CN105998068A - Egfr小分子不可逆抑制剂和t细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

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CN105998068A CN201610338285.9A CN201610338285A CN105998068A CN 105998068 A CN105998068 A CN 105998068A CN 201610338285 A CN201610338285 A CN 201610338285A CN 105998068 A CN105998068 A CN 105998068A
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Abstract

本发明涉及上皮生长因子受体(EGFR)小分子不可逆抑制剂(E)‑N‑[4‑[4‑[(3‑氟苄氧基)‑3‑氯苯基]氨基]‑7‑乙氧基‑喹唑啉‑6‑基]‑3‑(吡咯烷‑2‑基)丙烯酰胺和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，降低了个体中肿瘤大小及抑制癌细胞生长或抑制转移癌发展。

Description

EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用
技术领域
本发明涉及上皮生长因子受体(EGFR)小分子不可逆抑制剂(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，降低了个体中肿瘤大小及抑制癌细胞生长或抑制转移癌发展。
背景技术
近年来，癌症已经成为严重影响人类健康的第一杀手，在我国每年因癌症死亡的病例高达211万例。而肿瘤细胞在用药过程中产生的耐药问题是肿瘤难以根治的重要原因之一；异常的蛋白激酶活性牵涉到众多癌症；因此，使用激酶抑制剂成为一个重要的治疗手段，其中，EGFR(epidermal growth factor receptor,EGFR)为靶点的小分子抑制剂的研制则是抗肿瘤的热点之一，表皮生长因子受体(EGFR)是一种受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)，具有催化活性并受到严密的调控；EGFR及其家族成员包括HER2,HER3和HER4在调控细胞增殖，生存和转移等活动中起到极其重要的作用；因EGFR，HER2过表达和/或突变而引起的信号传递系统异常，是许多上皮类型肿瘤恶变的共同特征；同时具有EGFR或HER2变化的癌症患者一般有着更加严重的病情和不良的预后。
在过去的几十年内，针对EGFR的小分子靶向制剂相当成功，发展了一系列的药物，如吉非替尼(gefitinib),厄洛替尼(erlotinib)等，然而有激活突变的EGFR的肿瘤患者，尤其是非小细胞肺癌患者在用药10-16个月后往往会产生耐药性，而导致此耐药性最重要的原因之一就是EGFR的790氨基酸产生突变(T790M)；因此研制针对此耐药性的小分子靶向制剂成为目前非小细胞肺癌靶向治疗的关键。
除了分子靶向治疗外，近些年来发展的抗肿瘤细胞免疫治疗是继传统手术、化疗、放疗之后又一新型的肿瘤治疗方法，抗肿瘤过继免疫细胞治疗已逐步在临床上应用并发挥着重要的作用；与传统化疗不同，抗肿瘤细胞免疫治疗对患者没有明显的毒副反应，且患者耐受性更好，生活质量的改善明显提高。
然而，这些方法虽然取得了良好的临床效果，但是由于每个个体之间存在着巨大的差异，且肿瘤也存在着巨大的异质性；因此现存的这些方法对许多癌症类型的治疗效果是有限的，因此亟需表现出临床益处的新的改进形式的治疗。
(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺是一种潜在的新型的针对上皮生长因子受体(EGFR)耐药性T790M突变的小分子靶向不可逆抑制剂；(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨 基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺已经表现出对抗多种实体肿瘤细胞系的显著体外活性以及小鼠中如非小细胞肺癌的异种移植的人细胞系显著体内活性；对其作用机制的初步探索提示其可以与EGFR形成共价键形式结合，并长期抑制EGFR活性。
由于癌症是目前人们普遍关注并具有高发病率及死亡率的疾病，为了获得安全且行之有效的疗法来给予患者，已经进行了并仍然正在进行一些努力，本发明要解决的问题是提供EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用。
发明内容
本发明针对以上的问题，提供涉及上皮生长因子受体(EGFR)小分子不可逆抑制剂(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，降低了个体中肿瘤大小及抑制癌细胞生长或抑制转移癌发展。
