CN106008696A - 鸭rig-1多克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和如SEQ ID NO:3所示的多肽以及利用这些多肽制备鸭RIG‑1多克隆抗体的方法及所得多克隆抗体。本发明所得抗体可达到进行Western Blot检测和免疫组化检测的要求，可定性和定量检测鸭组织中的RIG‑1。

Description

鸭RIG-1多克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及鸭RIG-1多克隆抗体及其制备方法。

背景技术

天然免疫系统是动物抵御病原入侵的第一道防线，模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)是天然免疫系统的重要成分，在动物机体的抗病毒免疫反应中发挥重要作用。一系列模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)对病原体的识别启动了机体的抗病毒免疫机制。PRRs主要包括膜结合受体，如Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)，另一类是细胞内模式识别受体，包括核苷酸寡聚化域样受体(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)和维甲酸诱导基因I样受体(the retinoic acid inducible gene-I-like receptors，RLRs)。维甲酸诱导基因1(RIG-1)是RLRs家族的重要成员，属于胞内识别受体，能有效地识别逃避细胞膜上TLRs识别而入侵到细胞质中的病毒RNA，通过信号通路级联放大作用诱导细胞因子、趋化因子和干扰素(Interferon,IFN)等的产生。

从目前的研究来看，RIG-1可能是水禽类动物或鸽子能抵抗流感病毒的原因之一。然而，现有的相关研究还不多。虽然有少量研究发现在一些物种上的RIG-1对于禽流感病毒和法氏囊病病毒具有一些联系，但由于缺乏相应的对RIG-1天然蛋白的检测手段，阻碍了进一步的研究。

因此，寻求一种能够用于鸭组织RIG-1的定性和定量检测的多克隆抗体，对于研究鸭的抗病毒免疫系统及开发相应医药用产品而言显得极为迫切。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种分离的多肽，该多肽的序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一目的在于提供提供一种分离的多肽，该多肽的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的另一目的在于提供提供一种分离的多肽，该多肽的序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的另一目的在于提供编码上述任一多肽的多核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种制备鸭RIG-1多克隆抗体的方法，该方法包括使用上述任一种分离的多肽免疫哺乳动物。

如本发明的一个实施例所示，本发明所得的多克隆抗体可以用于Western Blot检测和免疫组化检测，可以用于后续更为深入的研究和相应产品的开发。

在一个具体实施例中，所述方法包括如下步骤：

(1)人工合成多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；

(2)纯化多肽；

(3)使用所得多肽免疫哺乳动物，并从哺乳动物中纯化抗体，得到所述多克隆抗体。

值得指出的是，本发明对于人合成所述多肽的方法并无特别的限制。本发明实施例中的合成方法仅仅提供其中的一种具体方法，本领域技术人员可以在本发明的基础上，对各步骤参数进行合理的调整。

本发明的另一个目的在于提供由上述方法制备得到的多克隆抗体。

本发明的有益效果：

本发明所得抗体可达到进行Western Blot检测和免疫组化检测的要求，可定性和定量检测鸭组织中的RIG-1。

附图说明

图1为血清Western Blot实验和Block验证实验结果图；

图2为兔血清RIG-1多克隆抗体纯化图；

图3为纯化抗体蛋的Western Blot检测结果；

图4为免疫组化实验结果，其中，(1)图A～D为1日龄法氏囊组织，B、D分别为A、C的阴性对照，A、B放大倍数为200，C、D放大倍数为400；(2)图E～H为4周龄法氏囊组织，F、H分别为E、G的阴性对照，E、F放大倍数为200，G、H放大倍数为400；(3)图I～J为4周龄脾脏组织，J、L分别为I、K的阴性对照，I、J放大倍数为200，K、L放大倍数为400。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的 一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明的实施除非另外说明，将使用本领域技术人员已知的化学、生物化学和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见，如《基础免疫学》(Fundamental Virology)，第二版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，Blackwell Scientific Publications)；T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》(Proteins：Structures and Molecular properties)(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)(Worth Publishers，Inc.最新版)；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：a Laboratory Manual)，第二版，1989；《酶学方法》(Methods in Engymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)。

实施例1

多肽的合成

设计并在体外合成3段多肽序列，分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:1所示。

具体步骤如下；

1、树脂的称取：将称取好的树脂放入反应柱里面，然后用DCM溶胀半个小时。DCM加的量为树脂高度的2～3倍，也就是把树脂充分溶胀完全。可以微量鼓气。

2、去保护：先把DCM抽干，然后用DMF洗涤3遍，去除DCM， 然后用20％六氢吡啶去保护，5+10即共两遍，第一遍5分钟，第二遍10分钟，中间用DMF洗涤一遍。

