为DNA+filter；条带4为3％Silk/DNA+filter，条带5为6％Silk/DNA+PT-filter，条带6为DNA冻干粉；条带7为3％Silk/DNA冻干粉，条带8为6％Silk/DNA冻干粉。所有滤纸样品及冻干粉样品均在45℃条件下保存二十四小时后进行抽提，抽提液进行ZNF750基因的PCR反应。由图可见，对照组DNA溶液在进行PCR扩增反应后在500bp左右可见清晰明亮的条带。但是在经过45℃高温作用二十四小时后，条带3的DNA滤纸样品条带亮度明显下降。条带4和5的含有丝素蛋白的3％silk/DNA+filter和6％Silk/DNA+PT-filter样品均在500bp处有清晰明亮条带，且条带强度明显高于DNA滤纸样品。同样的，将丝素蛋白DNA混合液进行冻干后所得到的PCR反应条带在500bp处也有清晰明亮的条带并且条带亮度均比DNA滤纸组样品条带高。基于以上结果，经由丝素蛋白保存的DNA在高温破坏后依然可以在PCR反应中当作模板DNA。

本发明将上述PCR产物所得到的DNA进行测序得到的测序结果与NCBI中ZNF750基因序列做比对可以得到基因一致性与差异结果。在溶液样品中，DNA样品以及3％silk/DNA样品的基因一致性达到了99％，这表明了图14中所获得的PCR产物正是ZNF750基因扩增产物。并且丝素蛋白的存在不会影响PCR过程以及基因测序。3％silk/DNA和6％silk/DNA+PT-filter滤纸样品在经过45℃高温破坏二十四小时后，仍然具有与ZNF750基因大于99％的一致性，这个结果表明了经由丝素蛋白保存的DNA即使是在高温下也能够较好的保存DNA使其能够作为PCR反应的模板。同时，三种冻干粉样品(DNA，3％Silk/DNA，6％Silk/DNA)作为对照，其结果表明均与ZNF750基因有99％的一致性。与经丝素蛋白滤纸保存的DNA相比，冻干虽然也能在一定程度上在高温环境下保存DNA，但经冻干保存的DNA质量并没有明显高于丝素蛋白滤纸法，且制作冻干粉需要用到特殊的设备(冻干机)，制备时间也相对较长。

表2 各方法对DNA保存效果的PCR检测结果表

实施例三

本发明提供实施例一中利用丝素蛋白对DNA保存的方法，在紫外光照射下对DNA稳定性的影响结果，其所涉及的实验方法及实验对比结果具体如下：

1、实验方法

本实施例所涉及到的实验方法，如再生丝素蛋白溶液的制备、DNA溶液的制备、凝胶电泳及基于凝胶电泳的定量分析、PCR反应、切胶纯化以及基因测序、以及丝素蛋白DNA冻干粉的制备，与实施例一和二相同，不再赘述。本实施例涉及两种DNA丝素蛋白滤纸膜的制备，其方法如下：

制作3％Silk/DNA+filter样品以及6％Silk/DNA+PT-filter样品。分别将DNA+Filter、3％Silk/DNA+filter和6％Silk/DNA+PT-filter样品放置于紫外灯(245nm)下分别照射1、2、10小时。

2、实验结果

1)基于凝胶电泳成像的DNA稳定性分析

将三种滤纸样品(DNA+filter，3％Silk/DNA+filter，6％Silk/DNA+PT-filter)放置于紫外灯(245nm)下分别照射1、2、10小时，待照射完毕后取出所有滤纸样品用超纯水对每个滤纸样品进行抽提。如图15所示，条带1、5、9为存储于-80℃的控制组DNA(96ng/μL)，条带2、6、10为DNA+filter，条带3、7、11为3％Silk/DNA+filter，条带4、8、12为6％Silk/DNA+PT-filter，由图可知，对照组DNA滤纸样品在紫外照射一小时后就已经完全降解，而3％Silk/DNA+filter和6％Silk/DNA+PT-filter即使是在两小时的紫外照射后依然有较清晰的条带。6％Silk/DNA+PT-filter在经过10小时的紫外照射后依然有一定的条带。如图16所示，根据凝胶电泳图所计算出的相对灰度值也说明了相同的趋势，6％Silk/DNA+PT-filter相比较3％Silk/DNA+filter和DNA滤纸样品在所有的时间点都有更加高的相对灰度值。因此，与高温条件下DNA的稳定性实验一致，丝素蛋白能够更好的在紫外破坏下保存DNA。