在抗肿瘤治疗中的应用，包括给予需要这样的治疗的患者治疗有效量的(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐和治疗有效量的抗原刺激后的T细胞。
增强抗原刺激后的T细胞在癌症治疗中的治疗功效的方法，包括给予有这样需要的患者治疗有效量的抗原刺激后的T细胞和治疗有效量的(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐。
其中(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其可接受的盐和T细胞构成同一组合物的部分，所述的T细胞来自于有这样需要的患者自身，患者经相应抗原刺激后，抽取患者外周血，分离外周血白细胞，并在符合GMP标准的细胞间内进行筛选培养。
其中(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐和T细胞提供为用于同时或不同时给药的分别的组合物，其中所述的T细胞来自于有这样需要的患者自身，并经过相应抗原刺激和体外培养扩增。
其中所述的T细胞来源于有这样需要的患者自身，相应抗原可以根据不同癌症类型而有所不同。
其中(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐和T细胞构成同一组合物，所述的T细胞选自有这样需要的患者自身，并经过相应抗原刺激和体外培养扩增。
其中与(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺联合的抗肿瘤治疗为经过相应抗原刺激的T细胞。
其中治疗的癌症主要选自肺癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、乳腺癌、头颈癌、前列腺癌等有EGFR异常表达或突变的上皮类型腺癌。
(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐在制备用于前述权利要求中任一项所述的药物在联合抗肿瘤用途中的应用。
用于前述权利要求中任一项所述的联合抗肿瘤中的(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐。
本发明证实，(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺增强肿瘤免疫细胞治疗方法的抗肿瘤活性，特别是来自肿瘤患者自身的经特定抗原刺激并经过严格体外筛选扩增的T细胞；因此可以将(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺与经特定抗原刺激并体外筛选扩增的T细胞成功地用于联合疗法以治疗特定的上皮细胞类癌症。
因此，本发明涉及利用联合疗法来治疗癌症的药物组合物、方法以及(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺在制备用于联合疗法的药物中的用途。
根据本发明的一方面，我们提供了基于(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐并且利用特定经过筛选扩增的T细胞用于治疗癌症的有效联合疗法。
在另一实施方案中，本发明包括治疗癌症的方法，该方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐，以及在给予(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺之前、期间或之后给予的治疗有效量的特定T细胞；这两种药物可以形成同一组合物的部分，或者用于同时或不同时给药的分别的组合物提供。
另一方面，本发明包括增加或增强特定抗原刺激的T细胞在癌症治疗中的治疗效果的方法，该方法包括给予需要该治疗的患者治疗有效量的(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐；在给予T细胞之前、期间或之后给予(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基) 丙烯酰胺。
另一方面，本发明包括(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐在制备用于在与T细胞治疗的联合疗法中治疗癌症的药物中的用途。
在另一方面，本发明包括在用于治疗癌症的联合疗法中使用的药物组合物，其包含(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可按受的盐和/或T细胞以及药学可按受的载体或赋形剂。
在一优选的方面，本发明涉及(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可按受的盐与T细胞的协同联合。