3、去保护后洗涤：用DMF洗涤6遍。

4、偶联：按照3倍量投氨基酸，如0.2mmol的树脂，我们投氨基酸的量为0.2mmol*3＝0.6mmol乘以其分子量就是要称取的质量。此外我们还要称取激活剂。

5、偶联时检测：用滴管取树脂(少许，约15粒左右，只要检测可以辨认即可)与小试管中，分别滴加2滴A液、2滴B液、2滴C液，放到加热3分钟。然后取出来看树脂是否透明，如溶液颜色深影响观察，可以倒掉溶液，加少许DMF洗净，再观察。若树脂检测透明，即可以偶联下一个氨基酸。若树脂不透明，延长反应时间，若还不透明，可以进行复投。一定要保证每一步都反应完全再偶联下一个氨基酸。

6、偶联后洗涤：偶联完毕后，DMF洗涤3遍。

7、以上是偶联一个氨基酸的步骤，接下来依稀依次类推，也就是重复第3步骤——第6步过程直到最后一个氨基酸偶联完毕。

8、最后一个氨基酸偶联好后，再去保护，去保护完后收缩，DMF洗涤3遍，DCM3遍，甲醇3遍，抽干肽树脂。

9、称取完成的干肽树脂，装入15ml或50ml的离心管中，加入裂解液(每克10倍ml)如：1g肽树脂加10ml的裂解液。反应2个小时，每10～15分钟摇荡一下，让其充分反应，可放入摇床中。温度最好控制再25℃左右。反应好后，抽滤，溶液倒入冰乙醚中沉淀， 然后离心，离心时要平衡。一般离心3～4遍。

10、抽干：把离心好后的肽先放通风橱中吹一会，然后放入真空干燥器中抽干。

11、取少量到样品管中，进行质谱检测，正确多肽进行HPLC纯化。

实施例2

将上述所得三条多肽分别免疫两只兔子，11周后分别收集每只兔子的血清进行ELISA检测，具体实验步骤如下：抗原先以1μg/mL的浓度包被，4℃包被过夜；然后加入1％BSA，37℃下孵育1小时；兔多抗血清分别以1：200，1：1000，1：5000，1：10000，1：20000，1：60000，1：240000等稀释度稀释，稀释后样品以50μL/孔加样，放在37℃下孵育1小时；然后用TBST以200μL/孔洗涤2遍后，加入HRP标记的羊抗兔二抗，稀释5000倍后使用；在37℃下孵育45分钟后，用TBST以200μLl/孔洗涤3遍；再以100μL/孔加入TMB显色液，静置5分钟；最后使用酶标仪测定OD450nm读书并记录数据。

通过ELISA检测各多肽免疫兔子产生可能目的蛋白的相对浓度，详细数据如表1所示。

表1

实施例3

Western Blot检测与Block验证

使用各兔子血清，应用Western Blot方法分别检测鸭法氏囊(F)、脾脏(P)组织中RIG-1蛋白，实验步骤如下：使用4％的浓缩胶和8％的分离胶，上样后先150V电压至样品跑平，然后调小电压到80V，以裂解液中的指示剂溴酚蓝跑出玻璃板的下沿时停止电泳；取出凝胶进行转膜，条件为75V、90min；然后将各血清用脱脂奶粉稀释200倍后，加入适量于膜上，室温孵育2小时；使用TBST洗涤5次，每次10分钟；加入适量稀释5000倍后的HRP标记羊抗兔二抗，放入室温孵育1小时；使用TBST洗涤5次，每次10分钟；最后膜于暗室 中化学发光检测试剂(ECL)反应3分钟后放入已经铺好保鲜膜的暗盒中，包好PVDF膜，暗室中用柯达X胶片曝光1分钟。

血清Block检测验证反映呈阳性的条带极为目的蛋白，具体步骤和Western Blot实验大体一致，只将加入一抗那一步改为：设置正常检测组与Block检测组，在正常检测组中加入1ml 5％脱脂奶粉与2μl血清；在Block检测组中加入950μl 5％脱脂奶粉，50μl该项目多肽(多肽浓度为1mg/mL)与2ul血清。此时不要马上加入膜，让多肽与血清先反应结合1小时，再加入膜反应1小时。