2)经丝素蛋白保存的DNA的PCR反应

所有样品经紫外照射两小时后加超纯水进行抽提，对抽提液进行ZNF750基因PCR扩增反应。如图17所示，条带1-8分别为DNA ladder、存储于-80℃的控制组DNA(96ng/μL)、DNA+filter、3％Silk/DNA+filter、6％Silk/DNA+PT-filter、DNA冻干粉、3％Silk/DNA冻干粉、以及6％Silk/DNA冻干粉。由图可知，控制组样品(未经紫外照射的DNA溶液)、6％Silk/DNA+PT-filter、DNA冻干粉、3％Silk/DNA冻干粉、6％Silk/DNA冻干粉在紫外破坏两小时后均能在500bp左右处出现清晰明亮的条带，3％Silk/DNA+filter在紫外破坏两小时后具有微弱的条带。这表明丝素蛋白以及冻干粉样品均能在紫外破坏下对DNA起到保护作用，经这些样品保存的DNA能够用于PCR反应。

将以上所有PCR扩增产物用胶纯化试剂盒进行纯化抽提后进行ZNF750基因测序。待得到所有样品的测序结果后与NCBI数据库进行比对可得到基因一致率(identity)与基因缺失数(gaps)。结果如表3所示，所有能从图17中看到清晰条带的样品的基因比对一致率均在99％以上，基因缺失数为1或2。研究表明丝素蛋白因其含有丰富的络氨酸而具有吸收紫外线的功能，能够在一定范围紫外破坏下保护DNA。

表3 紫外破坏下样品基因测序的一致性和基因缺失数

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、将丝素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥处理得到丝素蛋白涂层基底；

S2、将待保存的目标DNA制成DNA溶液，添加至丝素蛋白涂层基底中，然后干燥处理得到样本基底；

S3、向样本基底中加入抽提液，抽提后得到目标DNA。

2.根据权利要求1所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于：所述步骤S2中的DNA溶液，与丝素蛋白溶液混合后再添加至丝素蛋白涂层基底中。

3.根据权利要求2所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于：所述步骤S1和S2中的丝素蛋白溶液浓度范围为1-30％。

4.根据权利要求3所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于：所述丝素蛋白溶液的浓度范围为3-6％。

5.根据权利要求1所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于：所述步骤S2中的DNA溶液，与丝素蛋白溶液和TBE缓冲液混合后再添加至丝素蛋白涂层基底中。

6.根据权利要求1所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于：所述步骤S1中将丝素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥处理之后，还包括甲醇浸泡后干燥处理的步骤，以得到丝素蛋白涂层基底。

7.根据权利要求1所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于：所述抽提液为超纯水、Tris-HCl缓冲液、或PBS缓冲液。

8.一种利用丝素蛋白对DNA保存的试剂盒，其特征在于：包括丝素蛋白制剂和多孔基底，所述丝素蛋白制剂包括丝素蛋白冻干粉、丝素蛋白溶液中的一种或多种，所述多孔基底为不包含丝素蛋白的多孔基底、或经过添加丝素蛋白溶液后干燥处理制得的丝素蛋白涂层基底。

9.根据权利要求8所述的利用丝素蛋白对DNA保存的试剂盒，其特征在于：还包括甲醇、乙醇、丙醇或多元醇、或者所述多孔基底为经过添加丝素蛋白溶液后干燥处理并经甲醇、乙醇、丙醇或多元醇浸泡后干燥处理的丝素蛋白涂层基底。

10.根据权利要求8所述的利用丝素蛋白对DNA保存的试剂盒，其特征在于：还包括TBE缓冲液。