当将(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺与T细胞联合时，(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺极大地增强了T细胞的抗肿瘤活性；因此本发明提供基于(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可按受的盐与T细胞联合的癌症的有效治疗。
在另一方面，本发明涉及使用(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐与T细胞的协同联合；可以通过应用本文所述的方法学来获得这协同联合。
在本申请中，癌症表示包括肿瘤、瘤形成以及恶性组织或细胞所导致的任何恶性疾病，且这些恶性疾病必须具备有上皮生长因子受体(EGFR)异常表达或EGFR基因突变的基因特征。
本说明书中各处所用的术语“联合”表示包括在相同或不同时间给予患有癌症的患者在同一或分别的药物制剂中的所涉及的治疗剂；如果在不同时间给予治疗剂，则它们应当在时间上足够接近地进行给药以发生增强或协同谑浪笑傲。
另一方面，本发明(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可受的盐在用于通过使用(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐与T细胞联合疗法来有效的治疗癌症的药物的制备中的用途。
在另一方面，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括将治疗有效量的(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基) 丙烯酰胺或其药学可按受的盐与治疗有效量的T细胞联合给予需要这样的治疗的患者。
根据肿瘤类型和疾病的发展阶段，本发明的治疗方法的抗肿瘤效果包括但不限于抑制肿瘤生长、延缓肿瘤生长，肿瘤的消退、肿瘤的收缩、肿瘤大小和/或肿瘤标志物减少、停止治疗时肿瘤再生长时间的增加、疾病进展减缓以及预防转移；预期的是，当给予诸如人类患者的需要这样的治疗的患者本发明的治疗方法时，所述治疗方法会产生例如通过抗肿瘤效果的程度、应答率、疾病进展时间或存活率所测定的效果；特别是，本发明的治疗方法适用于人类患者，特别是对以前的化疗复发或难治愈的那些人类患者。
如上文所述，(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺是以EGFR为靶点的小分子不可逆抑制剂。
本文中术语(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺旨在涵盖任何药学可按受的盐、溶剂化物、水合物、前药或给予患者时能够提供(直接或间接)本文所述的化合物的任何其他化合物；可以通过本领域已知的方法进行所述盐、溶剂化物、水合物和前药的制备。
可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成药学可接受的盐，通常可以通过使游离酸或碱形式的这些化合物与化学计算量的合适碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备这样的盐；酸加成盐的实例包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、乙酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐等。碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、乙二胺盐、三乙醇胺盐、碱性氨基酸盐等。
优选的(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺的药物组合物或包含该化合物的药物组合物可以被胶囊化、片剂化或在乳状液或糖浆中制备，以方便的通过口服给药。
优选的是(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐与T细胞在癌症治疗中的联合，所述癌症选自肺癌、前列腺癌、胃癌、头颈癌、乳腺癌等具有EGFR异常表达或EGFR突变的腺癌。
优选的是(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐与T细胞免疫治疗在癌症治疗中的并且更特别的是选自肺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌等具有EGFR异常表达或EGFR突变的腺癌。
治疗上有效量最先可以通过确定IC50的细胞培养试验估计；然后在动物模 型中配制剂量，以获得包括在细胞培养中确定的IC50的循环血浆浓度范围；此类信息可以被用于更精确地确定在人中有用的初始剂量。
附图说明
图1是本发明中(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺化学式；