分离6只兔子血清，分别用第4周鸭子脾脏和法氏囊组织蛋白样品进行Western Blot实验，结果显示只有编号5427兔子的血清在脾脏组织蛋白中的阳性蛋白条带与预测RIG-1蛋白大小相近(106KD，http://web.expasy.org/protparam/)，具体结果如图1A显示。然后使用5427兔的血清在脾脏组织蛋白中进行Block实验，结果显示目的蛋白条带符合RIG-1目的蛋白大小；阴性对照(图1B左)中相对于阳性对照(图1B右)中的相同位置没有蛋白条带，说明目的条带不是假阳性。

实施例4

将制作好的亲和层析柱依次用20mL纯水和1×PBS(pH7.4)，流速70mL/h充分清洗；然后将纯化的血清10mL置于50mL离心管中，用孔径0.45μm，直径25mm微孔滤膜抽滤；将抽滤过的血清样品以40mL/h流速上样，重复一次；用20mL 1×PBS(pH7.4)以70mL/h的流速清洗柱子，清洗过程中调节仪器透光率(T档)示数为100， 10min后连接蛋白检测仪。调节蛋白检测仪吸光率(1A档)示数为0，此时打开电脑桌面的HD-A电脑采集器，并将满屏量程调到5，用甘氨酸溶液(pH 2.7，0.2M)以40mL/h的速度洗脱抗体，此时按下绿色的洗脱记录按钮开始洗脱，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体。并在抗体收集过程中以1M的碳酸氢钠及时调节抗体的pH值至7左右，并记录洗脱峰的最高峰值；抗体收集完后，调节pH值至7左右，并记录洗脱的抗体体积，之后用纯净水冲洗连接收集器的橡胶管；依次用20mL 1×PBS和纯水以70mL/h的速度清洗亲和层析柱，之后加入20％乙醇，封口，4℃冰箱保存。

如图2所示，抗体纯化峰图为单峰，表明纯化得到蛋白为单一抗体蛋白，纯度较高，符合要求。

实施例5

纯化抗体用于鸭多种组织中RIG-1天然蛋白的检测

1、ELISA检测纯化抗体蛋白，确定蛋白相对浓度

结果显示纯化抗体蛋白试剂中IgG浓度为0.36mg/mL，稀释比例为1：10000时，检测值为0.873，符合要求。

表3纯化抗体Elisa检测结果

2、纯化抗体蛋白分别用于法氏囊和脾脏组织蛋白样品的Western Blot实验验证

如图3所示使用纯化抗体蛋白，在第4周鸭脾脏和法氏囊组织蛋白样品中均有阳性目的条带，说明纯化抗体可以适用于Western Blot检测。

3、纯化抗体蛋白分别用于第1周和第4周的鸭法氏囊和第4周的脾脏蛋白样品的免疫组化实验验证，具体步骤如下：组织样品被包埋成石蜡块后被切成石蜡切片；石蜡切片完全烘干后进行脱蜡，然后放入0.3％过氧化氢甲醇溶液，室温避光孵育10分钟；将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；再将切片用EDTA缓冲液进行抗原修复，100℃20分钟；然后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次3分钟；切片稍甩干后，纯化蛋白抗体用1％BSA稀释50倍后滴加于切片，放在湿室内室温孵育1小时；切片稍甩干后再圈内滴加组化试剂盒内反应增强液，室温孵育10分钟；切片稍甩干后滴加组化试剂盒内酶标羊抗兔IgG聚合物覆盖组织，室温孵育30分钟；PBS洗涤3次，每次3分钟，切片稍甩干后滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色；苏木素复染4分钟左右，自来水洗，促蓝液促蓝1min，自来水冲洗；最后进行脱水，然后用中性树脂封片。

如图4所示，在第1日龄、4周龄法氏囊组织和第4周龄脾脏中，用纯化抗体可以检测到RIG-1表达，呈黄褐色，而在其对应的阴性对 照当中没有显示黄褐色，说明纯化抗体可以适用于免疫组化。

Claims (7)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO:3所示。

4.分离的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列编码权利要求1-3任一项所述的多肽。

5.一种制备鸭RIG-1多克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-3任一项所述分离的多肽免疫哺乳动物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)人工合成多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示；

(2)纯化多肽；

(3)使用所得多肽免疫哺乳动物，并从哺乳动物中纯化抗体，得到所述多克隆抗体。

7.根据权利要求5或6所述方法制备得到的多克隆抗体。