图2是本发明中免疫细胞采用抗原刺激前后的细胞亚群分析的结果对比图；
图3是本发明中EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞及两者联合对小鼠移植瘤的治疗效果对比图。
具体实施方式
下面的实施例用于阐述本发明，这些实施例不旨在以任何方式限制本发明的范围。
一、材料和方法：
(一)、试剂和小鼠：
A431细胞，H1975细胞，N87细胞，SW620细胞，DMSO，生物级，DMEM培养基；
RPMI－1640培养基，胎牛血清，MTT，双抗，胰蛋白酶及其他相关有机无机试剂；
选用六周龄雌BALB/c雌性小鼠，并培养于SPF条件下，12小时采光，12小时黑暗，恒温24℃；并遵照研究动物的正确和人道使用的规定指南操作执行；
(二)、实验方法：
细胞水平活性测定是测试化合物对癌细胞的生长抑制能力；所选用的细胞模型为人表皮癌细胞A431细胞，人非小细胞肺癌细胞H1975细胞系，人胃癌细胞N87细胞系及人结直肠癌细胞系SW620细胞系，其中A431细胞过表达野生型EGFR，H1975细胞表达突变型EGFR，N87过表达野生型HER2，而SW620不表达EGFR和HER2；抗增殖活性测定方法为MTT法，所得结果用半数抑制浓度(IC50)表示；
1、细胞复苏：37℃水浴预热事先无菌条件下配制的完全培养基及PBS。预先准备100mm细胞培养皿，加入完全培养基；冻存的细胞系37℃水浴下使其迅速融化，一般时间控制在2min内，若2min仍有少量未融化，可加入少量预热的培养基，轻轻吹打。将融化的细胞移入培养皿中，摇匀后，置于37℃，5％CO2、饱和湿度下培养；待细胞贴壁后更换新鲜完全培养基。
2、细胞系培养传代：A431细胞系贴壁培养于10ml DMEM完全培养基中，H1975，N87及SW620细胞系分别贴壁培养于含10ml RPMI1640完全培养基的 细胞培养皿中，于37℃，5％CO2、饱和湿度下培养；当细胞生长到约90％汇合度时，吸出旧的培养基，用灭菌磷酸缓冲液(PBS)清洗细胞，然后加1ml 0.25％胰蛋白酶，37℃作用约2-5min，倒置显微镜下观察消化情况；加入4ml完全培养基，用移液管将细胞吹打成单个细胞；按比例接种至新的细胞培养皿中，摇匀，置于CO2培养箱中37℃培养。
3、细胞冻存：当细胞长至90％汇合后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，消化后的细胞转入15ml离心管中，常温离心1200rpm，5min，弃上清，加入1ml冻存液，重悬细胞，将其移入冻存管中，做好标记，4℃平衡30min，-20℃放置2h，然后转入-80℃冰箱短期保存，随后再转入液氮罐中长期保存；
(三)、抗原刺激的T细胞培养：
人工抽取健康志愿者外周血，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心法获得外周血单个核细胞，用PBS洗涤两次，悬浮于RPMI1640完全培养基中，当日添加IFNr,CD3单抗、CD8单抗，IL2细胞刺激因子共培养三天后，随后添加针对四种肿瘤细胞相对应的抗原刺激物，并将细胞悬浮于Tvac T细胞筛选培养基中，再次培养14天，从而达到治疗量的细胞数量；细胞经处理前后采用流式细胞术对细胞亚群进行统计分析；
(四)、(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺对肿瘤细胞的杀伤活性(MTT实验)：
取长至90％汇合度的处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取部分细胞悬液用台盼蓝染料(Trypan Blue)染色，加入到红细胞计数仪中，于倒置显微镜下计数活细胞数目，然后用完全培养基将细胞数目调整到1X105个细胞/ml；于96孔细胞培养板中每孔加入3000个细胞，将培养板置于CO2培养箱中培养；第二天将培养基换成无酚红的完全培养基后，将梯度稀释后的药物，按每孔5ul加入到96孔板中，终浓度为1nM,10nM,100nM,1uM,10uM,100uM,每个浓度设定6个复孔,同时设置调零孔(培养基+MTT+DMSO)，阴性对照孔(细胞+培养基+MTT+相同浓度的DMSO)，继续培养48h后，每孔加入20ul的MTT储存液，继续于二氧化碳培养箱中培养4h，然后小心吸去孔内培养基，每孔加入150ul的DMSO，置摇床低速振荡10min后，酶标仪于OD490nm测定各孔吸光值；根据各孔OD值计算药物的IC50值，计算方法采用改良寇式法：IgIC50＝Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)；
其中，Xm为设计的最大浓度的对数值，I为最大剂量与相邻剂量比值的对数值，P为阳性反应率之各，Pm为最大阳性反应率，Pn为最小阳性反应率；
(五)、抗原刺激后的T细胞对肿瘤细胞体外杀伤活性实验：
乳酸脱氢酶(LDH)在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤率；
同上，取长至90％汇合度的处于对数生长期的细胞，收集细胞后将细胞调整至1X105/ml细胞，在96孔板中加入调整好的细胞悬液，每孔100ul，于铺板48小时后加入经抗原刺激后的不同效靶比的T细胞(10：1,20：1,40：1)，同时设置T细胞空白对照，每组3个复孔，效应细胞及靶细胞共培养24小时后加入CCK8溶液20ul每孔，37℃孵育2小时后，酶联免疫分析仪检测每孔的OD值，计算杀伤活性(杀伤率)，杀伤率(％)＝[1-(实验组OD值-单独T细胞OD值)/单独肿瘤细胞OD值]X100％；
(六)、(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺与经抗原刺激的T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性检测：
同上，接种四种肿瘤细胞，于铺板24小时加入不同浓度的(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺(20nM/L,40nM/L,60nM/L)，次日在经过不同浓度药物处理的细胞孔中加入不同靶比的经抗原刺激后的T细胞(10：1,20：1,40：1)，继续培养24小时后，加入CCK8溶液20ul/孔，37℃孵育2小时后，酶联免疫分析仪检测每孔的OD值，计算杀伤活性(杀伤率)，计算公式同上；
(七)、(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺、经抗原刺激的T细胞及两者联合对小鼠移植瘤的治疗效果：
于小鼠右侧前肢根部皮下注射处于对数期的H1975细胞，将小鼠随机分成生理盐水对照组、(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺治疗组，经抗原刺激的T细胞治疗组及联合治疗组。(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺以灌胃给药的方式，25mg/kg每日，经抗原刺激后的T细胞治疗组给予腹腔注射，1X107/只，每3天一次，给予6次的注射，联合治疗组先予(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺以灌胃给药的方式，25mg/kg每日，同时给予经抗原刺激后的T细胞腹腔内注射，注射剂量与周期同单独治疗组，对照组为生理盐水灌胃并腹腔注射，输入数量、时间、次数与联合治疗组相同；从治疗开始每3天测量一次各组裸鼠 的肿瘤体积大小；用游标卡尺测量瘤体最长径(a)与最短径(b)，计算肿瘤体积，并绘制生长曲线；肿瘤体积计算方式为V＝πab2/6。
如图2所示，免疫细胞采用抗原刺激前后的细胞亚群分析发现，处理后的免疫细胞尤其是杀伤性T细胞与NK细胞的数量显著增加。
(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺单独用药时对各种细胞的杀伤：
所合成的化合物在两种肿瘤细胞(人非小细胞肺癌细胞H1975和人表皮癌细胞A431)中进行体外抗肿瘤细胞增殖实验研究，并研究其对不表达EGFR和HER2的细胞系(SW620)的毒性；由表中数据显示，对不表达EGFR和HER2的细胞类型(人结直肠癌细胞系SW620)的毒性研究很好的显示化合物的半数抑制浓度(IC50)在1000nM以上，并不具有明显的细胞毒性作用。
对同时携带激活突变L858R和耐药突变T790M的人非小细胞肺癌细胞系H1975也表现出较强的抗增殖活性，其IC50达到34nM，而对携带野生型的EGFR的人表皮癌细胞系A431表现出中度的抑制活性，IC50为62nM。
同时化合物对高表达野生型HER2的人胃癌细胞系N87抑增殖活性，结果显示，所有合成的化合物均对野生型的HER2有明显的抑制效果，其IC50达到47nM；以上所有结果均表明，我们的化合物具有明显的抗肿瘤增殖活性，尤其是对含有EGFR耐药性突变T790M的肿瘤类型也具有明显的活性；对野生型的EGFR抑制活性较突变型的要低，且对不表达EGFR和HER2的细胞没有明显的抑肿瘤增殖活性，表明化合物具有明显的靶点选择性。
经抗原刺激后的T细胞对各种肿瘤细胞的杀伤活性：
经过相应抗原刺激后的T细胞表现出明显的细胞杀伤活性，一般对于细胞的杀伤作用细胞比例在20：1时表现出较好的活性。
联合治疗对H1975肿瘤细胞的杀伤活性：
对具有EGFR敏感性突变L858R和耐药性突变的H1975细胞株经过相应抗原刺激后的T细胞具有明显的杀伤活性，对于细胞的杀伤作用细胞比例在20：1时表现出较好的活性，而联合使用时，与表2结果对比发现，联合用药时，化合物对T细胞治疗具有明显的增强作用；其中当化合物浓度为40nM/L时表现出最好的杀伤效率。
联合治疗对A431肿瘤细胞的杀伤活性：
对具有EGFR高表达的A431细胞株经过相应抗原刺激后的T细胞具有明显的杀伤活性，对于细胞的杀伤作用细胞比例在20：1时表现出较好的活性，而联合使用时，与表2结果对比发现，联合用药时，化合物对T细胞治疗具有明显的增强作用；其中当化合物浓度为40nM/L时表现出最好的杀伤效率。
联合治疗对N87肿瘤细胞的杀伤活性：
对具有HER2高表达的N87细胞株经过相应抗原刺激后的T细胞具有明显的杀伤活性，对于细胞的杀伤作用细胞比例在20：1时表现出较好的活性，而联合使用时，与表2结果对比发现，联合用药时，化合物对T细胞治疗具有明显的增强作用；其中当化合物浓度为40nM/L时表现出最好的杀伤效率。
联合治疗对SW620肿瘤细胞的杀伤活性：
由于SW620不具有EGFR或HER2的表达与突变情况，化合物对SW620不具有抑制杀伤作用，因此，当联合用药时对T细胞治疗没有明显的增强杀伤的作用的。
(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺、经抗原刺激的T细胞及两者联合对小鼠移植瘤的治疗效果：
由图3结果所示，经抗原刺激后的T细胞治疗组、化合物治疗组及联合治疗组均能抑制肿瘤生长，联合治疗组抑制效果最为明显，与化合物组和T细胞治疗组相比，瘤重抑制率以及瘤体积的差异显著。

Claims (10)

1.EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，其特征在于，在抗肿瘤治疗中的应用，包括给予需要这样的治疗的患者治疗有效量的(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐和治疗有效量的抗原刺激后的T细胞。
2.EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，其特征在于，增强抗原刺激后的T细胞在癌症治疗中的治疗功效的方法，包括给予有这样需要的患者治疗有效量的抗原刺激后的T细胞和治疗有效量的(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐。
3.根据权利要求1或2所述的EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，其特征在于，其中(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其可接受的盐和T细胞构成同一组合物的部分，所述的T细胞来自于有这样需要的患者自身，患者经相应抗原刺激后，抽取患者外周血，分离外周血白细胞，并在符合GMP标准的细胞间内进行筛选培养。
4.根据权利要求1或2所述的EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，其特征在于，其中(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐和T细胞提供为用于同时或不同时给药的分别的组合物，其中所述的T细胞来自于有这样需要的患者自身，并经过相应抗原刺激和体外培养扩增。
5.根据权利要求1所述的EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，其中所述的T细胞来源于有这样需要的患者自身，相应抗原可以根据不同癌症类型而有所不同。
6.根据权利要求1所述的EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，其特征在于，其中(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐和T细胞构成同一组合物，所述的T细胞选自有这样需要的患者自身，并经过相应抗原刺激和体外培养扩增。
7.根据权利要求1、2、5及6所述的EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，其特征在于，其中与(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺联合的抗肿瘤治疗为经过相应抗原刺激的T细胞。
8.根据权利要求1、2、5及6所述的EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，其特征在于，其中治疗的癌症主要选自肺癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、乳腺癌、头颈癌、前列腺癌等有EGFR异常表达或突变的上皮类型腺癌。
9.根据权利要求1、2、5及6所述的EGFR小分子不可逆抑制剂和T细胞联合在抗肿瘤治疗中的应用，其特征在于，(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐在制备用于前述权利要求中任一项所述的药物在联合抗肿瘤用途中的应用。
10.用于前述权利要求中任一项所述的联合抗肿瘤中的(E)-N-[4-[4-[(3-氟苄氧基)-3-氯苯基]氨基]-7-乙氧基-喹唑啉-6-基]-3-(吡咯烷-2-基)丙烯酰胺或其药学可接受的盐。
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